生姜蛋白酶水解产物中二肽基肽酶-Ⅳ抑制肽的虚拟筛选及活性分析

根据生姜蛋白酶的水解特异性,从其水解物中虚拟筛选出高活性肽段,进行体外活性验证和体内吸收入血成分研究。利用Peptide Ranker和分子对接虚拟筛选出高活性肽段,建立体外酶促反应体系测定活性肽对二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-Ⅳ)的抑制活性(IC50),并且在此基础上,引入表面等离子体共振(SPR)技术深入研究DPP-Ⅳ与活性肽的相互作用,并开展大鼠灌胃实验研究活性肽在胃肠道消化系统中的稳定性。通过计算机模拟,虚拟筛选得到Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly(GPSGPXGPXGPXG)DPP-Ⅳ抑制肽。体外酶促实验表明GPSGPXGPXGPXG对DPP-Ⅳ具有较强的抑制作用,IC50为457.3μmol/L,SPR实验进一步表明二者之间具有快速结合和快速解离的动力学过程,但是大鼠体内实验提示,该多肽无法维持胃肠道稳定性,不是以原型形式被消化道吸收,而是部分以二肽和三肽的形式进入血液循环系统,包括Pro-Hyp、Gly-Pro-Hyp和Pro-Hyp-Gly等寡肽。该研究表明筛选得到的活性肽口服经消化道吸收后无法保持结构完整性,会被体内的肽酶水解,这为后续进行体内的药代动力学和药效学研究提供理论支撑。

生姜蛋白酶辅助金线鱼腐乳发酵工艺优化及理化性质研究

该试验以金线鱼鱼糜为原料,接种雅致放射性毛霉(Actinomucor elegans),辅助添加生姜蛋白酶制作金线鱼腐乳。采用单因素及响应面试验优化前发酵条件;在后发酵时期添加生姜蛋白酶(70 m L/500 g盐坯),检测后发酵时期腐乳理化指标的变化趋势,评价生姜蛋白酶效果。结果表明,前发酵过程中,金线鱼腐乳的氨基酸态氮含量逐渐上升,大分子蛋白降解为小分子多肽,最佳前发酵工艺为发酵时间78 h、发酵温度27℃、菌悬液接种量5.4%,优化得到的金线鱼腐乳毛坯的最大蛋白酶活为55.46 U/g。后发酵中添加了生姜蛋白酶的试验组的氨基酸态氮含量显著高于空白组,pH值比空白组稍低,可溶性固形物含量与空白组的变化规律相差无几,证明生姜蛋白酶酶解效果显著。

“温度对生姜蛋白酶活性的影响”实验教学设计与实施

以广东省一特色民间传统小吃“姜撞奶”的制作过程和原理为依据,引导学生利用豆浆与生姜汁进行冲撞,通过实验比较不同温度的凝乳效果,探究温度对生姜蛋白酶活性的影响。

生姜蛋白酶无机大分子杂化纳米花的制备与研究

为提高游离生姜蛋白酶的酶活力,文章利用生姜蛋白酶和无机金属盐离子通过组装的方法成功合成了一种具有多级花状结构的新型纳米材料。通过扫描电子显微镜确定了生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的组成和结构,并进一步优化了生姜蛋白酶无机大分子杂化纳米花的制备条件,研究了其酶学性质和使用稳定性,初步探索了纳米花酶活力与其形貌结构的关系。实验结果表明,以生姜蛋白酶为有机成分,磷酸铜为无机成分,制备的酶-无机杂化纳米花的形貌结构与酶浓度、Cu^(2+)浓度、pH、温度等因素密切相关,纳米花外表圆润、花瓣饱满、形状规整、粒径相似时,生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的酶活也更高。当酶浓度为0.5 mg/mL、CuSO_(4)浓度为0.8 mol/L、pH为6.0、温度为4℃时,酶活力最高,可达到10302.2 U/mg,是游离生姜蛋白酶的7000%,温度、酸碱稳定性较高,重复使用性较好。

生姜蛋白酶对啤酒的澄清效果

以莱芜黄姜为原料,用生姜汁及超滤法提取并冻干的生姜蛋白酶对啤酒进行澄清试验。结果表明,生姜蛋白酶能明显提高啤酒的澄清度,其最适加量为0.05mg/L,最佳预处理温度为60℃,姜汁不宜作为酶源直接用于啤酒澄清中。

生姜蛋白酶和生姜汁对猪肉嫩化效果的比较

本文研究了生姜蛋白酶及生姜汁对猪肉的嫩化效果 ,对其用量、pH值、预处理温度进行了测试对比。结果表明 :生姜蛋白酶及生姜汁对猪肉的嫩化效果十分显著 (P≤ 0 .0 1) ,生姜蛋白酶最佳用量为 0 .0 1% ,姜汁最佳用量 5 % ,最佳pH都为 7.0 ,最佳预处理温度生姜蛋白酶为 30℃ ,生姜汁为 4 0℃ ;并且生姜蛋白酶及生姜汁对猪肉的嫩化效果极为相似 ,可以证明 。

生姜蛋白酶超滤法提取工艺及其在食品工业中的应用

以莱芜黄姜为原料 ,研究超滤法提取生姜蛋白酶的工艺 ,并对该酶在猪肉嫩化、酒类澄清等方面的应用进行了研究。结果证明 ,超滤法比单宁法、乙醇法提取生姜蛋白酶更经济 ,产品质量更好 ,更具工业化生产价值。用超滤法提取的生姜蛋白酶对猪肉的嫩化效果十分显著 (P≤ 0 .0 5 ) ,对啤酒和红葡萄酒也具有很好的澄清效果。

生姜蛋白酶嫩化牛肉效果的研究

研究了生姜蛋白酶对牛肉的嫩化效果,对酶用量、pH、处理温度、处理时间进行了测试,并且进一步通过L9(34)正交实验选择出最佳嫩化工艺。结果表明:生姜蛋白酶对牛肉的嫩化效果十分显著,通过正交实验确定的生姜蛋白酶对牛肉嫩化的最佳工艺条件是:酶用量为0.06%,pH为7.0,处理温度为50℃,处理时间为2h。

生姜蛋白酶的研究进展及其在食品加工中的应用

综述了生姜蛋白酶的提取纯化及其蛋白质与酶学性质的研究进展,阐述了目前生姜蛋白酶在肉类嫩化、酒类澄清以及乳制品加工中的应用;提出了有待进一步研究的问题,并对其在食品中的应用前景进行了展望。

生姜蛋白酶的工业提取方法比较

以莱芜黄姜为原料,对生姜蛋白酶的提取方法乙醇法、单宁法、超滤法进行了比较.结果表明,超滤法所获得的生姜蛋白酶的活力、得率最高,其最适条件为:操作压力0.06 MPa,此时蛋白酶的得率为2.3％.

双水相法萃取生姜蛋白酶体系的建立

以生姜为原料,研究了采用双水相萃取技术分离提取生姜中生姜蛋白酶的提取条件,利用单因素试验与正交试验进行优化,优化得到的萃取方案为:PEG分子质量为4 000 u,PEG浓度为30%,选择盐种类为(NH4)2SO4,浓度为10%,体系pH为8.0。此双水相体系的生姜蛋白酶上相酶活力回收和纯化倍数都最高,分别可达393.77%和1.85。

生姜蛋白酶的分离、纯化及酶学性质研究

从生姜中分离得到具有凝乳活力的生姜蛋白酶,研究了其酶学性质和动力学特性。主要研究结果如下:采用超滤技术分离得到生姜蛋白酶粗酶液,在0~0.3 mol/L NaCl线性梯度下利用弱阴离子交换树脂将生姜蛋白酶分成具有相同分子质量的A和B两个组分。生姜蛋白酶A和B具有相似的酶学性质和水解k-酪蛋白的亲和性,表明生姜蛋白酶A和B可能是同工酶,可以合并在工业生产中使用。该研究为生姜蛋白酶的工业化应用及姜汁奶的开发提供了重要的理论基础。

生姜蛋白酶的凝乳作用及相关机理探讨

从生姜中分离得到具有凝乳活力的生姜蛋白酶,采用Urea SDS-PAGE、RP-HPLC和MALDI-TOF/MS等方法分析生姜蛋白酶对酪蛋白单体和脱脂乳中酪蛋白的水解作用。结果表明,生姜蛋白酶水解κ-酪蛋白生成的主要产物比较稳定,不会被进一步水解。温度高于60℃时生成κ-CN(f 1-90)和κ-CN(f 1-102)两个末端疏水性肽段,其次为κ-CN(f 1-121),温度较低时,还生成大量分子量高于κ-CN(f 1-121)的产物。在脱脂乳体系中,生姜蛋白酶水解脱脂乳的κ-酪蛋白,而对αS1-、αS2-和β-酪蛋白没有显著的水解作用。主要裂解κ-酪蛋白的Thr121-Ile122键,生成疏水性N末端肽段κ-CN(f 1-121)。这一结果表明生姜蛋白酶凝乳的主要机理是水解κ-酪蛋白Thr121-Ile122肽键,破坏了酪蛋白微粒的稳定性,促使酪蛋白形成凝胶。

生姜蛋白酶的大分子结合修饰

采用单甲氧基聚乙二醇(mPEG)和右旋糖苷对生姜蛋白酶进行大分子结合修饰。在酶液质量浓度为2.0mg/mL的硼酸缓冲液中,加入三聚氯氰活化的mPEG或高碘酸钠活化的右旋糖苷,于40℃修饰反应1h,对修饰剂与酶蛋白的质量比和pH值条件进行优化:mPEG与酶的质量比为17.5:1.0、pH9.0,mPEG修饰酶的修饰率为52.6%,相对酶活力(修饰酶活力/天然酶活力)为54.0%;右旋糖苷与酶的质量比为42:1、pH6.0,右旋糖苷修饰酶的修饰率为51.6%,其相对酶活力为原天然酶的3.3倍。两种修饰酶的热稳定性均比天然酶显著增强,且右旋糖苷修饰酶的热稳定性明显高于mPEG修饰酶。结果表明:右旋糖苷对生姜蛋白酶的修饰效果优于聚乙二醇,适用于酶蛋白的化学修饰与新型酶制剂的开发利用。

LS1型科研型超滤机制备生姜蛋白酶的研究

本文研究了利用LS1型科研型超滤机制备生姜蛋白酶 ,结果证明 :操作压力为0 06Mpa时 ,酶活力和膜通量最好 ,浓缩度为80%,生姜蛋白酶得率为2 3%;膜通量随操作温度、姜汁流速的提高而增加 ,随姜汁浓度、操作时间的增加而降低 ;超滤法比单宁法、乙醇法提取的生姜蛋白酶的酶活力和得率高 ,更具有工业化生产价值。

加工条件对生姜蛋白酶凝乳物化性质的影响

生姜中分离得到具有凝乳活力的生姜蛋白酶,研究了动态升温模式下制作生姜蛋白酶凝乳的工艺条件及其在冷藏过程中的物理化学变化。主要结果如下:在低pH下脱脂乳凝胶的三维网状结构具有较大的孔隙,酪蛋白基质的分布比较稀疏,副酪蛋白微粒间形成稠密的交叉连接,孔隙的尺寸较小。随着温度的升高,脱脂乳的微观结构逐渐形成紧缩的状态。脱脂乳凝胶在冷藏过程中凝胶强度、乳清析出和α-氨基氮含量没有显著变化,酪蛋白没有显著的水解,表明动态升温模式能够达到抑制生姜蛋白酶的蛋白水解活力,使凝胶产品在冷藏期间保持稳定。

生姜蛋白酶提取新工艺

以生姜为原料,研究了生姜蛋白酶的超滤法提取新工艺。结果表明:丙酮与浓汁体积比为1∶1时,生姜蛋白酶得率和纯度最高,其活力为17.3U/mL,比传统工艺高43%。溶解丙酮沉淀所用的缓冲液pH对沉淀中生姜蛋白酶活性的影响不大。

右旋糖苷对生姜蛋白酶的化学修饰及其酶学性质影响

以NaIO4活化的右旋糖苷为修饰剂,研究修饰反应条件对生姜蛋白酶化学修饰效果的影响与修饰前后酶学性质及构型构象的变化。结果表明:较佳修饰条件为温度42℃、pH6.0、酶与活化右旋糖苷质量比1:22、修饰时间3h。与修饰前天然生姜蛋白酶相比,修饰酶的相对酶活力提高了2.0倍,酶蛋白氨基修饰率为57.8%。以酪蛋白为底物时,修饰酶的最适温度、最适pH值和酶反应动力学参数Km值较天然生姜蛋白酶均有所降低,热稳定性明显增强;修饰酶的紫外光谱吸收峰向长波长方向偏移,构型构象发生了变化。

生姜蛋白酶的分离纯化

生姜蛋白酶能够特异地水解P2位置是脯氨酸(Pro)的肽和蛋白质,这种对Pro的特异性使生姜蛋白酶成为一种非常有前途的用于蛋白质测序和蛋白质中稳定结构域识别的工具酶。中国传统食品“姜撞奶”采用姜汁作为凝乳剂,其中的凝乳因子已被证明是生姜蛋白酶。生姜蛋白酶的凝乳性质使之有望成为奶酪生产中小牛皱胃酶的替代品。此外,生姜蛋白酶在工业上还有更广阔的应用前景。本研究针对生姜蛋白酶的特点,制订一套简便有效的纯化方案,为进一步的基础研究和应用研究提供合格的样品酶。经过实验确立了以下纯化方案:将生姜制成丙酮粉,然后用20倍(W/V)0.1mol/L,pH8.0的磷酸缓冲液提取;上清液加硫酸铵至40%饱和度,其间控制pH>7.0,离心弃去沉淀,上清液继续加硫酸铵至80%饱和度,离心,取沉淀;将沉淀先对0.1mol/L的氨水透析2h,然后对蒸馏水透析至无SO42-检出,最后对层析初始缓冲液进行延长透析至内外离子强度相等;上DEAE-纤维素DE-52柱;层析初始缓冲液为0.01mol/L,pH8.0Tris(含0.5mmol/LDTT,0.2mol/LNaCl),0.05～1mol/LNaCl梯度洗脱,柱1.55.0cm,流速0.75cm3/min,收集速度3ml/管,收集酶活峰,得到在SDS-PAGE上表现为一条带的样品C1和C2。

生姜蛋白酶提取及反胶束纯化工艺初步研究

本文研究了生姜中生姜蛋白酶的分布及贮藏中的活力变化 ,研究了从新鲜生姜中提取生姜粗蛋白酶及用AOT 异辛烷和CTAB庚烷 /辛醇反胶束萃取该酶的工艺和方法。实验结果指出 :在贮藏茎中生姜蛋白酶的活力为 2 .7μg/mL·min-1,在膨大茎中该酶活力为 0 .6 8μg/mL·min-1,而在幼嫩茎中活力最低 ,仅为0 .4 8μg/mL·min-1。新鲜生姜在 0℃下贮藏 2 4h即完全丧失活力 ,在室温下贮藏 3d后其活力损失达38 2 5 %。用 10倍 0 .2mol/L、pH =6 .0的磷酸缓冲液 (4℃ )三次提取生姜蛋白酶 ,其提取率分别为 6 4 .75 %、14 .2 8%和 5 .2 %。用 6 5 %饱和度的 (NH4) 2 SO4沉淀提取液中的生姜蛋白酶 ,再以 pH 6 .2、0 .1mol/L的柠檬酸缓冲液溶解 ,其比活力达到 4 .2 1(μgPro/ μgPro·min-1)。生姜蛋白酶的 pI =5 .4～ 5 .5 ,在pH 5 .4以上 ,用AOT 异辛烷反胶束不能萃取出生姜蛋白酶 ,但却可以萃取出 71.86 %的杂蛋白。用CTAB庚烷 /辛醇反胶束二次萃取AOT 异辛烷萃余液 ,其蛋白质萃取率为 6 0 .2 5 % ,萃取液中生姜蛋白酶理论比活力达到 4 9.77(μgPro/ μgPro·min-1)。