基于RNA-seq的生孢噬纤维菌新转录本预测及生物信息学分析

利用RNA-seq技术,对不同碳源条件下培养的生孢噬纤维菌CX11进行新转录本预测,实时荧光定量PCR结果表明测序数据可信度较高。共发掘新转录本1298个,其中371个新转录本在不同碳源比较组合中差异表达(p<0.05),差异转录本数目与碳源的复杂度成正相关。共有19个新转录本在滤纸和葡萄糖比较组合中的差异倍数超过8倍,且在其他比较组合中差异倍数明显降低,推测这些新转录本与滤纸的前期降解密切相关。GO功能分析显示437个新转录本获得注释,有机物代谢过程、碳水化合物衍生物结合、氧化还原酶活性、水解酶活性等功能显著富集,原位酶活测定结果表明水解酶活性富集合理可信。KEGG通路分析表明,共有296个新转录本富集到氨基酸生物合成、次级代谢产物生物合成、碳代谢、氧化磷酸化、ABC转运蛋白、群体感应等30条代谢通路中。

生孢噬纤维菌内切葡聚糖酶的异源表达及CBM6对其酶学性质的影响

内切葡聚糖酶是纤维素酶系的重要组分之一,但大部分内切葡聚糖酶酸碱耐受性较差。为挖掘新型内切葡聚糖酶,本研究从生孢噬纤维菌CX11基因组中克隆了一个内切葡聚糖酶基因Sm_1350。该基因大小为2 196 bp,编码732个氨基酸,编码蛋白包含一个分泌信号肽、GH5催化结构域、6家族碳水化合物结合模块(CBM6)和一个C末端结构域(CTD)。利用实时荧光定量PCR技术对Sm_1350在不同碳源条件下的相对表达水平进行了分析,结果表明,Sm_1350在纤维二糖和滤纸培养基中的表达水平均显著高于在葡萄糖培养基中的表达水平,推测其在CX11降解纤维素过程中发挥一定作用。本研究构建了Sm_1350及其3种截短突变体,分别为Sm_1350、Sm_1350-GH5-CBM6、Sm_1350-GH5和Sm_1350-CBM6,并在大肠杆菌中进行异源表达。结果表明,去除CTD结构域明显提高了目的蛋白的可溶性表达水平。以CMC为底物时,Sm_1350-GH5-CBM6与Sm_1350-GH5酶活力分别为(7 000.00±50.00)U/g和(2 542.73±35.03)U/g,表明去除CBM6降低了Sm_1350-GH5对可溶性多糖的水解能力。酶学性质分析结果显示,Sm_1350-GH5-CBM6与Sm_1350-GH5均有较好的pH稳定性,去除CBM6结构域只改变了Sm_1350-GH5的最适温度,对最适pH以及温度稳定性没有产生影响。此外,Sm_1350-CBM6具有较强的几丁质结合能力,在蛋白纯化方面具有良好的应用前景。

生孢噬纤维菌的一个新菌株

以滤纸纤维素为唯一碳源 ,从土壤中分离筛选出一株好氧性纤维素降解细菌 ,通过对其形态学及生理生化特性的研究 ,该菌株被鉴定为生孢噬纤维菌 (Sporocytophaga)

来源于生孢噬纤维菌的新型β-葡萄糖苷酶SmBgl3A的性质研究

通过表达水平分析比较,从生孢噬纤维菌Sporocytophaga sp.CX11基因组中筛选出在菌株降解纤维二糖过程中起关键作用的β-葡萄糖苷酶基因Sm Bgl3A。该基因含有2283 bp碱基对,编码760个氨基酸,其编码蛋白质与来源于Bacteroides ovatus的β-葡萄糖苷酶Bo GH3B同源性为46.76%。将该基因在大肠杆菌中进行异源表达,粗酶液经Ni-NTA亲和层析一步纯化得到电泳级纯度的酶蛋白Sm Bgl3A,重组蛋白质相对分子质量与理论值(8.12×10^(4))一致。酶学性质表征结果表明,Sm Bgl3A最适温度和p H分别为35℃和6.5;p H在5.0~7.0、温度在40℃以下时,稳定性较好,同时有着较好的Na Cl耐受性。Sm Bgl3A的最适底物为p NPG,以p NPG为底物时的比活力高达14.74 U/mg;K_(m)值为10.88 mmol/L,k_(cat)值为46.72 s^(-1)。Sm Bgl3A作为一种新型的、酶学性质优良的β-葡萄糖苷酶,进一步扩展了β-葡萄糖苷酶的种类,为该酶在纤维素降解、食品工业等领域的应用奠定基础。

生孢噬纤维菌CMcase基因的分离与表达

从生孢噬纤维菌中分离完整的基因组DNA,经过PstI限制性内切酶部分酶切后,在T4DNA连接酶作用下,将酶切的片段连接到载体pUC18的PstI位点中,然后转化到E.coli DH5α中,构建了基因组文库,经过筛选获得4.2x103个重组子。经过刚果红平板筛选获得了含有CMCase基因片段的重组子,在E.coli中进行表达,E.coli在37℃培养25~30h,培养液中CMCase活力达到22.8U/mL。

生孢噬纤维菌胞外多糖的研究

研究了Sporocytophaga myxococcoides M229的菌体生长及CMC酶活与产SM多糖的关系,以及碳源、有机酸对产糖的影响,并就SM多糖的pH稳定性、抗盐性、温度稳定性等与黄原胶作了比较。结果表明,SM多糖的性能与黄原胶相似。

生孢噬纤维菌SM多糖的提取及对草鱼的毒性测定

采用乙醇沉淀法提取SM多糖,并用苯酚-硫酸法进行了多糖含量的测定,通过对草鱼的急性毒性实验,结果表明:生孢噬纤维菌胞外粗多糖对草鱼的毒性很低,当浓度为3.2mg/mL时,对草鱼的致死率只有10%,而当浓度等于或低于1.6mg/mL时对草鱼无毒性。

生孢噬纤维菌荚膜多糖的分离纯化及其性质

生孢噬纤维菌(Sporocytophaga)是能降解纤维素的滑动细菌,它可将滤纸和棉花纤维素完全降解.本文对生孢噬纤维菌产生的荚膜多糖的分离纯化以及性质进行了研究.以滤纸平板法培养生孢噬纤维菌,加入1%苯酚后,荚膜多糖溶解在水相中,再经氯化十六烷基吡啶(CPC)沉淀,分离出荚膜多糖提取物.利用Sephadex G-75柱层析法、胰蛋白酶和Sevag法对荚膜多糖提取物进行纯化;并利用比旋光度检查、红外光谱、液相色谱以及气相色谱等分析手段对精制后的荚膜多糖进行分析.结果表明,分离纯化得到了纯度较高的生孢噬纤维菌荚膜多糖.Sephadex G-75柱层析分析表明,荚膜多糖提取物中含有结合蛋白,除去结合蛋白后,多糖分子量约为6.5×103;气相色谱分析表明,该荚膜多糖主要由Gal、Glc、GlcA以及Man等单糖组成,其比值约为3.513.33.61;同时该荚膜多糖的红外光谱显示,该多糖所含的甲基、亚甲基等基团的量比正常多糖多;红外光谱图中881cm-1处的峰位显示,该多糖含有不典型β糖苷键特征吸收峰.

生孢噬纤维菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌混合发酵稻草特性的研究

稻草秸秆是一种重要的生物资源,但其粗纤维含量高、粗蛋白质含量低、营养价值低,在饲料中的应用受到限制。本文以稻草秸秆为主要材料,采用生孢噬纤维菌、枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母对稻草秸秆进行发酵,通过L9(3)3正交试验对3种菌混合发酵的优化组合进行研究,确定3种菌最佳接种量及发酵组合为:生孢噬纤维菌加入量为2%,枯草牙孢杆菌加入量为1%,产朊假丝酵母加入量为3%。发酵产物中粗蛋白质和粗纤维含量分别达到16.88%和23.65%。

生孢噬纤维菌研究进展

纤维素是自然界中分布最广、数量最多的可再生资源,随着化石燃料的日益枯竭及环境污染问题的凸显,天然纤维素的开发引起了科学家的广泛关注。天然纤维素如何转化为可供人们利用的能源成为困扰人们的一个新的课题。生孢噬纤维菌是一类能够高效降解纤维素的细菌,但其与霉菌的纤维素降解过程相比,具有很低的酶活。生孢噬纤维菌高效降解纤维素,同时生产其它有益成分的分子机制仍没有被解析清楚。本文介绍了生孢噬纤维菌在降解特点、纤维素酶及多糖生产等领域的研究进展。讨论了生孢噬纤维菌对食品工业、环境工程等领域发展的意义,并对生孢噬纤维菌在今后科研领域的应用进行了探讨。

生孢噬纤维菌纤维素酶关键氨基酸饱和突变及性质

Sm_2974是来源于生孢噬纤维菌(Sporocytophaga myxococcoides)的一个双功能纤维素酶,具有较高的催化效率。以Sm_2974为模板,将第205位色氨酸残基进行饱和突变后,所有突变体的CMC酶活和pNPC酶活均有不同程度的降低,而色氨酸向酪氨酸的突变使Sm_2974的pNPC酶活完全丧失。突变为天冬氨酸使Sm_2974对滤纸纤维素的水解能力增加,而突变为苏氨酸和谷氨酰胺则使Sm_2974与滤纸底物的结合能力降低,进而影响了酶催化效率。结果表明,第205位色氨酸残基对Sm_2974的底物结合能力及纤维素水解能力均有重要影响,可能是酶活性中心的关键氨基酸残基。

生孢噬纤维菌β-葡萄糖苷酶的异源表达与酶学性质表征

β-葡萄糖苷酶是木质纤维素生物降解途径的关键酶,广泛应用于纤维素酶制剂中以提高底物的转化效率。为了挖掘和开发新型β-葡萄糖苷酶,从生孢噬纤维菌CX11基因组中克隆了4个β-葡萄糖苷酶基因Sm_0268、Sm_0864、Sm_3000和Sm_5379,并在大肠杆菌中进行异源表达。重组蛋白Sm_0268、Sm_0864、Sm_3000和Sm_5379分子质量分别为81.7、108.4、83.5和82.1 ku,酶活力分别为(24.2±0.4)U/g、(125.9±0.6)U/g、(32.4±0.6)U/g和(76.1±0.5)U/g。Sm_0268、Sm_3000和Sm_5379的最适反应温度为50℃,Sm_0864的最适反应温度为45℃。Sm_3000在温度达到60℃时仍能保留40%的活性,具有一定的高温催化能力。Sm_0268、Sm_0864和Sm_3000的最适反应pH为7.5,Sm_5379的最适反应pH为7.0,Sm_0864和Sm_3000具有一定的碱耐受性。利用实时荧光定量PCR对编码基因在不同碳源培养条件下的相对表达水平进行分析,结果表明,在以纤维二糖为唯一碳源培养菌株CX11时,4个β-葡萄糖苷酶基因的表达水平均上调,推测它们均不同程度参与CX11降解纤维素的过程。

噬纤维菌和生孢噬纤维菌作为饲用蛋白质的综合评价

探索噬纤维菌(Cytophaga)和生孢噬纤维菌(Sporocytophaga)作为单细胞蛋白的潜力,旨在开发非常规蛋白质饲料。通过大量收集哈氏噬纤维菌和生孢噬纤维菌的菌体,检测蛋白质和氨基酸含量,并采用胃蛋白酶-胰蛋白酶体外两步消化法测定菌体蛋白消化率。研究结果显示:哈氏噬纤维菌和生孢噬纤维菌的菌体蛋白质含量50%左右,必需氨基酸含量与酵母菌相当;用其发酵液喂养昆明小鼠30 d,没有表现出毒性;哈氏噬纤维菌菌体的消化率在90%以上,生孢噬纤维菌的消化率也在65%左右,均远远高于对照酵母菌,为最突出的特点。希望从高消化率方面为单细胞蛋白的开发打开新思路。

发酵凤眼莲的菌种筛选

[目的]通过菌种筛选探讨发酵凤眼莲的利用价值。[方法]将5种菌种分别置于PDA、PD、营养琼脂、牛肉汤固定培养基上进行菌种活化培养,继后通过单个菌种发酵试验和组合菌种平板拮抗试验对菌种进行筛选。[结果]根据5种菌种在凤眼莲固体培养基上的生长状况,选择生孢噬纤维菌、产朊假丝酵母和黑曲霉作为发酵菌种,其菌种组合发酵效果显著优于单一菌种发酵效果。采用3种菌组合在水分65%、pH值7.0和温度28℃的条件下发酵凤眼莲,产物的粗蛋白含量为47.33%,比所用培养基的粗蛋白含量提高173.74%,粗纤维降解率达77.06%,且有发酵香味,具有优质蛋白饲料的特性。[结论]筛选良好的组合菌种对凤眼莲进行发酵,能有效解决凤眼莲作为饲料存在的高水分、高纤维、低蛋白等问题。