一例足趾外伤后生孢梭菌感染报道并文献复习

生孢梭菌(Clostridium sporogenes)是一种革兰氏染色阳性厌氧菌,能够产生孢子,以周生鞭毛运动,细胞大小(0.3-0.4)μm×(1.4-6.6)μm,由Metchnikoff E。于1908年首次描述[1]。生孢梭菌能分解蛋白质和糖类,发酵葡萄糖和麦芽糖,产丁酸和少量乙酸等。

不同试验条件下生孢梭菌孢子生长预测方程的建立

应用响应曲面模型(RSM)方法研究不同温度、pH值、NaCl浓度对生孢梭菌孢子生长的影响.不同试验条件下生孢梭菌孢子的生长曲线应用Baranyi生长模型进行拟合,生长曲线参数生长率(GR)和迟滞期(LT)应用RSM方法建立生孢梭菌孢子的生长预测方程.从另外随机选择试验组合对建立的方程进行验证,并通过计算预测标准差(SEP)、平方根误差(RMSE)、准确性因子(Af)和偏差因子(Bf)对建立的生长预测方程进行数学检验.结果表明,温度、pH值和NaCl浓度对生孢梭菌孢子生长影响显著,应用RSM方法建立的生长预测方程能够较好的模拟生孢梭菌孢子在不同试验条件下的生长状况,对食品中蛋白水解型肉毒梭菌的生长和控制具有参考意义.

hIL-12及HER2/neu ECD修饰的生孢梭菌工程菌的构建及鉴定

目的构建人IL-12(hIL-12)基因和乳腺癌靶基因HER2/neu胞外区(ECD)分别修饰的生孢梭菌工程菌,探讨其在乳腺癌基因治疗中的作用。方法将hIL-12和HER2/neu ECD的基因分别连接到厌氧梭菌的内源性β-1,4-葡聚糖酶启动子和信号肽序列(eglAp)之后,得到融合基因eglAp-hIL-12和eglAp-HER2/neu。将融合基因插入大肠杆菌-厌氧菌穿梭质粒pIMP1,得到重组质粒pIMP1-ehIL-12和pIMP1-eHER2/neu。将重组质粒首先转化大肠杆菌DH5α,通过酶切和测序鉴定无误后,再用电穿孔法转化生孢梭菌;利用红霉素抗性筛选阳性克隆,采用菌液PCR和质粒提取鉴定阳性克隆,采用ELISA法对生孢梭菌培养上清中目的产物进行分析。结果酶切和测序结果表明重组质粒内的融合基因eglAp-hIL-12和eglAp-HER2/neu序列和读框正确,菌液PCR、质粒提取和ELISA结果显示hIL-12和HER2/neu ECD基因成功修饰生孢梭菌并表达。经过20多代抗生素压力筛选,重组生孢梭菌仍能稳定携带和表达外源基因。结论成功获得hIL-12和HER2/neu ECD基因分别修饰的生孢梭菌工程菌株,为进一步的抗肿瘤研究奠定基础。

生孢梭菌孢子作为生物指示剂的研究

用生孢梭菌孢子作为输液产品湿热灭菌工艺的生物指示剂 ,采用残存曲线法测定生孢梭菌孢子在 3种溶液中的耐热性 ,确定灭菌工艺的最小 F0 值 ,制订合理的灭菌工艺微生物学验证方案。

对生孢梭菌CFU计数培养基的验证试验

目的:对新研制的生孢梭菌 CFU 计数培养基的 CFU 计数效果的可重复性进行验证。方法:将生孢子梭状芽孢杆菌(简称生孢梭菌)复苏、增菌培养,培养物与标准比浊管比浊至相同浊度,然后10倍系列稀释至1×10^(-6),作为工作菌液。将工作菌液采用浇注法接种生孢梭菌 CFU 计数培养基,分别置厌氧条件及有氧条件35℃培养;将工作菌液采用涂抹法接种于营养琼脂培养基和厌氧菌琼脂培养基,置厌氧条件35℃培养,用未接种的培养基做空白对照。分别于18,24,48,72 h 进行 CFU·mL^(-1)计数、观察菌落形态。用同一工作菌液重复上述实验5次,分别计算不同培养基 CFU·mL^(-1)的平均值。将以上试验重复2次。结果:生孢梭菌 CFU 计数培养基的 CFU 计数结果明显优于营养琼脂培养基和厌氧琼脂培养基(P<0.01);厌氧条件培养明显优于有氧条件培养(P<0.01)。生孢梭菌以浇注法接种于 CFU 计数培养基,置厌氧条件35℃培养18 h,CFU·mL^(-1)计数最多,可能最接近最大活菌数,且菌落形态良好。结论:新研制的生孢梭菌 CFU 计数培养基可以认为是目前最适于生孢梭菌 CFU 计数的培养基,可以推荐作为生孢梭菌 CFU 计数培养基使用。

生孢梭菌芽孢萌发条件的优化

本文研究了不同温度、时间和p H值条件下,生孢梭菌芽孢萌发所需的最佳条件。本研究将活化传代好的生孢梭菌菌液培养7 d,多次离心后,加入无菌水制成生孢梭菌芽孢悬浮液,处理温度为70℃~90℃,处理时间为5~25 min,处理p H值为4~8,用平板计数法观察计算不同条件处理后的芽孢萌发率,用响应面优化法对影响生孢梭菌芽孢萌发率三个条件的最佳值进行了研究。通过分析所建立的二次多项回归方程,得到生孢梭菌芽孢萌发的最佳条件为,当温度为80.90℃,时间为20.72 min,p H值为4.69时,生孢梭菌芽孢萌发率最高可以达到80%。本文试验结合芽孢萌发机理,利用芽孢的最佳萌发条件,用较温和的条件使芽孢萌发,为使芽孢"先萌发,再杀灭"的新杀菌方式奠定基础,为杀灭芽孢这一难题提供了新思路和低强度杀菌的可行性,对将其应用于低酸性罐头食品的杀菌有重要意义。

生孢梭菌孢子作为生物指示剂用于残存概率灭菌工艺验证的可行性

测定并分析生孢梭菌孢子在不同介质及不同温度下的耐热参数 ,评价生孢梭菌孢子的耐热特性及其作为生物指示剂在残存概率湿热灭菌工艺验证中的应用。

复合防腐剂对生孢梭菌的抑菌工艺优化的研究

本论文考察了三种添加剂-乳酸链球菌素(Nisin)、山梨酸钾、植酸钠对生孢梭菌(Clostridium sporogene)的共同抑制作用。采用中心旋转回归试验优化了三种添加剂的添加浓度,用曲面响应法对影响生孢梭菌抑制效果的Nisin、山梨酸钾和植酸钠的最佳添加水平范围进行了研究。通过分析所建立的二次多项回归方程,得到复合防腐剂的最佳配比为Nisin0.04%、山梨酸钾0.04%、植酸钠0.002%,此时的抑制菌率可达95%以上。所选用的二次多项模型具有高度的显著性。

生孢梭菌作为肿瘤基因治疗载体应用方式与动态分布

目的探讨生孢梭菌在乳癌小鼠体内的应用方式与动态分布,为实体瘤治疗中生孢梭菌的具体应用提供参考。方法制备小鼠乳癌模型。取生孢梭菌的芽胞和繁殖体,以尾静脉和瘤内注射两种方式注射到乳癌小鼠体内,定期随机选取小鼠,处死后取其肝、肾、脾等重要器官以及肿瘤组织制作印片,经革兰染色后镜下观察。同时取组织匀浆进行厌氧培养,观察不同时期组织内细菌分布情况。结果生孢梭菌的繁殖体与芽胞一样可以在低氧的乳癌内部定居繁殖,且没有观察到明显的毒性。静脉注射后,生孢梭菌可以在肿瘤内大量繁殖,与瘤内注射的结果相同;与瘤内注射不同的是,各器官中有少量细菌分布,但随时间的推移很快被清除。生孢梭菌在肿瘤消退之前被进入肿瘤内部的中性粒细胞吞噬消除。结论生孢梭菌是一种靶向性好、安全性高、自限性的实体瘤治疗的靶向载体;在实体瘤的靶向治疗中,可以采用静脉注射的方式,随意采用生孢梭菌的繁殖体、芽胞或二者混合物作为载体将抗肿瘤基因定向送至肿瘤内部发挥作用。

次磷酸钠对肉制品中肉毒梭状芽孢杆菌(生孢梭菌)的抑制效果研究

为了研究次磷酸钠(以下简称SHP)是否能有效抑制肉制品中腐败菌的生长,本文选择了肉制品中常见菌肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌,进行抑菌实验。采用牛津杯方法,做次磷酸钠对肉制品中常见的六种危害菌的抑菌试验,结果表明:次磷酸钠对革兰氏阳性厌氧菌(生孢梭菌、产气荚膜梭菌)有抑菌作用,且随着次磷酸钠浓度的增加抑菌效果增强;不同浓度次磷酸钠处理的生孢梭菌、产气荚膜梭菌菌液,在600nm下利用分光光度计进行OD值测定,结果表明:次磷酸钠对生孢梭菌的最小抑菌浓度(MIC)为2600mg/L,对产气荚膜梭菌的最小抑菌浓度(MIC)为2800mg/L;以生孢梭菌为研究对象,选择L_9(3~4)正交试验方案,通过测量抑菌圈大小确定次磷酸钠对生孢梭菌的最佳抑菌条件,研究结果表明:次磷酸钠对生孢梭菌的最佳抑菌条件为:温度40℃,时间为20h,pH为6.0(偏酸性),主次因素排序为:时间> pH>温度。本文得出了次磷酸钠可以有效抑制部分革兰氏阳性厌氧菌(特别是肉制品中肉毒梭菌)的结论,为进一步研究次磷酸钠在肉制品中的保鲜作用提供支持。

重组穿梭质粒pIMP1-eHER2/neu的构建及其生孢梭菌稳定转化株的筛选与鉴定

目的:制备人原癌基因HER2/neu的细胞外区域(ECD)基因修饰的重组生孢梭菌,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。方法:利用SOE-PCR将HER2/neu ECD基因连接到厌氧菌的内β1,4-葡聚糖酶的启动子和信号肽基因(eg-lAp)下游,构建融合基因eglAp-HER2/neu;将其插入大肠杆菌-厌氧菌穿梭质粒pIMP1,构建重组质粒;首先将重组质粒导入大肠杆菌DH5α内并进行鉴定;然后用电穿孔法将重组质粒导入生孢梭菌。利用红霉素抗性筛选重组生孢梭菌;采用菌液PCR鉴定阳性克隆。结果:酶切和测序结果显示,插入质粒pIMP1内的eglAp-HER2/neu融合基因序列及读框正确。菌液PCR结果表明,重组质粒pIMP1-eHER2/neu成功转化生孢梭菌;经过20多代抗生素压力筛选,重组生孢梭菌仍能稳定携带pIMP1-eHER2/neu。结论:成功制备了重组质粒pIMP1-eHER2/neu生孢梭菌的稳定转化株,为其进一步的抗肿瘤作用研究奠定基础。

重组大肠埃希菌-厌氧梭菌穿梭质粒pIMP1-eIL-12稳定转化生孢梭菌

目的近些年来,以厌氧芽孢梭菌作为实体瘤基因治疗载体的研究逐渐受到关注。文中用重组人白细胞介素-12(rhIL-12)基因重组大肠埃希菌(E.coli)-厌氧梭菌穿梭质粒pIMP1,并稳定转化生孢梭菌,为增强杀伤肿瘤细胞的研究提供基础。方法用SOE-PCR法将rhIL-12基因连到厌氧梭菌的内源性β1,4-葡聚糖酶(endo-1,4-glucanase,eglA)启动子和信号肽之后,构建融合基因eglAp-rhIL-12,将其插入pIMP1,构建重组质粒pIMP1-eIL-12;重组质粒首先在E.coli DH5α内进行鉴定,然后用电穿孔法转化生孢梭菌;利用红霉素抗性筛选阳性克隆,并提取质粒鉴定阳性克隆。结果酶切和测序结果表明插入到pIMP1内的融合基因eglAp-rhIL-12序列及读框正确;抗生素压力筛选和20多代随机质粒提取酶切鉴定结果表明重组质粒pIMP1-eIL-12已稳定转化生孢梭菌。结论成功获得重组质粒pIMP1-eIL-12及其生孢梭菌稳定转化株,为以后的抗肿瘤研究奠定了基础。

生孢梭菌孢子生长与失活模型的统一化研究

为探讨预测微生物生长和失活的预测模型统一化问题,研究将生孢梭菌孢子热失活"镜像化"曲线用描述微生物生长的Gompertz模型和Baranyi模型进行模拟,并通过标准预测误对两种模型进行比较。实验表明:两种模型都能较好的模拟生孢梭菌孢子热失活,但t检验分析差异不显著,标准预测误比较表明Gompertz模型优于Baranyi模型。建议用Gompertz模型统一描述生孢梭菌孢子生长和失活情况。

正交试验法优选无菌检查中生孢梭菌阳性对照菌液的培养条件

《中国药典》１９９５年版二部附录无菌检查法，新增加收载生孢梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）做为抗厌氧菌药物注射液无菌检查的阳性对照菌。本文对其培养条件进行探讨。用正交试验法，选择培养基用量、培养温度和培养时间三个影响菌数的主要因素做为三个水平，用Ｌ９（３４）正交表进行试验。结果表示，培养时间是重要因素。根据对照菌加入菌数的要求，确定实验条件是培养基１０～２０ｍｌ，培养温度（３５±１）℃，培养时间２０ｈ，将此培养物用０．９％灭菌氯化钠溶液稀释至１∶１０７，即为试验用菌液，操作时加入１ｍｌ，此时菌数约为１００个，符合药典阳性对照菌加入菌量要求。

亚硝酸盐对生孢梭菌细胞产量和超微结构的影响

为研究亚硝酸盐抑菌机理,在生孢梭菌对数生长期添加不同量的亚硝酸盐(0、100、200、300、400和500mg·L-1),收集亚硝酸盐作用约20h的生孢梭菌细胞,发现生孢梭菌细胞产量显著降低,应用透射电镜观察发现,添加亚硝酸盐后生孢梭菌超微结构发生显著变化,如细胞壁破裂、变薄或消失,胞浆内容物溶解或流失等。推论认为亚硝酸盐对梭菌细胞的侵害是其抑菌机理之一。

1株与生孢梭菌混同生长的E型肉毒梭菌的分离

１株与生孢梭菌混同生长的Ｅ型肉毒梭菌的分离连云港市卫生防疫站（２２２００３）赵文彬本文在对我市发生的一起疑似肉毒中毒检品“黄豆冬瓜酱”作肉毒梭菌分离培养时，发现有生孢梭菌混同生长，并形成优势群，给该菌的分离增加难度，现报告如下：１．材料和方法１．１．...

生孢梭菌生长所需最低水分活度研究

目的探讨用不同介质调节培养基的水活度,严格厌氧微生物生孢梭菌生长所需的最低水分活度。方法用氯化钠、蔗糖及甘油调节梭菌增菌培养基的水分活度,取制备好的新鲜菌悬液,用无菌生理盐水稀释成每1 mL含104 cfu的菌悬液。将上述菌液分别加入3种调节好的梭菌增菌培养基水分活度中,取1 mL稀释至适宜的稀释级注平皿倾注哥伦比亚琼脂培养基,待培养基凝固后装入厌氧培养袋,在35℃培养72 h,计数。结果以氯化钠、蔗糖及甘油调节梭菌增菌液的水分活度,生孢梭菌生长所需最低水分活度分别为0.95~0.96,0.95~0.96,0.92,其中甘油的试验结果相对稳定,生孢梭菌生长所需最低水分活度最低。结论该方法可为水分活度测定在我国非无菌制剂微生物控制中的应用和2020年版《中国药典》相关内容的修订提供参考。

全脂奶粉可改变生孢梭菌孢子的耐热性

生孢梭菌孢子液可作为灭菌效力相对较低(较低的灭菌温度或较短的灭菌时间;F0值一般控制在8～12 min)的生物指示剂.商购的普通生物指示剂耐热性较高,最常见的是嗜热脂肪芽孢杆菌孢子液,一般用于验证F0值大于等于15 min的灭菌工艺.……

生孢梭菌半固体培养基菌落计数方法的研究

目的 ：建立使用半固体培养基进行生孢梭菌菌落计数的方法,使菌落计数结果能够接近最大活菌数。方法 ：接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐培养基中,30~35℃培养18~24小时,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释生孢梭菌菌液至与标准比浊管相同的浓度,用10倍稀释法分别稀释至1×10-6、1×10-7、1×10-8三个稀释级备用。分别配制琼脂浓度为0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%的6种硫乙醇酸盐培养基,分别取三个稀释级的菌液1m L接种至配制好的上述6种硫乙醇酸盐培养基中,同时在胰酪大豆胨琼脂培养基上接种等量菌液,并放入厌氧袋中,将接种好的上述培养基至35℃培养18~24小时,进行菌落计数并比较结果。结果 ：半固体培养基计数法比厌氧袋计数法效果好,使用琼脂浓度为0.5%的硫乙醇酸盐培养基,30~35℃培养18小时,菌落计数最多,最接近最大活菌数。结论 ：生孢梭菌半固体培养基计数法适用于生孢梭菌计数。

生孢梭菌代谢产物对ICR小鼠的毒性研究

目的研究生孢梭菌代谢产物对ICR小鼠的毒性作用。方法将分离自浓缩乳清蛋白粉及其制品样品中的生孢梭菌分别培养在庖肉肉汤及TPGY肉汤培养基中,将过滤除菌及处理后的培养液分别经灌胃和腹腔注射给予ICR小鼠,观察其中毒及死亡情况。结果生孢梭菌培养液及处理后的培养液经腹腔注射ICR小鼠后均对其有毒性作用,中毒症状表现为小鼠急促呼吸后猝死,死亡时间多集中在10 min内,平均为5~7 min,A-F多价抗肉毒毒素诊断血清对小鼠无保护作用。结论生孢梭菌代谢产物中含有不同于肉毒毒素的有毒代谢产物,腹腔注射可导致ICR小鼠猝死。