葛根素通过上调Wnt/β-catenin信号通路改善化疗诱导的雌性生殖干细胞的氧化应激损伤和凋亡

目的:探讨葛根素(PUE)对化疗诱导的雌性生殖干细胞(FGSCs)氧化应激损伤和凋亡的影响及相关机制。方法:分离并鉴定乳鼠卵巢表层上皮的原代FGSCs,采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测PUE对FGSCs增殖活力的影响。将FGSCs分为对照组(Control)、白消安(BU)组、BU+PUE组和BU+PUE+DKK-1组;采用CCK-8法检测各组FGSCs的增殖活性;采用2,7-二氯荧光素法与试剂盒检测各组FGSCs中活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)含量,谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、超氧化物歧化酶2(SOD2)活性;采用线粒体膜电位检测JC-1染色法检测各组FGSCs中线粒体膜电位水平;采用细胞凋亡检测试剂盒检测各组FGSCs的凋亡率;采用蛋白质印迹法检测各组FGSCs中生殖干性相关蛋白小鼠Vasa同源体(Mvh)、八聚体结合转录因子4(Oct4)及Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin蛋白和凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)的表达水平。结果:成功分离了符合条件的FGSCs,且PUE能促进细胞的增殖活力。与Control组相比,BU组、BU+PUE组和BU+PUE+DKK-1组细胞中ROS、MDA和cleaved caspase-3的表达水平均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05),细胞的增殖活力,线粒体膜电位,细胞中GPx、SOD2、Mvh、Oct4、β-catenin及Bcl-2的表达水平均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与BU组相比,BU+PUE组细胞中ROS、MDA和cleaved caspase-3的表达水平均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05),细胞的增殖活力,线粒体膜电位,GPx、SOD2、Mvh、Oct4、β-catenin及Bcl-2的表达水平却明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05),BU+PUE+DKK-1组与BU组的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:PUE可通过Wnt/β-catenin途径减轻BU诱导的氧化应激损伤和细胞凋亡,并恢复FGSCs的增殖活性及干性。

卵巢生殖干细胞巢功能的影响因素和调控机制

卵巢功能随着女性年龄的增长发生衰退,导致卵泡生成减少,大大降低女性生育能力,甚至产生衰老相关性疾病。雌性生殖干细胞是存在于卵巢表皮中、具有对称分裂为新的干细胞和不对称分化为生殖细胞和颗粒细胞特性的双向潜能细胞。该干细胞的发现,为女性卵母细胞的更新、解决不孕问题带来了希望。卵巢生殖干细胞巢是雌性生殖干细胞赖以生存的微环境,对维持雌性生殖干细胞的功能至关重要。营养、蛋白分子、细胞因子和信号通路等多种因素参与调控雌性生殖干细胞的功能,继而影响其增殖、分化。该文就卵巢生殖干细胞巢功能的影响因素和调节机制进行综述。

黄鳝生殖干细胞在性逆转生殖发育过程中的变化

应用组织学方法及免疫组织化学技术显示,黄鳝性逆转生殖发育过程中,生殖干细胞(GSCs)定位分布于生殖褶中,黄鳝雌性发育阶段的GSCs分散或成团存在,间性及雄性发育阶段GSCs均区分为A、B两种不同类型,雌性发育阶段GSCs与A、B两类GSCs在超微结构上存在差异。结果表明,生殖褶中GSCs是黄鳝分化生殖腺中唯一具有有丝分裂能力的生殖细胞群,雌性发育阶段GSCs表现出卵原干细胞特征,间性及雄性发育阶段GSCs为精原干细胞。CD49整合素是黄鳝雌性发育阶段GSCs和A类GSCs的表征分子。

新生牛雄性生殖干细胞的分离纯化与培养

为建立新生牛雄性生殖干细胞的体外增殖与分化体系,将新生牛睾丸消化成单细胞悬液,分别进行差速贴壁、不连续密度梯度Percoll分选雄性生殖干细胞和支持细胞,对分选生殖干细胞进行体外培养。结果表明,差速贴壁法能有效分选雄性生殖干细胞与支持细胞,2%血清浓度的培养液即可用于雄性生殖干细胞的体外培养,添加100 ng·mL-1的GDNF能显著促进雄性生殖干细胞的增殖,增殖形成的雄性生殖干细胞集落具有一定多能性。

人胚胎生殖干细胞的分离和体外培养

目的:体外培养人胚胎生殖干细胞(EG),在不添加细胞因子的培养条件下,观察细胞生长情况。方法:取5～10周人胚胎的生殖腺嵴和肠背系膜,进行组织块培养,采用组织化学及免疫细胞化学技术对培养的细胞进行鉴定。结果:培养4d后,在成纤维细胞的上面出现EG细胞集落;培养2周后,显示细胞呈圆形,胞质染成深蓝色;细胞染色体均为正常的二倍体核型;碱性磷酸酶活性强阳性;并检测到SSEA-1。结论:体外培养人胚胎生殖腺嵴,利用源于自身胚胎组织的成纤维细胞作为饲养层,可观察到EG细胞集落的形成;培养的细胞初步鉴定为人胚胎干细胞。

胎牛雄性生殖干细胞源类ES细胞的分离培养与多能性研究

雄性生殖干细胞(male germ stem cells , mGSCs)来源于原始生殖细胞(primordial germ cells ,PGCs) ,且终生存在于性分化后的睾丸中。从20周胎牛分离睾丸细胞,2步连续贴壁速率差法能有效纯化胎牛mGSCs ,经流式细胞仪检测,CD9阳性细胞的比例达到95.8 %。原代与支持细胞共培养,出现隆突状和鸟巢状两种细胞集落。获得1株传至4代仍呈现集落生长的细胞株,且集落AKP染色阳性。对第3代鸟巢状细胞集落免疫组化和诱导分化分析,结果显示:SSEA1和Oct-4免疫组化染色阳性;短期内可自发形成c-kit染色阳性的分化态精原细胞;定向诱导分化形成了表达神经丝蛋白(Neuro filament ,NF)的神经样细胞和表达α-actin的心肌样细胞团。试验结果表明:20周胎牛雄性生殖干细胞在体外可形成具有多分化潜能性的类胚胎干(embryonic stem,ES)细胞。

犊牛睾丸生殖干细胞与支持细胞体外共培养体系的建立

旨在建立牛雄性生殖干细胞(mGSCs)-支持细胞(SCs)体外共培养体系,并比较不同密度SCs共培养mGSCs的效果。分离、培养mGSCs和SCs并鉴定,然后在密度不同的SCs上共培养mGSCs,观察细胞形态、统计mGSCs集落数、测定两种细胞特异基因的相对表达量。结果表明,培养的mGSCs具有与小鼠mGSCs相同的形态特征,AKP染色细胞克隆阳性,各培养体系均表达SCs和mGSCs特异基因SCF、OCT-4;低密度SCs(225个/cm2)培养mGSCs比中密度(1 300个/cm2)和高密度(5 600个/cm2)培养mGSCs效果好:mGSCs集落纯度、体积较大;mGSCs集落比例显著(P<0.05)和极显著增高(P<0.01);mGSCs特异基因表达量均极显著增高(P<0.01)。说明建立睾丸干细胞体外共培养体系时,采用较低密度的支持细胞共培养可获得理想的睾丸生殖干细胞。

成体生殖干细胞研究进展

胚胎干细胞(ESC)、胚胎生殖细胞(EGC)和胚胎癌细胞(ECC)是多潜能干细胞,有分化为配子的潜能。睾丸内精原干细胞是唯一的成体生殖干细胞(aGSC),具有分化为精子的单能性。近来发现一些非生殖系干细胞也可分化为生殖细胞。雌性动物出生后体内仍存在生殖干细胞(GSC),睾丸内精原干细胞(SSC)可进一步分化为具有ESC性质的多潜能GSC。这些新发现更新了公认的传统观念。现就GSC的新进展做一综述,重点探讨不同成体GSC的来源、可塑性及其在医学上的应用前景。

MiR-34c在奶山羊雄性生殖干细胞增殖分化中的作用

microRNA(miRNA)在奶山羊雄性生殖细胞和精子发生过程有重要的调控功能。为研究miR-34c对雄性生殖干细胞增殖与分化中的作用,本文利用视黄酸效应基因8(Stra8)在雄性生殖细胞中随年龄增长,以其表达量上调的表达特征为指针,使用实时定量PCR技术筛选分析miRNAs。结果发现,miR-34c与Stra8的表达规律基本一致。在无精症奶山羊的睾丸组织中,发现miR-34c在无精症奶山羊睾丸组织中表达缺失。利用miR-34c模拟物及抑制剂转染奶山羊雄性生殖干细胞,体外转染miR-34c模拟物及其抑制剂,发现miR-34c能够下调Rarg、Stra8与c-Myc基因的表达,减缓奶山羊雄性生殖干细胞的增殖。结果提示,miR-34c可能具有调控奶山羊雄性生殖干细胞的减数分裂的作用,同时抑制其增殖。

哺乳动物卵巢中生殖干细胞的研究历史与进展

对于出生后的哺乳动物卵巢中是否存在生殖干细胞以维持卵泡的更新一直争议不断,现就该领域的研究历史及最新进展进行综述.

小熊猫卵巢肥大细胞与雌性生殖干细胞的初步观察

为了解小熊猫卵巢肥大细胞分布情况,收集15只成体小熊猫的卵巢,按常规组织学技术制作组织切片。根据甲苯胺蓝染色结果,肥大细胞主要分布于血管壁与卵泡动脉外膜的结缔组织中,其数量随着发情周期呈规律性变化,发情期最高,乏情期次之,妊娠期数量最少,不同时期之间肥大细胞数量差异极显著(P<0.01);阿尔新蓝-番红花红(AB-S)染色将肥大细胞可分为黏膜型、结缔组织型与混合型。肥大细胞可能对小熊猫的受精,胚胎着床,妊娠有调节作用。免疫组化染色显示,小熊猫卵巢有组胺阳性细胞,这些细胞分布也是随着发情周期呈规律性变化,卵母细胞和生殖上皮细胞呈现小鼠脉管同系物(MVH)阳性反应,说明小熊猫卵巢内存在生殖干细胞。

哺乳动物雌性生殖干细胞研究的质疑、进展及挑战

传统观点认为雌性哺乳动物在出生后即失去产生新生殖细胞的能力,但近年来研究人员在多种出生后的哺乳动物卵巢内成功分离并培养到一类生殖细胞,这类细胞具有自我增殖和分化成卵母细胞的能力,从而确认出生后的哺乳类动物卵巢内存在雌性生殖干细胞的事实。该文拟从雌性生殖干细胞的研究历史及发现,生殖界对雌性生殖干细胞的质疑,近年来雌性生殖干细胞的研究进展和应用,以及当前雌性生殖干细胞研究所存在的不足、所面临的机遇与挑战作一评述。

人胚胎生殖干细胞移植对大鼠心肌梗死的影响(英文)

目的：探讨直接注射移植人胚胎生殖干细胞对大鼠心肌梗死的影响。方法：缝扎SD大鼠左冠状动脉前降支，建立心肌梗死模型。取5～10周人胚胎生殖腺嵴，组织块体外培养，生物学鉴定为人胚胎生殖干细胞（hEG）。将其直接注射于大鼠急性心肌梗死边缘。于移植后1d、1、2、4周处死大鼠，免疫组织化学方法观察心肌特异转录因子GATA-4和抗人细胞核抗体MAB1281在移植细胞的表达。结果：免疫组织化学显示移植组MAB1281检测阳性，GATA-4在移植细胞阳性表达。结论：hEG细胞直接注射移植大鼠心肌梗死处，细胞能存活并呈现向心肌细胞分化的表现，显示出正常心肌细胞的光镜结构。

鸡生殖干细胞研究现状与展望

鸡生殖干细胞是一类多能性干细胞,既可以在体外进行长期的自我更新,又能保持多向分化潜能,在禽类胚胎发育研究、转基因禽类生产及家禽育种等方面均有巨大应用价值。本文主要就鸡生殖干细胞的分离、培养与鉴定方法的研究进展及其应用前景进行简要综述,为进一步发展更高效的鸡生殖干细胞培养体系并应用于生产实践提供一定的借鉴。

黄鳝成体性腺组织生殖干细胞的体外培养及鉴定

通过黄鳝成体性腺组织的体外培养，探讨黄鳝成体性腺生殖干细胞体外分离培养与鉴定的方法．分离黄鳝性腺组织进行植块培养，倒置相差显微镜下观察细胞生长状况．利用H．E、油红0染色、碱性磷酸酶（AP）细胞化学染色等方法对培养细胞进行鉴定．黄鳝成体性腺组织原代培养3～5d，可见组织周围有细胞迁出，并形成生长晕．15d左右，生长晕直径可达3～3．2mm，生长晕中的细胞主要包括：成纤维细胞、神经样细胞、类生殖干细胞三种类型．成纤维细胞呈不对称的长梭形，突起短而多，细胞核较浅，核仁明显，有2～3个核仁，是生长晕的主要细胞成分．神经样细胞具有放射丝状细胞突起，油红O染色呈阳性反应．类生殖干细胞呈圆形，单核或多核，核质比大，AP染色呈现出阳性反应．探索了适于黄鳝成体性腺组织体外培养的条件和方法，并对原代培养的细胞进行了初步鉴定，为进一步利用体外培养的黄鳝成体性腺生殖干细胞开展黄鳝性逆转分子机制研究奠定了基础．

Mmu-miR-34c慢病毒表达载体构建及在奶山羊雄性生殖干细胞的表达

【目的】用两种方法构建miR-34c的慢病毒表达载体,并包装成慢病毒颗粒,为经济、高效的进行miR-34c超表达提供方案,为进一步研究miR-34c的作用奠定基础。【方法】从小鼠基因组中扩增miR-34c前体,分别插入pLL3.7的CMV启动子起始的GFP之后或U6启动子后,构建成载体pLL3.7-CMV-34c及pLL3.7-U6-34c。将重组慢病毒载体和包装质粒混合物转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,测定病毒滴度。感染293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞,用293T细胞与奶山羊雄性生殖干细胞的GFP表达程度测定转染效率,用定量PCR方法测定miR-34c的表达效率。【结果】重组质粒酶切及PCR分析及转化菌液测序,证明插入序列正确,qPCR检测显示:miR-34c的表达在慢病毒载体感染的293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞均显著上调。【结论】用pLL3.7慢病毒载体中的CMV和U6两种启动子均可经济高效地进行miR-34c超表达,且由U6启动子启动的miR-34c慢病毒表达载体可以成功高效感染关中奶山羊雄性生殖干细胞。

Osa在果蝇卵巢生殖干细胞分化中的功能研究

果蝇卵巢生殖干细胞(Germline stem cell,GSC)是在活体(in vivo)研究干细胞命运调控的理想平台。表观遗传机制在果蝇卵巢GSC命运调控中发挥重要作用,其机理的探明需要研究并发现更多参与此过程的表观调控因子。为探究果蝇染色质重塑复合物BAP中特有的亚基Osa在果蝇卵巢GSC分化调控中的功能及其分子机理,利用GAL4/UAS二元表达系统结合RNAi技术在干细胞微环境组分护卫细胞(Escort cells,ECs)中特异性下调osa的表达,并通过免疫荧光染色法对相关指标进行检测。结果显示,敲减ECs中osa可致卵巢组织卵原区中未分化生殖细胞数目(Undifferentiated germ cells,UGCs)显著增多,同时BMP信号通路激活标志p Mad、Dad-lacZ阳性细胞数目显著增多,并观察到EC细胞形态异常,不能有效包裹生殖系细胞。推论Osa以BMP信号通路依赖方式参与果蝇卵巢GSC的分化调控,其作用机理还可能涉及EC细胞特定的形态学过程。

传代培养人胚胎生殖干细胞的生物学鉴定

目的：通过对传代培养至第5代细胞分子标记物的表达分析,鉴定传代培养的细胞为人胚胎生殖干细胞(embrgonic germ stem cells,EGCs)。方法：取5～10周人胚胎的生殖腺嵴和肠背系膜,进行组织块体外培养人EGCs,挑选传代培养至第5代生长良好的细胞,采用免疫细胞化学法分别检测SSEA-1、SSEA-3、Oct-4、hTERT的表达。结果：组织块体外培养得到的细胞,经免疫细胞化学法显示的单个细胞或细胞集落,均阳性表达SSEA- 1、SSEA-3、Oct-4、hTERT。结论：组织块体外传代培养第5代所获得的细胞,为未分化的人EGCs。

雌性生殖干细胞的研究进展

人类对于生殖干细胞的研究最初是关于精原干细胞的研究,雄性哺乳动物由于精原干细胞的自我更新和分化,得以不断产生精子。传统观点认为,卵巢的始基卵泡池是卵泡的唯一储备库,哺乳动物出生后始基卵泡池一旦形成,其卵泡数目不再增加。随着卵泡的发育、成熟和闭锁,卵泡不断耗竭,卵巢功能逐渐衰退,女性渐渐进入绝经期。然而,雌性生殖干细胞的出现挑战了传统观点,它由原始生殖细胞转化而来,具有能够定向分化为卵母细胞的能力,可望补充不断消耗的始基卵泡池,是生殖生物学的革命性发现。

卵巢生殖干细胞研究进展

研究显示,卵巢中可能存在具有自我更新和分化潜能的生殖干细胞,尽管数量很少,但能产生新的卵母细胞和维持始基卵泡发生。对生殖干细胞的分离培养及其分化调控的研究将会加深研究者对生殖生理的认识,并为保留卵巢恶性肿瘤患者的生育功能及对卵巢性不孕症的治疗提供新的策略。