基于PI3K/AKT通路探讨左归丸改善卵巢衰老大鼠卵巢生殖干细胞干性的机制

目的基于磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路探讨左归丸通过缝隙连接蛋白43(Cx43)磷酸化改善卵巢衰老大鼠卵巢生殖干细胞(OSCs)干性的机制。方法将8周龄雌性SD大鼠随机分为正常组、模型组、脱氢表雄酮(DHEA)组、左归丸组,每组6只。采用环磷酰胺腹腔注射15 d复制卵巢衰老大鼠模型。模型复制结束后,DHEA组大鼠灌胃DHEA 8.1 mg·kg^(-1),左归丸组大鼠灌胃左归丸1.85 g·kg^(-1),每日1次,连续30 d。采用HE染色法观察大鼠卵巢组织病理变化及各级卵泡计数;ELISA法检测大鼠血清抗缪勒管激素(AMH)、卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E_(2))水平;Western Blot法检测卵巢组织中相关蛋白(PCNA、MVH、Oct4、Cx43、p-Cx43、EGFR、AKT、p-AKT)的表达水平。结果与正常组比较,模型组大鼠体质量明显下降(P<0.05),卵巢湿质量明显降低(P<0.05),始基卵泡数显著减少(P<0.01);血清FSH水平显著升高(P<0.01),E_(2)、AMH水平呈下降趋势(P>0.05);卵巢组织中Oct4、MVH、PCNA、EGFR、p-AKT/AKT、p-Cx43(Ser368)/Cx43、Cx43蛋白表达水平均明显降低(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,左归丸组大鼠体质量明显升高(P<0.05),卵巢湿质量、卵巢指数均显著升高(P<0.01),始基卵泡数显著增加(P<0.01);血清E2水平明显升高(P<0.05);卵巢组织中Oct4、MVH、PCNA、EGFR、p-AKT/AKT、p-Cx43(Ser368)/Cx43、Cx43蛋白水平表达均显著升高(P<0.05,P<0.01)。结论左归丸可能通过维持OSCs干性改善卵巢衰老,其作用机制与PI3K/AKT信号通路及缝隙连接蛋白磷酸化相关。

原始生殖细胞的人类胚胎干细胞克隆

取材于妊娠终止胚胎生殖腺或生殖嵴及其周围组织，用ＤＭＥＭ＋ＮＣＳ培养液体外培养，分离由人ＰＧＣｓ转化成的类ＥＳ细胞，并将其与同源胚胎成纤维细胞一起用胰蛋白酶＋ＥＤＴＡ的无钙镁ＰＢＳ液消化传代。在原代培养１２ｈ观察到胞体较大、边缘不整、贴壁分裂增殖的ＰＧＣｓ样细胞，４８ｈ后观察到２６处紧密排列呈鸟巢状的类ＥＳ细胞集落及集落团。第６ｄ传代成功，第１６ｄ传至第４代。结果表明，体外培养附植后胚胎能够建成人的类ＥＳ细胞系。

黄鳝生殖干细胞在性逆转生殖发育过程中的变化

应用组织学方法及免疫组织化学技术显示,黄鳝性逆转生殖发育过程中,生殖干细胞(GSCs)定位分布于生殖褶中,黄鳝雌性发育阶段的GSCs分散或成团存在,间性及雄性发育阶段GSCs均区分为A、B两种不同类型,雌性发育阶段GSCs与A、B两类GSCs在超微结构上存在差异。结果表明,生殖褶中GSCs是黄鳝分化生殖腺中唯一具有有丝分裂能力的生殖细胞群,雌性发育阶段GSCs表现出卵原干细胞特征,间性及雄性发育阶段GSCs为精原干细胞。CD49整合素是黄鳝雌性发育阶段GSCs和A类GSCs的表征分子。

人脐带基质干细胞体外向雌性生殖细胞分化的潜能(英文)

背景:骨髓间充质干细胞具有向卵母细胞分化的潜能,但是其免疫排斥和来源的有限性限制了其应用。研究表明,脐带间质干细胞也具有分化为卵母样细胞的潜能。目的:建立分离培养人脐带间质干细胞的方法,观察其在体外向生殖细胞分化的潜能。方法:无菌条件下取正常足月分娩新生儿的脐带,用Ⅰ型胶原酶消化,分离单个核细胞,DMEM培养,获得贴壁细胞,流式细胞仪检测其免疫表型。采用不同条件培养基诱导细胞向成脂、成骨、成软骨方向分化。通过RT-PCR检测脐带间质干细胞中生殖系特异性标记物的表达,采用卵泡液作为条件培养基,体外诱导脐带间质干细胞向生殖细胞分化。结果与结论:①分离的脐带单核细胞培养后呈纺锤体样,体外增殖达10代以上,其分子免疫表型为:CD29、CD44、CD73(SH3)、CD90、CD105(SH2)阳性;SSEA-4弱阳性;CD31、CD34、CD45、HLA-DR阴性,与骨髓间充质干细胞的免疫表型相似。在不同的诱导条件下,脐带间质干细胞可形成脂滴、骨结节、软骨结节等结构,并表达脂肪、骨及软骨细胞相关的特异性基因。②脐带间质干细胞表达OCT4、Stella、Ifitm3等生殖系标记物,在含5%,10%,20%等不同浓度卵泡液的诱导条件下细胞可聚集分化形成卵母细胞样结构。

BMP4诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的研究

旨在探讨BMP4诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的作用机理。采用单层贴壁培养作为分化模式，分别采用10、20、30和40ng·mL-1 BMP4浓度诱导雄性鸡胚胎干细胞，通过形态学、荧光定量PCR和免疫细胞化学检测诱导效果。根据细胞形态变化和差异基因表达量变化，确定了BMP4的适宜诱导浓度为40ng·mL-1。在适宜浓度诱导过程中，诱导4d类胚体开始出现，6～8d类胚体逐渐增大，数量增多，10d部分类胚体开始散开，变为小的圆形细胞，12d在散开后的类胚体周围可观察到少量生殖样细胞，14d生殖样细胞数目增多，且呈聚团生长的趋势。诱导过程中相应基因表达量也发生变化：胚胎干细胞标记基因Nanog、Sox2表达量显著下降（P〈O．01），生殖细胞特异基因Stra8、Dazl、integrina6、c-kit表达量均呈显著上升趋势（P〈O．01）。BMP4可以引起生殖细胞相应基因的表达，促进雄性鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞方向分化，结果为雄性生殖细胞的体外诱导研究提供试验参考，为进一步研究雄性生殖细胞发生和调控机制提供理论基础。

新生牛雄性生殖干细胞的分离纯化与培养

为建立新生牛雄性生殖干细胞的体外增殖与分化体系,将新生牛睾丸消化成单细胞悬液,分别进行差速贴壁、不连续密度梯度Percoll分选雄性生殖干细胞和支持细胞,对分选生殖干细胞进行体外培养。结果表明,差速贴壁法能有效分选雄性生殖干细胞与支持细胞,2%血清浓度的培养液即可用于雄性生殖干细胞的体外培养,添加100 ng·mL-1的GDNF能显著促进雄性生殖干细胞的增殖,增殖形成的雄性生殖干细胞集落具有一定多能性。

不同基质蛋白对小鼠胚胎干细胞生殖细胞分化相关基因表达的影响

目的:探讨不同基质蛋白对小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)分化形成拟胚体(embry-oid bodies,EBs)后生殖细胞分化相关基因表达的影响及机制。方法:mESCs分化形成EBs 3 d后接种于不同基质蛋白包被的培养皿中,包括人工基底膜(matrigel,M组)、纤维连接蛋白(fibronectin,F组)、层粘蛋白(laminin,L组)、胶原(collagen,C组)和非生物活性底物琼脂糖(agarose,A组),同时设不加任何基质蛋白的空白对照组(B组)。RT-PCR检测EBs在不同基质蛋白上d1～d4期间生殖细胞分化相关基因的表达,以及mESCs内源性基质蛋白FN(fibronectin)、LN(laminin)以及整合素受体β1基因的表达。结果:L组和F组EBs易贴壁分化,RT-PCR结果也证实原始生殖细胞(PGCs)分化基因Blimp-1、Stella、Mvh和减数分裂启动基因Stra8在L组和F组表达总体趋势为逐渐增强;M组和C组的表达趋势不明显;A组基因表达水平整体偏低;空白对照B组基因表达水平整体偏高但均呈下降趋势。L组和空白对照组细胞表达内源性基质蛋白FN、LN以及整合素受体β1。结论:层粘蛋白/β1信号途径可能对mESCs向PGCs分化具有指导作用,外源性层粘蛋白可能通过其受体β1亚单位传递诱导信号,调节mESCs来源的EBs向PGCs分化,FN可能通过其他整合素受体亚单位发挥作用。无任何外源性基质蛋白时,自身分泌的内源性基质蛋白也促进细胞分化。

Figla基因过表达促进小鼠胚胎干细胞向雌性生殖细胞分化

生殖系a因子(Figla)是最早表达的生殖细胞特异性转录因子之一,对卵泡的发育、Zp基因的表达和透明带的形成具有调节作用.Figla基因异常会引起卵巢早衰的发生.本研究通过PCR自小鼠基因组中扩增出Figla基因,将其克隆到真核报告载体pDsRed1-N1,构建了携带609 bp的Figla重组载体pDsRed1-N1-Figla.用该载体转染小鼠胚胎干细胞(mESCs)系J1、小鼠成纤维细胞系NIH-3T3、小鼠畸胎瘤细胞P19和小鼠精原细胞系GC1,在荧光显微镜下观察红色荧光蛋白(RFP)在细胞中的表达,同时检测转染细胞中Figla基因及其它生殖细胞特异性基因的表达.结果显示,转染2 d,mESCs内Figla总表达量明显增加,且内源性表达量亦有所提高,即转入的外源性Figla基因可以促进内源性Figla的启动和表达.免疫荧光染色显示,表达RFP的细胞同时表达生殖特异性基因Vasa,减数分裂特异性基因Stra8、Scp3及卵母细胞标志基因Zp3.通过QRT-PCR检测发现,在转染3 d的细胞中,Vasa、Scp3和Zp1的表达较对照组均有明显上调,而Oct4和Stra8的表达量下降.研究表明,Figla基因对生殖特异性基因的表达具有调控作用,可以激活雌性生殖基因表达,为更清楚地了解Figla基因在生殖细胞生长发育过程中的调控机制,以及发现该基因在生殖细胞中的新功能奠定了基础.

人胚胎干细胞向生殖细胞分化的研究进展

小鼠胚胎干细胞体外已成功诱导分化为配子细胞,人胚胎干细胞理论上也具备分化为生殖细胞的潜能。本文从影响人胚胎干细胞体外向生殖系分化的基因调控和干细胞小生境(niche)方面进行综述,并指出胚胎干细胞在生殖医学及不孕治疗中的研究方向和应用前景。

胎牛雄性生殖干细胞源类ES细胞的分离培养与多能性研究

雄性生殖干细胞(male germ stem cells , mGSCs)来源于原始生殖细胞(primordial germ cells ,PGCs) ,且终生存在于性分化后的睾丸中。从20周胎牛分离睾丸细胞,2步连续贴壁速率差法能有效纯化胎牛mGSCs ,经流式细胞仪检测,CD9阳性细胞的比例达到95.8 %。原代与支持细胞共培养,出现隆突状和鸟巢状两种细胞集落。获得1株传至4代仍呈现集落生长的细胞株,且集落AKP染色阳性。对第3代鸟巢状细胞集落免疫组化和诱导分化分析,结果显示:SSEA1和Oct-4免疫组化染色阳性;短期内可自发形成c-kit染色阳性的分化态精原细胞;定向诱导分化形成了表达神经丝蛋白(Neuro filament ,NF)的神经样细胞和表达α-actin的心肌样细胞团。试验结果表明:20周胎牛雄性生殖干细胞在体外可形成具有多分化潜能性的类胚胎干(embryonic stem,ES)细胞。

睾酮诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的研究

试验旨在探讨睾酮对鸡胚胎干细胞(ESCs)向雄性生殖细胞分化过程中的诱导作用效果。首先对睾酮的适宜诱导浓度进行筛选,再联合支持细胞和维甲酸(RA)对传至2代的ESCs进行诱导,通过形态学观察、实时荧光定量PCR及免疫细胞化学对诱导结果进行检测。结果表明:单独使用睾酮诱导,未出现精原干细胞(SSCs)样细胞;睾酮与支持细胞联合诱导时,在第6天有少许类胚体出现,至第12天,有少量SSCs样细胞;睾酮联合支持细胞和RA诱导过程中,诱导第2天出现类胚体,诱导第12天后出现类SSCs样细胞。实时荧光定量PCR结果显示,睾酮+支持细胞组中,ESCs标记基因Nanog、Sox2表达量均呈持续下调趋势,Dazl、integrinβ1、Stra8表达量持续上调;睾酮+支持细胞+RA共同诱导组中,各标记基因与ESCs向生殖细胞分化过程中各基因表达的趋势一致,并且Dazl的表达量明显高于对照组。睾酮单独诱导不能使ESCs向雄性生殖细胞分化,但有促进支持细胞和RA诱导效果的作用,该结果为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供理论基础。

成体生殖干细胞研究进展

胚胎干细胞(ESC)、胚胎生殖细胞(EGC)和胚胎癌细胞(ECC)是多潜能干细胞,有分化为配子的潜能。睾丸内精原干细胞是唯一的成体生殖干细胞(aGSC),具有分化为精子的单能性。近来发现一些非生殖系干细胞也可分化为生殖细胞。雌性动物出生后体内仍存在生殖干细胞(GSC),睾丸内精原干细胞(SSC)可进一步分化为具有ESC性质的多潜能GSC。这些新发现更新了公认的传统观念。现就GSC的新进展做一综述,重点探讨不同成体GSC的来源、可塑性及其在医学上的应用前景。

人胚胎干细胞表达生殖细胞分化相关基因的研究

目的探讨人胚胎干细胞(hES)系H1生殖细胞分化相关基因的表达。方法免疫荧光、碱性磷酸酶检测和核型分析等方法联合鉴定H1的基本生物学特性,RT-PCR方法检测未分化H1的生殖细胞分化相关基因的基本表达模式,分别以人正常睾丸组织和人胚胎成纤维细胞株HFF-1作为阳性和阴性对照组织。结果H1保持正常核型并维持未分化状态。未分化H1表达减数分裂前生殖细胞标志基因STELLAR、DAZL、FRAGILIS、PUM1、PUM2和GDF3;不表达原始生殖细胞(PGCs)标志基因BLIMP-1、减数分裂特异标志基因SCP1、减数分裂启动标志基因STRA8以及生殖细胞分化后期标志基因VASA。结论未分化H1细胞表达生殖细胞减数分裂前标志基因,但不表达分化后期基因,BLIMP-1可能成为区分未分化hES细胞与PGCs的特异性标志基因。

干细胞向女性生殖细胞分化的研究进展

人类辅助生殖技术(ART)可以治疗部分女性卵巢早衰、年龄相关的卵巢功能障碍,但不能治疗生殖细胞缺乏的不孕不育。干细胞研究取得的重大进展,包括多种成体干细胞、人类胚胎干细胞、诱导多能干细胞等,对生殖医学有潜在的应用前景。卵巢中极少量具有自我更新和分化潜能的生殖干细胞,有产生新的卵母细胞的潜能,为卵巢再生、卵母细胞生成、女性不孕治疗提供了新的希望,也为研究生殖生理提供新的研究策略。本文综述干细胞向生殖细胞分化研究。

胚胎干细胞与胚胎生殖细胞

胚胎干细胞与胚胎生殖细胞同属于胚胎源的多潜能干细胞。胚胎干细胞是从附置前胚胎内细胞团分离而来的,而胚胎生殖细胞来自胎儿原始生殖细胞。二者在现代生命科学的各个领域都有着广阔的应用前景。对胚胎生殖细胞的特性,胚胎干细胞与胚胎生殖细胞的异同以及二者的应用前景作一综述。

维甲酸对脂肪源干细胞中生殖标记表达的影响

目的探索脂肪源干细胞(ADSCs)在维甲酸(RA)诱导下是否表达原始生殖细胞标记碱性磷酸酶(ALP)及生殖标记基因vasa。方法分离培养2个月龄SD雌性大鼠ADSCs,传至第3代进行成脂、成骨诱导和表面标记鉴定。将第3代ADSCs分别用10-5、10-6、10-7mol/L RA诱导7 d和14 d,采用ALP检测试剂盒检测各组ALP的活性水平。用RT-PCR方法检测10-5mol/L RA组Vasa mRNA表达。结果将第3代ADSCs分别用10-5、10-6、10-7mol/L RA诱导7 d的D520 nm值分别为0.59±0.04,0.27±0.07,0.15±0.03,对照组为0.07±0.01,诱导14 d的OD值分别为0.42±0.02,0.34±0.01,0.19±0.02,对照组为0.07±0.01,说明RA能显著性促进ADSCs碱性磷酸酶的表达(P<0.01)。第3代ADSCs用10-5mol/L RA诱导7 d Vasa mRNA的表达为阴性。结论第3代ADSCs在维甲酸诱导下能够表达原始生殖细胞标记碱性磷酸酶,但用10-5mol/L RA诱导7 d不能表达生殖标记基因Vasa。

人胚胎生殖干细胞的分离和体外培养

目的:体外培养人胚胎生殖干细胞(EG),在不添加细胞因子的培养条件下,观察细胞生长情况。方法:取5～10周人胚胎的生殖腺嵴和肠背系膜,进行组织块培养,采用组织化学及免疫细胞化学技术对培养的细胞进行鉴定。结果:培养4d后,在成纤维细胞的上面出现EG细胞集落;培养2周后,显示细胞呈圆形,胞质染成深蓝色;细胞染色体均为正常的二倍体核型;碱性磷酸酶活性强阳性;并检测到SSEA-1。结论:体外培养人胚胎生殖腺嵴,利用源于自身胚胎组织的成纤维细胞作为饲养层,可观察到EG细胞集落的形成;培养的细胞初步鉴定为人胚胎干细胞。

犊牛睾丸生殖干细胞与支持细胞体外共培养体系的建立

旨在建立牛雄性生殖干细胞(mGSCs)-支持细胞(SCs)体外共培养体系,并比较不同密度SCs共培养mGSCs的效果。分离、培养mGSCs和SCs并鉴定,然后在密度不同的SCs上共培养mGSCs,观察细胞形态、统计mGSCs集落数、测定两种细胞特异基因的相对表达量。结果表明,培养的mGSCs具有与小鼠mGSCs相同的形态特征,AKP染色细胞克隆阳性,各培养体系均表达SCs和mGSCs特异基因SCF、OCT-4;低密度SCs(225个/cm2)培养mGSCs比中密度(1 300个/cm2)和高密度(5 600个/cm2)培养mGSCs效果好:mGSCs集落纯度、体积较大;mGSCs集落比例显著(P<0.05)和极显著增高(P<0.01);mGSCs特异基因表达量均极显著增高(P<0.01)。说明建立睾丸干细胞体外共培养体系时,采用较低密度的支持细胞共培养可获得理想的睾丸生殖干细胞。

月经血源性间充质干细胞在女性生殖系统疾病中的应用进展

月经血源性间充质干细胞(MenSCs)是近年来在月经液中发现具有间充质干细胞(MSCs)特性的新型干细胞。它的特点是增殖迅速、高克隆潜能和长期存活,在妇女的整个月经周期内都可以获得,而且还可以从废弃的组织中获得,从而避免了伦理问题和侵入性手术。本文就MenSCs的基本特征、免疫表型和功能、分化潜能和免疫调节特性的可塑性、治疗机制及其在女性生殖系统疾病如卵巢癌、盆腔器官脱垂、严重子宫内膜损伤及薄型子宫内膜、卵巢早衰、子宫内膜异位症、胚胎反复植入失败中的应用研究进展、安全性、未来发展的方向作一综述。