生淀粉水解α-淀粉酶Amy486的重组表达和性质分析

为明晰生淀粉水解α-淀粉酶Amy486独特的催化特征,将克隆自Exiguobacterium sp.J84菌株的amy486进行重组表达,并研究重组酶的酶学性质、嗜盐特性和钙离子依赖性。Amy486最适催化pH为7.5,在pH 6.5~8.5范围内酶活力保持40%以上,最适温度为35℃,30℃半衰期为100 h。1.5 mol/L Na_(2)SO_(4)处理可将Amy486的比酶活由1.53 U/mg提升至2209 U/mg。添加1.0 mol/L Na_(2)SO_(4),Amy486在35℃放置500 h,酶活力可保持60%以上。2.5 mmol/L CaCl_(2)可提升酶活力至110%,添加超过5 mmol/L CaCl_(2),Amy486的相对酶活力降至100%以下,EDTA孵育对Amy486蛋白的酶活力和稳定性影响较小。Amy486与钙离子结合的关键位点为K_(3)0_(2),K_(3)0_(2)E与钙离子的结合能力增强,从而降低该酶对外源钙离子的依赖性。α-淀粉酶Amy486及其突变体酶K_(3)0_(2)E是具有较高比酶活的生淀粉水解酶,对外源钙离子的依赖性较低,其活力的发挥依赖于适合的盐浓度,可应用于某些高盐环境下的淀粉水解。

生淀粉水解α-淀粉酶AmyZ1热稳定性提升的分子改造

生淀粉水解α-淀粉酶是一种具有生淀粉水解能力的α-淀粉酶,能够在淀粉糊化温度以下降解生淀粉颗粒,适用于淀粉冷水解。ΑmyZ1是来源于海洋微生物的生淀粉水解酶,其催化底物转化应用时热稳定性不足。与热稳定α-淀粉酶结构进行比对分析,发现AmyZ1在结构域B区域多了一个柔性loop区。通过同源建模,确定突变位点,构建缺失柔性区的突变酶AmyZ1∶ΔTG,并对突变酶的酶学性质、Ca^(2+)依赖以及水解高浓度玉米生淀粉的能力进行分析。AmyZ1∶ΔTG最适作用温度为45℃,在35℃~55℃范围内酶活力维持在60%以上。在30℃和35℃条件下,半衰期可分别达到18 h和15 h,是出发酶AmyZ1的10倍和15倍。突变酶AmyZ1∶ΔTG蛋白结构的柔性降低,导致AmyZ1∶ΔTG的催化效率有所降低。与出发酶AmyZ1相比,AmyZ1∶ΔTG的催化性能受外源Ca^(2+)的影响较小,酶活力对外源Ca^(2+)的依赖有所降低,但Ca^(2+)有助于提升其热稳定性。此外,在35℃的作用条件下,AmyZ1∶ΔTG对300 g/L玉米生淀粉的水解率为40%,接近于出发酶AmyZ1。

绿豆蛋白α-淀粉酶抑制肽的制备与鉴定

采用胃-胰蛋白酶水解绿豆蛋白及其分级蛋白,以水解物α-淀粉酶活性抑制率为主要指标,结合水解度、氨基酸组成及分子质量分析其抑制效果差异及原因。结果表明,绿豆蛋白肽对α-淀粉酶活性抑制率最高,为16.51%;与绿豆分级蛋白相比,绿豆蛋白的疏水氨基酸含量和水解度最高,分别为32.68%和6.28%,水解物的肽分子质量最小,均小于20kDa,因此选用绿豆蛋白制备α-淀粉酶抑制肽。然后分离鉴定绿豆蛋白肽,新发现了17条有潜在α-淀粉酶抑制效果的肽。本研究表明绿豆蛋白较其分级蛋白具有更强的α-淀粉酶抑制效果,能够用于降血糖的功能性食品或药物中。

应用α-淀粉酶水解城市生活垃圾的研究

用α-淀粉酶水解城市生活垃圾,研究了水解过程中α-淀粉酶添加量、水解温度、水解时间和底物浓度对水解度的影响。结果表明,α-淀粉酶水解城市生活垃圾的适宜条件为:α-淀粉酶添加量80 IU/g,水解时间60 m in,水解温度80℃,底物浓度10%。

耐高温α-淀粉酶作用于谷物粉液化水解性质的研究

本文用BrabenderVISKOGRAPH -E型粘度计研究了不同用量的耐高温α -淀粉酶Termamy1(LS)作用糯、粳、籼米粉过程的酶液化粘度曲线及其水解液的色值、过滤时间等参数 ,并用玉米、木薯淀粉的酶液化水解特性作对比。进一步了解糯、粳、籼米等的水解及酶液化液的特性 ,对淀粉工业 ,尤其是利用大米制糖技术工艺条件的确定 。

α-淀粉酶水解魔芋飞粉最佳条件优化的研究

本研究采用单因素和正交试验的方法对α-淀粉酶水解魔芋飞粉的酶用量、pH值、温度、[Ca^(2+)]和底物浓度等条件进行优化,结果表明当α-淀粉酶用量为4u/g淀粉、pH为6.0、温度为60℃、[Ca^(2+)]为0.01mol/L和底物浓度为8%时,水解度达20%,为最佳反应条件,研究为进一步利用α-淀粉酶水解魔芋飞粉生产燃料乙醇奠定了基础。

α-淀粉酶对芦荟叶浆粘性物质水解条件研究

通过测定 α-淀粉酶在不同条件下水解后的吸光度和粘度 ,研究 α-淀粉酶对芦荟叶浆粘性水解作用。结果表明 ,α-淀粉酶对芦荟叶浆粘性物质水解的最佳条件为 :p H=6.0、温度为 60℃、酶激活剂 Ca2 + 的浓度 50～ 70 mg/kg、酶 -底物 ( E∶ S)比 2 0 U/g,反应时间 4h,表观消化率为 89.95%。

α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶协同水解淀粉的动力学研究

本文研究了α－淀粉酶和葡萄糖淀粉协同水解淀粉的动力学模型。α－淀粉酶一方面能增加葡萄糖淀粉酶的底物浓度，加大葡萄糖的生成速度；另一方面又会减少葡萄糖淀粉酶底物的大小，降低葡萄糖的生成速度。本动力学模型能很好地描述α－淀粉酶对葡萄糖淀粉酶作用的综合影响，对生产有较大的指导意义。

嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy中结构域C的环化重排及其对Gt-amy催化性能的影响

为确定嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy中结构域C对其催化性能的影响,本研究采用基于蛋白质分子结构的环化重排方法对Gt-amy的结构域C进行分子改造,获得Gt-amy环化重排突变体,并比较了突变体的生淀粉吸附率、生淀粉降解率、酶比活力以及动力学常数.与Gt-amy相比,生淀粉吸附能力提高的Gt-amy环化重排突变体,其生淀粉降解能力也得到提高;生淀粉吸附能力降低的Gt-amy环化重排突变体,其生淀粉降解能力也降低.即Gt-amy的生淀粉降解能力和生淀粉吸附能力之间存在正相关性.其中,环化重排突变体Gt-amy-S498的生淀粉吸附率由78.86%提高至93.14%,生淀粉降解率由65.80%提高至90.93%.本研究证实环化重排突变可以作为一种工程学手段改变蛋白质的结构与功能,为提高酶类蛋白质的催化性能提供了思路.

β-淀粉酶对不同品种淀粉的水解特性

以蜡质玉米淀粉、普通玉米淀粉、马铃薯淀粉和木薯淀粉为原料,将淀粉糊化后经β-淀粉酶水解,研究了酶解产物的流度、DE值、相对分子质量分布和热力学性质等.结果表明:在加酶量为0.1%时,蜡质玉米淀粉的流度最大,马铃薯和木薯淀粉次之,普通玉米淀粉最小;加酶量大于0.3%时,酶解5 h后产物流度趋于稳定,薯类淀粉酶解产物的DE值大于谷类淀粉酶解产物;谷类淀粉酶解产物的相对分子质量分布比较集中,薯类淀粉酶解产物的相对分子质量分布差异较大,且薯类淀粉酶解产物的相对分子质量大于谷类淀粉酶解产物;普通玉米淀粉酶解产物中出现直链淀粉老化或淀粉与脂质复合物的吸收峰,而其他3种淀粉没有吸收峰.

D407A/D430A双位点突变对嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶GTamy酶学性质的影响

旨在研究位于嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶GTamy的结构域A与生淀粉结合域RSBD间的Ca^(2+)结合位点对其酶学性质的影响,构建了GTamy的Ca^(2+)结合位点突变体GTamy D407A/D430A,并比较了GTamy与突变体GTamy D407A/D430A的酶学性质。结果表明,与GTamy相比,突变体的高温活性和热稳定性明显降低。突变体于80℃的比活力由1 756.75 U/mg降低至1 484.48 U/mg;80℃的半衰期由3 h降低至2.5 h。以可溶性淀粉为底物时,突变体的底物结合能力不变,反应速率为GTamy的79%;以玉米淀粉为底物时,突变体的底物吸附率为GTamy的67.9%,底物降解率为GTamy的59.3%。该Ca^(2+)结合位点可能通过改变RSBD和催化活性中心的分子结构来影响GTamy的高温活性和热稳定性。本研究表明该Ca^(2+)结合位点有利于GTamy维持高温活性和热稳定性。

嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的C末端结构域功能及生淀粉结合位点分析

为确定嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy中参与生淀粉结合的结构区域,对Gt-amy的C末端结构域(C-terminal domain,CTD)进行缺失突变,并比较Gt-amy及CTD缺失突变体Gt-amy-T的酶学性质。在与Gt-amy相同的条件下,Gt-amy-T不能结合和降解玉米淀粉,CTD可有效结合玉米淀粉。以可溶性淀粉为底物,Gt-amy-T的kcat值约为Gt-amy的77.9%。CTD的系统进化关系分析显示CTD不是典型的淀粉结合结构域,但是本研究证实CTD属于生淀粉结合结构域,在Gt-amy结合并降解生淀粉中发挥重要作用,并且CTD有利于Gt-amy发挥可溶性淀粉酶活力。此外,本研究将CTD中Tyr残基定点突变为Ala残基,通过比较CTD与突变体的玉米淀粉结合能力以及Gt-amy与Gt-amy W501A/W514A的玉米淀粉结合率和降解率,确定CTD中W501和W514可能是生淀粉结合位点。

以水解液为原料的α-淀粉酶发酵工艺条件的研究

本文以枯草杆菌BF-7658诱变菌株Ning为试验菌株,以玉米粉酶水解液为碳源,以豆饼粉碱水解液为氮源,在摇瓶条件下和1.5L发酵罐上进行发酵工艺条件的研究。研究结果表明,该菌株在碳氮比为1:2,pH为6.5～7.5的培养基中可获得较高的α-淀粉酶活性,在1.5L发酵罐中试验α-淀粉酶活性平均可达447.2u/ml,最高能达183.7u/ml(比原菌粗粮发酵提高约150u/m1)。因此,本文试验的清液发酵工艺具有较高的工业推广价值。

高麦芽糖生产β-淀粉酶 普鲁兰酶协同作用动力学研究

对β-淀粉酶和普鲁兰酶的作用特点以及淀粉分子的结构特征进行了研究,建立了高麦芽糖生产中β-淀粉酶、普鲁兰酶双酶系统的动力学模型。实验结果与动力学模型吻合。对生产中优化用酶有指导意义。

α－淀粉酶水解液发酵生产麦角隐亭的研究

用５％麦粉的α－淀粉酶水解液培养麦角菌ＡＴＣＣ２００１９，结果其发酵液能产生麦角隐亭（５０．１６±２．４０）μｇ／ｍＬ，与３０％蔗糖的发酵培养基的产碱量（２０．７４±３．５３）μｇ／ｍＬ相比，两者有差异（ｐ＜０．０５）．在１０％蔗糖的培养基中，发酵第４天后补加５％麦粉的α－淀粉酶水解液，麦角隐亭的产量为（４７．１２±６．３４）μｇ／ｍＬ，也高于碳源为３０％蔗糖的产碱量（１９．８９±２．４０）μｇ／ｍＬ，两者差异显著，ｐ＜０．０１．而两种方法的菌丝体生长量均相差无几，ｐ＞０．０５．

α-淀粉酶产生菌的平板筛选法的研究与改进

用平板水解圈法筛选到若干株 α淀粉酶产生菌，它们的平板水解圈直径大小与摇瓶酶活不相关，进一步研究了３０ ℃平板淀粉的质量分数对水解圈直径的影响以及淀粉的质量分数、温度、琼脂等多种因素对离体 α淀粉酶水解圈直径的影响，并在此基础上建立了一种快速筛选高产菌株的简便方法。

组成型分泌表达嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶的重组粪肠球菌的构建

该研究以高效组成型启动子P10替换pSIP401-gtamyhds中诱导型启动子,构建重组载体pSIP401Z-gtamyhds,并以其为基础框架,分别导入粪肠球菌(Enterococcus faecalis)来源的8种信号肽(s1~s8),采用电转化法将信号肽筛选载体转入具有优良益生特性的粪肠球菌EXW27,构建组成型分泌表达嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的重组粪肠球菌。以发酵上清液中α-淀粉酶活性为评价指标,对8种信号肽进行筛选,并对嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy进行分离纯化和酶学性质研究。结果表明,信号肽s7对嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的分泌效率最高,发酵上清液中α-淀粉酶活性达到310 U/m L。重组Gt-amy的最适反应pH值为5.0,在pH 4.0~8.0范围内具有较好的稳定性,最适反应温度为80℃,于80℃的半衰期为3 h,在40℃条件下反应3 h,对玉米淀粉的降解率可达55.8%。

新课标生物实验常规试剂盒介绍——α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测试剂盒

本试剂盒根据酶的固定化及淀粉水解原理,提供α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测实验所需的全部试剂（包括α-淀粉酶,可溶性淀粉，石英砂和5mM KI—I2溶液等），可直接进行实验。

地衣芽孢杆菌生麦芽糖α-淀粉酶的基因克隆与鉴定

以地衣芽孢杆菌ATCC14580基因组DNA为模板，PCR扩增出1．7kb大小的麦芽糖淀粉酶基因amyM，克隆入表达载体pET-28a（＋），转化Escherichia．coliBL21（DE3），经IPTG诱导，测定麦芽糖淀粉酶酶活性．结果表明，麦芽糖淀粉酶基因amyM获得了活性表达，酶活力为3．797U／mL，SDS—PAGE电泳结果显示出相对分子质量约为67×10^3的特异性蛋白质条带．酶学性质分析表明，重组麦芽糖淀粉酶的最适反应温度为45℃，最适反应pH为6．5，在45℃以下的中低温环境保持稳定，且能在比较宽的pH范围内（pH4．5～8．5）稳定．

中强电场对α-淀粉酶水解玉米淀粉的影响

本文旨在利用中强电场强化α-淀粉酶催化的玉米淀粉水解。以还原糖含量为指标,考察电场强度、频率、缓冲液浓度、酶液比等因素对淀粉酶解效率的影响,并利用扫描电子显微镜、X射线衍射仪、差示扫描量热仪和热重分析仪表征酶解产物的结构和热性质。结果表明,电场强度、缓冲液浓度和酶液比显著影响淀粉酶解效率,但电场频率的影响不明显。当电场强度低于5 V/cm时,淀粉的酶解程度较小,酶解产物保持淀粉原有的颗粒和结晶结构,淀粉热稳定性略有降低;但随着电场强度的进一步增加,淀粉水解程度加剧,淀粉颗粒发生破裂、结晶峰逐渐消失、相对结晶度降低,糊化温度先增加后降低、热稳定性显著降低。