结核潜伏感染生物标志物的应用现状与展望

结核病是结核分枝杆菌引起的严重影响人类健康的慢性传染病,我国作为全球结核病高负担国家之一,需加强结核病的防治工作。据估算,中国结核潜伏感染者占比接近总人口的20%,有效筛查结核潜伏感染,实现早诊断及早期预防性治疗,是控制结核病疫情的关键措施之一。现有诊断结核感染的方法存在不能区分潜伏性感染与活动性感染、不能准确预测结核潜伏感染进展等问题,而生物标志物有望用于潜伏感染与活动性感染的鉴别诊断并预测其活动进展。本文阐述近年来结核潜伏感染相关生物标志物的研究进展,并指出未来的发展趋势,为寻找新的更精准的结核潜伏感染标志物提供思路。

活动性肺结核患者与潜伏感染者差异表达基因的生物信息学分析

目的寻找活动性肺结核患者与潜伏感染者免疫功能差异的重要分子。方法收集活动性肺结核患者和潜伏感染者PBMCs进行转录组测序,分析数据获得差异表达基因,对差异表达基因使用软件MeV进行聚类分析,用DAVID数据库进行GO分析,用STRING数据库进行蛋白相互作用网络分析,用Cytocapase软件进行KEGG分析和蛋白质复合物分析。结果共获得差异表达基因98个,其中上调基因67个,下调基因31个;GO分析生物进程富集的词条是“免疫反应”、“天然免疫反应”和“中性粒细胞趋化”;KEGG分析结果显示富集词条是“自然杀伤细胞介导的细胞毒作用”、“抗原处理和递呈”和“IL17信号通路”等信号通路,其中IFNG、ITGAM、MMP1和FOS基因连接多个信号通路;构建蛋白相互作用网络,筛选到聚集程度高的分子ELANE、ITGAM、MMP9和ARG1;而蛋白复合物分析显示由上调基因组成的复合物1和复合物2、由下调基因组成的复合物3。结论连接多个信号通路或者聚集程度高的重要分子和大分子复合物可能在活动性肺结核患者与潜伏感染者免疫功能差异具有重要的作用,有待我们进一步的实验验证及功能研究。

结核潜伏感染的研究进展

结核潜伏感染(LTBI)是人体感染结核分枝杆菌后无临床症状但产生持续免疫反应的一种状态。因其有进展为活动性结核病和引起结核传播的风险,尤其在高危人群中风险明显增加,所以值得重视。本文围绕LIBI检测方法、诊断标准、LIBI高危因素、筛查对象及治疗等方面进行了综述,重点对活动性结核病密切接触者、HIV感染、肾移植、肿瘤坏死因子拮抗剂、大剂量糖皮质激素、透析人群、新型生物制剂IL-17和IL-23抑制剂、免疫检查点抑制剂与LIBI之间的关系进行了讨论,提出识别易发展为活动性结核病的高危人群,对这部分高危人群进行筛查同时对符合化学预防性治疗人群积极给予治疗,是降低结核病发生率的重要措施。

基于免疫信息学的结核分枝杆菌多阶段多表位疫苗构建

目的构建一种包含结核分枝杆菌(MTB)早期分泌蛋白和潜伏感染相关抗原表位的多阶段多表位疫苗。方法运用免疫信息学方法预测12个MTB蛋白的B细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和辅助性T细胞(HTL)表位,从中筛选具有抗原性且无细胞毒性和致敏性的表位构建多表位疫苗,并进行理化性质分析、二级结构预测,3D建模,模型精制、质量验证,与Toll样受体4(TLR4)受体分子对接,最后进行免疫模拟。结果MTB表位疫苗共包含12个B细胞表位、11个CTL表位和12个HTL表位,具有灵活、稳定的球形构象,热稳定性和亲水性好,可与TLR4稳定相互作用。免疫模拟表明该疫苗能够同时激发有效的细胞和体液免疫应答。结论提出了一种基于免疫信息学技术的多阶段多表位MTB疫苗构建策略,该疫苗可能对活动期和潜伏性MTB感染有预防作用。

结核分枝杆菌潜伏相关蛋白PapA4的功能域及靶向药物预测分析

目的:采用生物信息学方法分析结核分枝杆菌的Rv1528c基因及其编码的Pap A4蛋白结构和功能,以期为结核分枝杆菌潜伏感染的治疗及预防提供研究思路。方法:从NCBI网站获取Rv1528c基因及Pap A4蛋白的基本信息;使用Protparam、Prot Scale和Prot Comp B预测Pap A4蛋白的理化性质、亲疏水性和亚细胞定位;使用Signal PServerv.4.0、TMHMMServerv.2.0、Net NGlyc1.0server和Net Phos Serverv.3.1预测Pap A4蛋白的信号肽、跨膜结构、糖基化及磷酸化位点;使用SOPMA预测Pap A4蛋白的二级结构;使用SWISS MODEL获取Pap A4蛋白的三级结构模型;使用ABCpred和SYFPEITHI预测Pap A4蛋白的抗原表位;使用MEGA软件构建系统发育树;使用STRING数据库查找Pap A4的相关蛋白并进行GO分析推测其功能;使用HDOCK进行蛋白-蛋白对接;使用Chem Draw完成小分子设计并通过Auto Dock软件完成分子对接。结果:Rv1528c基因全长498 bp,编码的Pap A4蛋白氨基酸数为165,分子式为C785H1252N244O_(2)34S7,等电点(p I)为8.84,平均亲水性系数为-0.208,预测其为亲水性蛋白,亚细胞可能定位于细胞膜。Pap A4蛋白无跨膜结构、信号肽和糖基化位点,有15个磷酸化位点;二级结构包含45.45%的α-螺旋(Hh)、12.73%的β-折叠(Ee)、9.70%的β-转角(Tt)、32.12%无规则卷曲(Cc)。Pap A4蛋白含有13个B细胞抗原表位、12个T细胞优势抗原表位和5个CTL抗原表位。系统进化树显示其高度保守。GO分析显示其主要功能与脂肪酸代谢有关。分子对接显示Pap A4蛋白有多个活性位点。结论:生物信息学预测Pap A4蛋白为胞膜蛋白,但无跨膜结构,具有多个磷酸化位点及B、T细胞抗原表位,发现多个功能位点,其主要功能可能是潜伏活化期间海藻糖的脂肪酸酰基化。为结核分枝杆菌潜伏的预防及治疗提供了药物靶点。

结核分枝杆菌潜伏相关蛋白Rv2204c的生物信息学分析

目的 应用生物信息学方法分析结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)潜伏相关蛋白Rv2204c的结构及功能。方法 从NCBI数据库中搜索Rv2204c蛋白的氨基酸序列,运用ProtParam, Signal 6.0 Server, ProtScale, TMHMM Server v.2.0,ProtCompB,NetNGlyc-1.0及NetPhos-3.1预测蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜螺旋区、亚细胞定位及糖基化和磷酸化位点;运用SOPMA、SWISS-MODEL预测蛋白的二、三级结构;运用IEDB预测蛋白的B细胞抗原表位;采用SYFPEITHI,RANKPEP,NetMHC和NetCTL预测其细胞毒性T淋巴细胞(CTL)抗原表位;采用SYFPEITHI、RANKPEP预测其辅助性T(Th)淋巴细胞表位;利用MEGA构建Rv2204c蛋白进化树;运用STRING蛋白相互作用数据库预测Rv2204c相互作用蛋白。结果 Rv2204c蛋白氨基酸总数为118,为亲水性稳定蛋白;该蛋白无信号肽,无跨膜螺旋区;亚细胞定位主要为细胞质;无糖基化位点,含5个磷酸化位点;二级结构中α-螺旋(Hh)占23.73%,β-转角(Tt)占10.17%,无规则卷曲(Cc)占39.83%;含多个优势T、B细胞表位;其互作蛋白为Rv0398c, Rv0883c, pyrD(Rv2139),Rv1465,Rv1463,Rv2205c, ppiA(Rv0009),mmsA(Rv0753c),kgd(Rv1248c)和lipA(Rv2218),参与固氮、脂酸盐合成等多个生物过程。结论 Rv2204c为亲水性稳定蛋白,具有多个T、B细胞抗原表位,可能在潜伏结核感染过程中发挥重要作用,可作为结核病诊断的候选蛋白和治疗新靶点。

基于生物信息学的活动性结核生物标志物的筛选

目的通过采用生物信息学方法挖掘活动性结核生物标志物,提高活动性结核诊断效率。方法登陆GEO数据库下载基因表达芯片GSE19491、GSE25534和GSE31348。采用在线分析工具GEO2R对GSE19491和GSE25534两组芯片数据进行分析,筛选活动性结核感染与正常组织或潜伏结核感染(LTBI)之间的差异表达基因,通过取交集获取核心基因。通过Metascape进行核心基因功能分析,并通过STRING 11.0进行核心基因编码蛋白的相互作用分析。提取活动性肺结核患者GSE31348芯片中核心基因的表达数据,验证核心基因作为活动性结核标志物的有效性。结果通过差异分析取GSE19491和GSE25534两组芯片交集基因,该研究共获得核心基因13个,包括AIM2、ANKRD22、BATF2、C1QB、CARD17、CD274、EPSTI1、ETV7、FCGR1B、GBP1、GBP5、P2RY14和RSAD2。通过功能富集,发现这些核心基因的功能主要与细胞因子的分泌、细胞对γ-干扰素的反应、适应性免疫和细菌感染反应等相关,而信号通路为固有免疫中的NOD样受体相关信号通路。进一步验证这些核心基因在肺结核患者抗结核治疗前后的表达情况,结果显示所有核心基因表达水平在患者接受抗结核治疗后均有不同程度下降,尤其是在抗结核治疗后26周下降幅度最为明显。结论该研究所筛选出来的核心基因AIM2、ANKRD22、BATF2、C1QB、CARD17、CD274、EPSTI1、ETV7、FCGR1B、GBP1、GBP5、P2RY14和RSAD2能够作为反映活动性结核的指标,将这些标志物结合,临床有望提高活动性结核的诊断效率。

结核分枝杆菌潜伏抗原Rv2628的生物信息学分析

目的运用生物信息学的方法分析结核分枝杆菌潜伏相关蛋白Rv2628的结构与功能。方法自NCBI网站获取Rv2628蛋白的基本信息;利用Protparam、ProtScale预测Rv2628蛋白的理化性质、亲疏水性;应用Signal 6.0 Server、TMHMM Server V.2.0、NLStradamus、PSORTb预测Rv2628蛋白的信号肽、跨膜区域、核定位信号及亚细胞定位;使用NetNGlyc1.0、NetPhos Server v.3.1预测Rv2628蛋白的糖基化位点及磷酸化位点;利用SOPMA分析Rv2628蛋白的二级结构,使用SWISS-MODEL对其进行三级结构同源建模;使用ABCpred、SYFPEITHI预测Rv2628蛋白的相关抗原表位;利用MEGA构建Rv2628蛋白的分子进化树;使用STRING数据库预测与Rv2628蛋白可能发生互作的蛋白;使用autodock实现Rv2628蛋白与化合物的分子对接。结果Rv2628基因全长363 bp,由120个氨基酸构成,分子式为C575H906N178O168S4,等电点(pI)为9.09;Rv2628蛋白亚细胞定位于细胞质,无跨膜结构、信号肽及糖基化位点,存在12个磷酸化位点,包括6个苏氨酸、5个丝氨酸和1个酪氨酸磷酸化位点;该蛋白的二级结构以α-螺旋(41.67%)、无规则卷曲(35.83%)为主;Rv2628蛋白含有10个B细胞、6个Th细胞和6个CTL候选表位,三级结构同源建模的GMQE为0.72;苯基香豆素化合物10可以稳定的与Rv2628蛋白结合并发挥抑制作用;此外,Rv2628蛋白可能与Rv1733c、rip3、hrp1、devR、hspX等蛋白存在相互作用,参与结核分枝杆菌潜伏休眠的过程,诱导Th1免疫反应。结论Rv2628蛋白为亲水性蛋白,存在多个磷酸化位点并能够与多种蛋白相互作用,具有高度免疫原性,包含多个优势B细胞、T细胞抗原表位,可作为结核病诊断的候选蛋白。

应用酶联免疫斑点试验检测入伍新兵结核潜伏感染

目的 应用酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测入伍新兵结核潜伏感染情况，评价ELISPOT在检测结核潜伏感染中的价值。方法以结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）皮肤试验为对照，应用ELISPOT试剂盒检测366例2009年驻京部队入伍新兵外周血中分泌结核菌抗原特异性y干扰素（IFN-y）的T淋巴细胞数。对PPD和ELISPOT均为阴性的入伍新兵接种卡介苗，10个月后再做PPD皮肤试验和ELISPOT，比较结果。结果366例入伍新兵中，PPD皮肤试验和ELISPOT阳性率分别为44．81％和31．69％。202例PPD皮肤试验阴性和164例PPD皮肤试验阳性者中，分别有53例（26．24％）和63例（38．41％）ELISPOT阳性，两者的一致率为57．92％（212／366），两者的检测结果差异具有统计学意义（X^2=14．34，P〈0．001）。在接种过卡介苗者中，PPD皮肤试验阳性率为58．53％（127／217），ELISPOT阳性率为29．1）3％（63／217），斑点形成细胞数为32．44±26．52；在未接种卡介苗者中，PPD皮肤试验阳性率为24．83％（37／149），ELISPOT阳性率为35．57％（53／149），斑点形成细胞数为41．81±30．48。110例PPD和ELISPOT均为阴性的人伍新兵接种卡介苗1（1个月后，PPD皮肤试验阳转率为78．18％，而ELISPOT检测均为阴性。结论ELISPOT具有较高的特异性和敏感性，能真实反映入伍新兵的结核潜伏感染情况，可推广应用。

结核潜伏感染诊断新型候选标志物的筛选及临床验证

目的筛选及临床验证结核潜伏感染(LTBI)新型候选标志物,为研究LTBI诊断新方法提供科学基础。方法选择2013年1月至2015年12月就诊于遵义医学院附属医院的活动性肺结核患者(ATB组)、LTBI者(LTBI组)及健康人群(H组)血清。小样本分别独立地与包含4262个结核分枝杆菌(MTB)重组蛋白的Mtbprot TM芯片反应进行初筛,选择差异较为明显的蛋白质,定制成蛋白小芯片,进行较大样本验证,对有效数据进行归一化处理,根据单个蛋白的P值进行评价,进一步通过SPSS统计软件,优化出最优组合。结果用Mtbprot TM芯片,经32份血清(H组7份、LTBI组9份及ATB组16份)试验验证,初筛出前100个可能与LTBI相关蛋白质,用这些蛋白质制成小芯片,分别与204份血清(H组44份,LTBI组60份,ATB组100份)进行进一步验证试验,优选出8个蛋白标志物,分别为Rv1860、Rv2031c、Rv1441c、Rv0494、Rv3301c、Rv0351、Rv1821和Rv0280,其组合诊断LTBI的特异性及敏感性分别为90.9%和83.1%。结论成功筛选鉴定出8个LTBI新型候选蛋白标志物,其组合应用在LTBI诊断和鉴别诊断上具有较大的潜在应用前景。

结核分枝杆菌的潜伏感染与检测方法

结核分枝杆菌是一种复杂的病原微生物。人感染结核分枝杆菌后，大约有10％的初始感染者发生结核病，对于那些没有临床表现的感染者，有相当数量的一部分人体内存在潜伏感染的结核分枝杆菌，即机体的免疫系统能够控制结核分枝杆菌的复制而不表现出临床症状但又不能彻底清除感染的结核分枝杆菌。

Tspot.TB在艾滋病合并潜伏结核感染的诊断中的应用

目的评价结核感染T细胞斑点试验(T-spot.TB)在艾滋病(AIDS)人群中诊断潜伏结核感染的应用价值,了解AIDS患者中潜伏结核感染情况。方法应用T-spot.TB试剂盒对120例AIDS患者的外周血液标本进行检测,并同时进行结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)试验。结果在总体AIDS患者、CD4^+T淋巴细胞计数水平(简称CD4细胞)<200个/μL和≥200个/μL组中,T-spot.TB阳性率为30.8%、32.7%和27.3%,PPD检测阳性率分别为13.3%、9.2%和20.5%。同时,进一步分析发现T-spot.TB检测率与患者免疫状态无关。结论T-spot.TB检测AIDS合并潜伏结核感染阳性率高于PPD试验,T-spot.TB检测对AIDS患者中潜伏结核感染的诊断有较大的应用价值。

结核分枝杆菌感染和免疫逃逸机制研究进展

许多病毒、细菌都有导致潜伏感染的能力，这是它们和宿主之间发生复杂的相互作用的一个重要方面，需要我们从细菌和宿主的相互作用方面去理解这种现象的发生。当病原微生物第一次感染宿主的时候，宿主的天然免疫和获得性免疫系统通常会有一个剧烈的反应过程，如果经过开始的和病原菌的相互作用过程，宿主仍然能够存活，获得性免疫系统通常会将病原菌清除。

结核潜伏感染相关蛋白Rv3407结构和功能的生物信息学分析

目的应用生物信息学方法预测分析结核潜伏感染相关蛋白Rv3407的结构及功能。方法从NCBI数据库中搜索结核分枝杆菌Rv3407蛋白的氨基酸序列,分别利用ProtParam、Protscale、TMHMM、PSORT、SignalP、ITASSER、NetNGlyc、NetPhos、Motif Scan、SOPMA、SWISS-MODEL等生物信息学软件分析蛋白质的理化性质、亲(疏)水性、跨膜螺旋、亚细胞定位、信号肽,可能与之结合的配体和该配体的结合位点、糖基化、磷酸化和翻译后修饰位点及二、三级结构;采用BepiPred、ABCpred、IEDB预测分析B细胞表位,采用SYFPEITHI、RANKPEP、NetMHC、NetCTL预测分析细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位,采用SYFPEITHI和RANKPEP预测分析辅助性T(Th)淋巴细胞表位。结果 Rv3407蛋白共由99个氨基酸构成,分子式为C471H807N155O144S2,不稳定指数为46.59,为亲水性不稳定蛋白;无跨膜螺旋区及信号肽,细胞内定位为胞浆蛋白;可能与之结合的配体有4个;无糖基化位点;苏氨酸、丝氨酸磷酸化位点分别有2和4个;酰胺化、cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化、蛋白激酶C磷酸化、N-豆蔻酰化、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化的位点各1个;其二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲分别占45.45%、11.11%、8.08%及35.35%;B细胞表位可能分布于28-36、50-54、68-71、78-86、96-99位氨基酸残基或其附近;CTL表位可能分布于57-65,40-48,87-95位氨基酸残基或其附近;Th表位主要集中分布于2-39、45-63、71-85位氨基酸残基或其附近。结论结核潜伏感染相关蛋白Rv3407存在多个潜在的B细胞及T细胞抗原表位,其中以T细胞抗原表位占优势,免疫原性良好,可为结核潜伏感染疫苗的研制、免疫学诊断等提供理论依据。

结核分枝杆菌休眠相关蛋白Tgs3的生物信息学分析

目的 预测结核分枝杆菌休眠相关蛋白二酰基甘油O-酰基转移酶3(diacyglycerol O-acyltransferase 3,Tgs3)的结构与功能,以期为潜伏结核的治疗及预防提供研究思路。方法 从NCBI网站获取Rv3234c基因及其编码Tgs3蛋白的基本信息;运用ProtParam与ProtScale分析Tgs3蛋白的理化性质和亲疏水性;使用SignaIP-4.1、TMHMM、PSORT进行蛋白信号肽、跨膜结构域及亚细胞定位分析;采用NetPhosBac-1.0、NetOGlyc-4.0 Server预测Tgs3蛋白的磷酸化位点与糖基化位点;使用SOPMA预测Tgs3蛋白的二级结构,运用SWISS-MODEL、I-TASSE进行三级结构建模及分析;利用MEGA、Clustal Omega软件进行氨基酸序列分析;利用STRING、David数据库分析蛋白相互作用网络;使用IEDB网站预测Tgs3蛋白的B、Th细胞及CTL细胞抗原表位。结果 Tgs3蛋白由271个氨基酸组成,分子质量为30.378 83 ku,理论pI值9.83,分子式为C1345H2176N402O390S5,为亲水性蛋白;该蛋白不含信号肽,为非分泌蛋白,定位于细胞质;Tgs3具有多个磷酸化与糖基化位点;二级结构主要由α螺旋(43.17%)、无规卷曲(38.75%)组成,三级结构分析显示Q138-N142-G14、F12-M22-Q138为Tgs3蛋白的配体结合位点;Tgs3蛋白与Rv1425氨基酸序列相似性较高,与DGAT1、DGAT2相似性较低;Tgs3含有多个优势B细胞及T细胞抗原表位。结论 生物信息学预测Tgs3蛋白为胞浆蛋白,含有多个磷酸化与糖基化位点,其氨基酸序列与人体二酰甘油酰基转移酶氨基酸序列相似性较低,含有多个B、T细胞抗原表位,为潜伏结核药物及疫苗靶点的研发提供了方向。

炎症性肠病患者应用生物制剂和小分子制剂发生潜伏结核感染再激活风险现状和应对

炎症性肠病(IBD)是一类肠道慢性炎性免疫性疾病。近年来不同靶点的生物制剂和小分子制剂用于治疗IBD,同时也带来机会性感染,其中潜伏结核感染再激活的危害较大。我国是结核病高发地之一,临床医生对生物制剂和小分子制剂诱发的潜伏结核感染再激活高度重视。本文回顾生物制剂和小分子制剂等药物相关的潜伏结核感染再激活的风险,以及国内外指南的诊疗推荐,期望能为IBD合并潜伏结核感染的患者在应用这些药物时提供参考。

结核分枝杆菌PpiA蛋白的生物信息学分析及功能预测

目的应用生物信息学方法对结核分枝杆菌Rv0009基因编码蛋白PpiA的结构与功能进行预测和分析。方法由NCBI数据库中获得Rv0009基因及PpiA蛋白的相关序列信息;运用ProtParam及ProtScale对PpiA蛋白的理化特性和亲疏水性进行分析;运用NetPhos、TMHMM分析PpiA的磷酸化位点及跨膜区结构;分别运用SOPMA、SWISS-MODEL、ABCpred预测PpiA蛋白的二级结构和三级结构;运用SYFPEITHI软件进行抗原表位的预测分析;运用STRING预测PpiA的相互作用蛋白,并对其生物过程进行功能富集分析。结果结核分枝杆菌蛋白PpiA由182个氨基酸组成,分子式为C848H1310N238O267S4,属于稳定的亲水性蛋白;其二级结构中无规则卷曲(Cc)含量占53.85%,α-螺旋(Hh)含量占18.68%,β-折叠(Ee)占20.88%,β-折角(Tt)含量占6.59%。PpiA蛋白无信号肽和跨膜区结构,具有14个磷酸化优势位点;该蛋白含有18个B细胞抗原优势表位以及3个CTL细胞抗原优势表位,其互作蛋白分别为groEL2、groEs、TB18.6、dnak、tpx和tur等,并参与多种生物学过程。结论生物信息学分析PpiA蛋白具有良好的抗原优势表位和氨基酸磷酸化位点,参与分子伴侣介导的蛋白质折叠、抵抗压力以及应激调节等生物学过程,是探索结核分枝杆菌持久性感染机制的重要研究靶标。

潜伏结核感染与肿瘤坏死因子-α拮抗剂

根据结核感染的状态，人群可以分为无结核感染、潜伏性结核、活动性结核和治愈。潜伏结核感染（1atent tuberculosis infection，LTBI）通常是指体内（通常是肺）存在结核杆菌，但仍未出现明显的症状。潜伏感染者的结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）皮试呈阳性，但一般无症状，且痰中也无结核杆菌。这时，机体的抗炎因素和致炎因子往往维持在动态平衡，结核杆菌可以在体内持续存在但不发病，临床表现为潜伏感染。