内皮抑制素蛋白质的制备及生物学活性测定(英文)

目的:探讨内皮抑制素蛋白质的制备及其对血管内皮细胞的生物学活性作用。方法:通过限制性内切酶酶切反应、聚合酶链式反应、DNA测序及用NCBIBLAST软件与基因库序列比较的方法进行鉴定,鉴定后在大肠杆菌中扩增,用质粒纯化试剂盒抽提纯化;将纯化的pBlast-hEn-dostatin转染人成纤维细胞,用超滤和亲和层析法初步提纯转基因成纤维细胞产生的内皮抑制素蛋白,用Rt-PCR、Western-Blot和免疫组化检测内皮抑制素的表达,用MTT法检测其对人脐静脉内皮细胞的抑制作用。结果:实验证实质粒pBlast-hEndostatin含有人内皮抑制素基因。转染的成纤维细胞可以产生内皮抑制素蛋白,内皮抑制素蛋白质对人脐静脉内皮细胞作用48h2.5,5,10,20,40,80mg/L组抑制率分别为8.5%,13.1%,27.7%,38.1%,56.7%,63.8%,经曲线拟合后,内皮抑制素作用于人脐静脉内皮细胞48hIC50值为34.5mg/L。而内皮抑制素对人成纤维细胞则没有明显抑制作用。结论:转内皮抑制素基因的人成纤维细胞可以表达内皮抑制素蛋白,表达的内皮抑制素蛋白对人脐静脉内皮细胞有生长抑制作用,而对人成纤维细胞没有生长抑制作用。

生物技术药物生物学活性测定方法研究进展

生物技术药物的活性测定在质量控制中至关重要。目前的生物活性分析方法主要包括体内(动物)和体外(细胞)实验。基于细胞的活性测定方法由于其具有操作简便、周期短、成本低、高通量、变异度小等优点,正广泛地替代动物实验。为了获得强反应性的细胞系和简便易行的检测方法,构建转基因细胞系成为较好的选择。本综述主要论述了生物技术药物活性测定方法的现状及发展趋势,概括了基于细胞系的活性测定方法的种类和检测方法,以及转基因细胞系的应用进展。

体外生物学活性测定法试验数据分析流程探讨

目的:探讨建立规范的体外生物学活性测定法试验数据分析流程。方法:参照美国药典通则<1034>介绍的生物检定试验数据分析流程,选择以抗TNF-α全人源单克隆抗体的体外生物学活性试验数据分析为例,根据其国家药品注册标准、企业内控标准及历史数据制定分析流程中系统适用性和样品适用性等各项评价指标的可接受标准,对1批抗TNF-α全人源单克隆抗体3次独立试验数据按照拟定标准进行分析和评价。结果:抗TNF-α全人源单克隆抗体3次独立测定的结果均符合各项系统适用性和样品适用性评价指标要求,3次独立结果合并计算的效价值和可信区间可作为有效结果出具报告值。结论:本研究参照美国药典尝试建立了规范的抗TNF-α全人源单克隆抗体体外生物学活性试验数据分析流程,以期为其他药品的生物学活性测定试验数据分析提供参考。

肝水解肽生物学活性测定方法的应用

目的:评价近年上市的肝水解肽生物学活性质量及其活性测定方法的应用。方法:应用正常人肝L02细骨包/WST-8比色法测定不同厂家的肝水解肽生物学活性,比较各个厂家产品质量以及评价该生物学活性测定法的应用情况。结果:共测定了10个厂家43批肝水解肽生物学活性,其中35批产品具有促进肝细胞生长的生物学活性,4个厂家的8批产品无促进肝细胞生长的生物学活性。不合格产品中有1个厂家的2批产品已过效期,3个厂家的6批产品均在效期内。结论:该法可用于肝水解肽生物学活性的测定,是否在有效期内对样品的活性无明显影响。

MTT比色法在干扰素生物学活性测定中应用的探讨

目的探讨MTT比色法能否提高干扰素的生物学活性测定(细胞病变抑制法)结果的准确性。方法比较在干扰素的生物学活性测定后期,采用结晶紫染色脱色后比色的方法(方法一)和采用加入噻唑蓝(MTT)后裂解比色的方法(方法二),经过6次的比较证明两种方法哪种测定的结果的准确性更高。结果采用方法一测得的多次结果之间产生的偏差较大,单次结果的可信度较低;而采用方法二测得的多次结果之间产生的偏差较小,单次测定结果的相关系数R值不因方法的改变而有所降低,单次测定结果的准确度较高。结论采用MTT比色法可提高干扰素的生物学活性测定结果的准确性。

鼠神经生长因子生物学活性测定方法的研究

目的建立一个简单、稳定、重复性好的鸡胚背根神经节培养法测定m NGF活性的实验方法。方法通过对鸡胚运输温度控制、神经节分离和接种时间限制、培养结果观察时间摸索、活性测定的浓度范围、重复性等试验,建立了鼠神经生长因子生物学活性的测定方法。结果该方法具有操作简便,灵敏度高、重复性好、测试结果准确的特点。结论采用鸡胚背根神经节培养法可有效测定鼠神经生长因子的生物学活性。

重组人白细胞介素10在毕赤酵母中的表达及生物学活性测定

目的在毕赤酵母中分泌表达具有生物学活性的重组人白细胞介素10(rhIL-10),用于IL-10的生理功能研究和动物试验。方法通过PCR扩增IL-10基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点处,再将融合基因αIL-10重组到表达质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,SalⅠ酶切线性化重组质粒IL-10/pPIC9K,电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的基因IL-10,甲醇诱导rhIL-10的表达,SDS-PAGE和Westernblot鉴定目的蛋白,用ELISA定量测定及MC/9细胞分析IL-10生物学活性。结果成功构建了重组表达质粒IL-10/pPIC9K,获得了4个含IL-10基因的高拷贝毕赤酵母转化子,甲醇诱导后,在摇瓶水平的IL-10表达量为(0.627±0.09)mg/L,比活性为1.5×105U/mg。结论毕赤酵母分泌表达的IL-10具有良好的生物学活性。

基于报告基因的重组人促卵泡激素Fc融合蛋白生物学活性测定方法研究

目的:利用转基因细胞法建立重组人促卵泡激素Fc融合蛋白(rhFSH-Fc)生物学活性检测方法。方法:利用CHO-K1-FSHR-CRE-Luc转基因细胞,按一定细胞密度种板,培养16~20 h后吸弃培养基,将rhFSH-Fc倍比稀释加入细胞板,药物作用一段时间后加入荧光素酶检测试剂,通过荧光素酶检测系统对rhFSH-Fc进行生物性活性检测,并对各试验条件参数优化及进行方法学验证。结果:rhFSH-Fc在该方法中存在量效关系且符合四参数曲线方程,R;大于0.99;方法优化后确定细胞种板密度为5×10^(5)个·mL^(-1),rhFSH-Fc稀释起始浓度为750 ng·mL^(-1),1∶5倍的稀释倍数,诱导时间为4 h,样品稀释液为DMEM/F12K+10%FBS。该方法具有良好的专属性,9次独立日间、日内精密度检测RSD均小于5%,5个不同稀释组回收率样本经6次测定,相对效价分别为(51±2.00)%、(78±2.05)%、(94±2.23)%、(124±3.46)%、(141±4.45)%;对应回收率平均值分别为(101±3.94)%、(104±3.00)%、(94±2.24)%、(99±2.68)%、(94±3.03)%,RSD均小于4%。结论:本研究利用转基因细胞成功建立rhFSH-Fc生物学活性测定方法,该方法操作简便,重复性好,准确性高,可用于rhFSH-Fc产品的常规检测。

新型人干扰素α_(1c)的纯化和活性测定

目的在大肠杆菌中表达和纯化一种新型的人ＩＦＮα１ｃ。方法首先建立了表达和纯化ＩＦＮα１ｃ的实验室生产流程。根据干扰素的抗病毒、抗细胞增殖以及免疫调节特性，体外测定这种ＩＦＮ的生物学活性。结果ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹均证实，表达产物具有干扰素的免疫反应性。ＶＳＶ－ＷＩＳＨ系统的抗病毒测活表明，表达的 ＩＦＮα１ｃ（３． ２ × １０７）的抗病毒活性较 ＩＦＮα１ｂ（１． ０ × １０７－ １． ８ × １０７）略高；而抗 Ａ５４９细胞的增殖能力则与后者相当。此外ＩＦＮα１ｃ还能增强ＮＫ细胞的杀伤活性。结论本系统成功地在大肠杆菌中表达了人ＩＦＮα１ｃ。这种高比活性的干扰素可能成为临床治疗的侯选者。

报告基因法检测促胰岛素分泌肽融合蛋白生物学活性

目的:建立报告基因法检测促胰岛素分泌肽融合蛋白(Exendin-4-HSA,Byetalog)生物学活性。方法:将胰高血糖素样肽-1受体(glucagon-likepeptide 1 receptor,GLP-1R)表达载体和c AMP反应元件(c AMP response element,CRE)报告基因载体共转染CHO-K1细胞,经加压筛选和单克隆分离培养获得稳定的单克隆细胞株;使用药物反应强的单克隆细胞株建立报告基因方法;对新建方法进行条件优化,并用优化的方法对促胰岛素分泌肽融合蛋白原液和成品进行生物学活性测定。结果:经加压筛选和单克隆分离培养后获得对Byetalog强反应性的细胞株CHOglpar/crec14;新建方法剂量反应曲线符合四参数方程,R^2大于0.99;对促胰岛素分泌肽融合蛋白的原液和成品分别测定3次,RSD值均低于5.0%,回收率在70%~130%之间。结论:报告基因法操作简便,重复性和准确性都较高,有望作为替代方法应用于促胰岛素分泌肽融合蛋白的生物学活性测定。

注射用特立帕肽体外生物学活性方法研究

目的:按照美国药典(USP)与《中华人民共和国药典》(CHP)生物制品生物活性方法验证指导原则,进行注射用特立帕肽体外生物学活性检测方法研究。方法:基于UMR106细胞生色底物法进行注射用特立帕肽生物学活性检测及方法学验证。结果:优化后的方法简便高效,可准确检测重组特立帕肽生物学活性。该方法专属性较好,2名实验员各进行3次独立日间、日内精密度检测,RSD均<20%。准确度和线性较好,对50%,60%,100%,120%和130%这5个不同浓度稀释组样品各进行3次回收率测定,相对效价平均值分别为(46±2.08)%,(51±6.03)%,(99±12.10)%,(113±3.79)%,(131±6.93)%;对应回收率平均值分别为(91±4.16)%,(86±10.05)%,(99±12.10)%,(94±3.16)%,(101±5.33)%,各组样品RSD均<20%,线性相关系数R~2=0.991 1。该方法具有较好的重复性、耐用性,12次独立重复实验RSD均<10%,对不同型号仪器检测、细胞代次、药物孵育时间等条件的改变均有较好的耐用性。结论:本研究所优化的方法能够满足特立帕肽的工艺控制和放行检验需求。

肝水解肽体外活性测定方法的探讨研究

目的:建立肝水解肽体外生物学活性测定方法。方法:将不同浓度肝水解肽作用于正常人肝L02细胞,WST-8比色法测定L02细胞增殖情况。同时对实验条件,包括稀释液、细胞接种密度、药物作用时间等进行探讨,建立肝水解肽体外活性测定方法,并用该方法对2个厂家生产的2批产品进行活性检测。结果:获得了比较稳定可靠的实验参数:稀释液为RPMI-1640培养液,细胞接种密度为4.0×104个.mL-1,药物作用时间为48～72 h,肝水解肽浓度为0.5,0.25,0.12,0.06,0.03,0.015 mg.mL-1。由这些实验参数建立了肝水解肽活性测定方法。用该方法检测的2批产品活性均合格,重复实验3次,每次实验结果均一致,RSD均低于10%。结论:该方法可用于肝水解肽体外生物学活性测定。

成年猪胰岛分离纯化方法的改良

目的:改良成年猪胰岛分离纯化技术,以优化胰岛制备方法方法:采用体、尾部区段猪胰腺胰管内灌注复合胶原酶震荡消化(胶原酶V+DNA酶)和改进的Dextran不连续密度梯度离心法分离纯化猪胰岛,并进行生物学活性测定和形态学观察.结果:胰腺被消化组织平均15±3.4g,消化后胰岛获得量4130±976IE/g胰腺组织.纯化后胰岛获得量为2320±669IE/g胰腺组织,胰岛纯度80%左右.胰岛素释放试验结果显示分离纯化后胰岛功能良好.病理切片,HE染色显示细胞团结构完整,细胞核清晰可见,胞质丰富.结论:经本方法分离纯化获得的猪胰岛具有较高的产量和纯度、结构完整、功能良好,可满足大动物移植实验和临床移植的需要.

重组人表皮生长因子生物活性检测方法的建立及与其他显色方法的比较

目的建立重组人表皮生长因子(recombinant human epidermal growth factor,rh EGF)生物学活性的检测方法,并与其他4种常见显色方法进行比较。方法参考《中国药典》三部(2015版)附录3528中3T3细胞/MTT显色法,建立rh EGF生物学活性的检测方法,去除细胞饥饿的步骤,并用10%SDS代替DMSO,同时对培养3T3细胞的PRIM1640培养液的胎牛血清浓度(0、2%、5%、10%)进行优化。采用优化方法及药典方法同时检测rh EGF标准品,对灵敏度、信噪比、线性及孔间变异度进行比较。分别采用优化方法、MTS显色法、CCK-8显色法、结晶紫显色法、Cell Titer-Glo显色法检测同批rh EGF供试品,比较各方法的检测结果。结果优化方法的灵敏度(半数有效浓度为2.84 IU/m L)、信噪比(1.40)、线性(R2>0.99)和孔间变异度(95%可信区间为1.576%~3.334%)均优于药典方法,且实验周期由6 d缩短为5 d。5种显色方法对rh EGF供试品的检测结果差异无统计学意义(P>0.05),CCK-8显色法检测结果的变异系数(CV)最小(16.8%),结晶紫显色法的CV值最大(23.3%)。结论优化方法更适用于rh EGF制品的常规生物学活性检测,且与其他4种显色方法等效。

斑马鱼高血脂模型在山青之片质量控制中的应用研究

目的:探讨斑马鱼高血脂模型在山青之片质量控制中的应用。方法:用高脂肪饮食诱导的斑马鱼高血脂模型对山青之片进行生物活性评价和质量稳定性检测。结果:斑马鱼高血脂模型作为降血脂药物生物学质量内控检测方法具有较好的可重复性(RSD为3.5%)及稳定性(RSD为3.6%);不同批号山青之片具有较好的质量稳定性,其血脂降低率平均值为60.8%(P<0.001),RSD为1.9%;同批次山青之片供试品溶液室温放置8 h以内质量稳定,血脂降低率平均值为60.5%(P<0.001),RSD为3.1%。结论:用斑马鱼高血脂模型评价中药山青之片的降血脂效果,方法快速、稳定可靠;应用斑马鱼模型建立中药的生物学质量标准有助于推动中药的现代化,值得尝试和推广。

聚乙二醇化重组人白细胞介素-6工作标准品的制备

目的制备重组人白细胞介素-6(Recombinant human interleukin-6,rhIL-6)和聚乙二醇化rhIL-6(PEG-rhIL-6)理化工作对照品和rhIL-6冻干体外生物学活性工作标准品,用于PEG-rhIL-6制备过程中各步样品纯度、理化指标及体外生物学活性测定。方法制备rhIL-6和PEG-rhIL-6,并对其进行全面检定,作为理化工作对照品。另取精确定量的rhIL-6,用含冻干保护剂的缓冲液稀释分装冻干,制成冻干制品后对其进行全面检定及稳定性考察,作为体外冻干生物学活性工作标准品。结果两种理化工作对照品和冻干体外生物学活性工作标准品各项常规检测指标均符合暂定规程要求;两种理化工作对照品结构分析结果证实与理论值相符;冻干体外生物学活性工作标准品加速稳定性试验证明其体外活性稳定。结论制备的两种理化工作对照品和冻干体外生物学活性工作标准品可用于PEG-rhIL-6中试工艺的研究和评价。