乳鼠心肌细胞的体外培养及生物学特性研究

目的探讨乳鼠心肌细胞的体外培养方法并对其生物学特性进行观察。方法1～3日龄新生SD大鼠10只,用无酶消化法行含血清培养基原代心肌细胞培养,连续观察细胞生长及传代情况40天。α-横纹肌肌动蛋白抗体标记培养细胞,以流式细胞仪行心肌细胞纯度鉴定,Giemsa染色观察培养心肌细胞形态,吖啶橙-碘化丙啶(AO-PI)染色法检测培养细胞活性。记录培养心肌细胞总数,计算单个乳鼠心脏细胞产量。结果原代组织块和单个心肌细胞在接种后24～48h贴壁,其中部分出现搏动并持续至观察期末。培养细胞群鉴定心肌细胞纯度为94.1%,活细胞比例95.3%,95%可信区间(CI)为91.6%～99.0%。平均每个乳鼠心脏单细胞产量为3.3×106个,95%CI为2.1×106～4.5×106个。结论无酶消化法培养的乳鼠心肌细胞纯度、活力及产量能够满足心肌细胞研究的需要。

纸片法卫星试验对流感嗜血杆菌鉴定的影响探讨

目的探讨如何正确鉴定流感嗜血杆菌,提高流感嗜血杆菌的检出率。方法收集经全自动细菌鉴定仪鉴定为流感嗜血杆菌,但脑心琼脂平板纸片法卫星实验阴性的18株流感嗜血杆菌,分别进行纸片法卫星试验。结果 1)0.5麦氏浓度组中48 h试验组与24 h试验组进行比较,差异有统计学意义(P<0.05);72 h试验组与24 h试验组进行比较,差异有统计学意义(P<0.01);72 h试验组与48 h试验组进行比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2)1个麦氏浓度24 h试验组与标准方法试验组相比较,差异无统计学意义(P>0.05);3个麦氏浓度24 h试验组与标准方法试验组相比较,差异有统计学意义(P<0.01)。3)3个麦氏浓度48 h试验组与3个麦氏浓度24 h试验组相比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 1)当纸片法卫星试验孵育时间为24 h时,将待检菌浓度由0.5麦氏单位调整为3麦氏单位,可提高试验阳性率。2)当纸片法卫星试验待检菌浓度为0.5麦氏单位时,孵育时间延长为48 h,可提高试验阳性率。3)当纸片法卫星试验待检菌浓度为3麦氏单位,孵育时间分别为24、48及72h时,试验阳性率无差异。

清洁级BALB/c近交系小鼠常规生物学特性研究

目的建立BALB/c近交系小鼠常规生物学特性指标。方法采用日本光电MEK-5126血球计数仪、荷兰半自动生化仪、流式细胞仪及常规的实验方法检测。结果血液细胞计数、血液生化指标、体重、脏器重量、脏器指数等常规生物学指标结果比较均一;清洁级BALB/c近交系小鼠的血液细胞计数和血液生化指标同普通级BALB/c近交系小鼠比较差异显著;普通级的CD4+/CD8+指标雌雄之间及普通级与清洁级的CD4+/CD8+差异显著。结论清洁级BALB/c近交系小鼠具有比较稳定的生物学特性。

鼠肺表面活性物质结合蛋白D提取方法的改良及鉴定

目的:提取及纯化SD大鼠肺灌洗液中表面活性物质结合蛋白D(SP-D)。方法:取SD大鼠肺泡灌洗液,经Tris-HCl-EDTA法提取和maltose-agarose亲和层析法纯化SP-D,用SDS-PAGE电泳及SP-D与幽门螺杆菌的玻片凝集试验鉴定。结果:从SD大鼠肺灌洗液中提取出较高浓度的蛋白,经SDS-PAGE电泳检测,分子量约43 kD,提取的蛋白可与幽门螺杆菌发生明显凝集。结论:采用maltose-agarose亲和层析法可以从SD大鼠肺灌洗液中获得较高纯度的SP-D。

黄连抑菌效力生物检定方法的研究

目的探讨管碟法用于测定黄连抑菌效力的可行性。方法以盐酸小檗碱为工作参照物、抑菌圈直径(D)为反应值,按《中国药典》2010年版二部(附录Ⅺ)抗生素生物检定法(管碟法)的三剂量法设计试验,对黄连样品的抑菌效力进行测定。结果盐酸小檗碱在4.00～12.50μg/mL、黄连样品溶液在66.0～200.0μg/mL时,其相应浓度的对数值与抑菌圈D呈现良好的线性关系(r=0.998 9、0.999 0)。三剂量法实验剂间变异分析及可靠性测验结果表明回归非常显著(P<0.01),偏离平行、二次曲线、反二次曲线均不显著(P>0.05),组内(碟间)差异有统计学意义(P<0.01);可信限为1.884 5%。1 mg盐酸小檗碱抑菌效力相当于15.98 mg的黄连。结论管碟法能用于黄连抑菌效力的检测,可作为黄连品质评价的一种新方法。

质谱快速鉴定血培养阳性标本的方法研究

目的建立快速、精准的细菌质谱鉴定方法,以缩短血培养阳性的实验周转时间。方法共收集血培养阳性瓶91个(活性炭吸附瓶),采集培养液分别转种肉汤和血平板增菌培养4 h后,用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行菌种鉴定。以血平板培养24 h的质谱鉴定结果为对照,比较2种方法细菌质谱鉴定符合率。结果 91株细菌包括51株革兰阴性菌和40株革兰阳性菌。4 h肉汤增菌法和4 h血平板培养法鉴定到种的符合率分别为46.15%和89.01%,无鉴定结果率分别为47.25%和3.30%,错误鉴定率分别为3.30%和4.40%。2种方法鉴定到种的符合率比较,差异有统计学意义(P <0.05),4 h血平板培养法鉴定到种的符合率高于4 h肉汤增菌法。2种方法对革兰阴性菌鉴定到种的符合率分别为58.82%和94.12%,差异有统计学意义(P <0.05),4 h血平板培养法高于4 h肉汤增菌法。2种方法对革兰阳性菌鉴定到种的符合率分别为30.00%和82.50%,差异有统计学意义(P <0.05),4 h血平板培养法高于4 h肉汤增菌法。结论 4 h血平板培养质谱鉴定法可快速鉴定血培养阳性标本中的病原菌。

线粒体16SrRNA和Cytb基因复合扩增进行种属鉴定

目的建立一种用于种属鉴定的线粒体DNA16SrRNA基因和细胞色素b基因荧光标记复合扩增检测体系。方法利用引物设计软件Primer5.0对mtDNA序列的16SrRNA基因和细胞色素b基因各设计一对引物,建立复合扩增体系,分别扩增人和牛、猪、狗、鸡、草鱼5种常见动物,用310遗传分析仪对产物进行分析。结果人和5种动物DNA扩增产物均出现两个峰,Cytb通用引物的扩增产物为人与动物的共有峰,为358bp;16SrRNA基因的扩增产物为人与动物间存在位置差异的特异峰,位于231～256bp之间。结论该复合扩增体系可以明确区分人和5种动物样本,可用于种属鉴定。

罗红霉素胶囊剂的临床药物动力学及相对生物利用度

目的：进行国产与进口罗红霉素的生物利用度研究。方法：通过交叉试验对８名男性志愿者（２２．６ａ±ｓ２．１ａ）交叉口服罗红霉素３００ｍｇ国产胶囊剂和进口片剂，进行单剂量药物动力学研究。血药浓度采用微生物法进行测定。结果：口服国产胶囊和进口片剂的血药浓度＿时间曲线均符合二室模型，Ｃｍａｘ分别为９．５ｍｇ／Ｌ±１．３ｍｇ／Ｌ与９．０ｍｇ／Ｌ±１．０ｍｇ／Ｌ，Ｔｍａｘ为１．１４ｈ±０．１８ｈ与１．３１ｈ±０．２１ｈ，Ｔ１２β为１３．１ｈ±２．４ｈ与１３．６ｈ±２．２ｈ，ＡＵＣ为１０７ｍｇ·ｈ／Ｌ±２３ｍｇ·ｈ／Ｌ与１０８ｍｇ·ｈ／Ｌ±１４ｍｇ·ｈ／Ｌ。比较２种制剂的药物动力学参数，其差别均无显著意义（Ｐ＞０．０５）。与进口罗红霉素片相比较，国产罗红霉素胶囊剂的相对生物利用度为（９８±１３）％。口服该药４８ｈ尿药回收率为给药量的（１５±５）％。结论：国产罗红霉素胶囊体内过程与进口罗红霉素片剂相仿，２种制剂生物等效。

339株非结核分枝杆菌临床分离株菌种鉴定及耐药性分析

回顾性分析2014年3月至2019年3月天津市海河医院经罗氏培养和"DNA微阵列芯片技术"确定的339株非结核分枝杆菌(NTM),并对其药物敏感性试验(简称"药敏试验")结果进行分析。339株NTM临床分离株中,排在前3位者分别为胞内分枝杆菌38.6%(131/339)、龟-脓肿分枝杆菌21.2%(72/339)、堪萨斯分枝杆菌18.3%(62/339)。体外药敏试验显示胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和龟-脓肿分枝杆菌对8种抗结核药品(异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、对氨基水杨酸、卡那霉素、卷曲霉素、氧氟沙星)耐药率情况为:胞内分枝杆菌的耐药率分别为95.6%(108/113)、82.3%(93/113)、94.7%(107/113)、54.0%(61/113)、92.0%(69/75)、81.3%(61/75)、85.3%(64/75)、87.5%(49/56);堪萨斯分枝杆菌的耐药率分别为100.0%(54/54)、3.7%(2/54)、98.1%(53/54)、11.1%(6/54)、95.0%(38/40)、90.0%(36/40)、27.5%(11/40)、13.8%(4/29);龟-脓肿分枝杆菌的耐药率分别为96.9%(62/64)、93.8%(60/64)、95.3%(61/64)、92.2%(59/64)、88.4%(38/43)、86.0%(37/43)、88.4%(38/43)、87.1%(27/31)。临床分离NTM菌种以胞内分枝杆菌、龟-脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌为主,其中胞内分枝杆菌、龟-脓肿分枝杆菌对常用一线、二线抗结核药品具有较高的耐药性,堪萨斯分枝杆菌对利福平、乙胺丁醇、氧氟沙星、卷曲霉素的耐药率低。

红细胞裂解法分离及培养大鼠骨髓间充质干细胞(英文)

背景:骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量非常少,而且与其他细胞特别是易与红细胞相混杂,因此在分离过程中需去除干扰,以获得尽可能多的高纯度的骨髓间充质干细胞。目的:采用红细胞裂解法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,同时进行生物学鉴定。设计:观察对比实验。单位:中国航天员科研训练中心航天细胞分子生物学实验室。材料:选用50只生后30d的雄性SD大鼠,体质量100g,SPF级,购自北京实验动物中心(合格证:SCXK(京)2002-0003)。DAB浓缩显色液(含过氧化氢,中杉公司),兔抗大鼠多克隆抗体(武汉博士德公司),FCS(PAA,Austria),LG-DMEM培养基(Sigma,USA)。方法:实验于2004-09/2005-09在中国航天员科研训练中心航天细胞分子生物学实验室完成。将大鼠脱臼处死,暴露骨髓腔,收集细胞悬液,采用全骨髓培养法对骨髓间充质干细胞分离与原代培养。①红细胞裂解实验:取A、B、C、D4管分别加入0.5mL过滤并充分吹打均匀后的骨髓冲洗液,分别对应加入红细胞裂解液、氯化氨2mL、磷酸盐缓冲生理盐水2mL和体积分数为0.04的乙酸溶液0.5mL,分别测量各组吸光度值及血红蛋白浓度,并观察细胞生长情况。②骨髓间充质干细胞生长曲线、倍增时间及表面标志分子表达情况的观察:根据公式:群体倍增时间(TD)=t[lg2/(lgNt-lgN0)](N0和Nt分别代表接种后和培养t小时的细胞数),计算出细胞的群体倍增时间并描绘并分析骨髓间充质干细胞第2、4、6代细胞的生长曲线;采用亚甲基兰染色测定骨髓间充质干细胞增殖情况;采用免疫细胞化学染色检测骨髓间充质干细胞表面标志分子表达情况。主要观察指标:①大鼠骨髓间充质干细胞分离和培养的观察结果。②不同处理方法对红细胞的裂解效果及其对骨髓间充质干细胞生长的影响。③第2、4、6代细胞的生长曲线及细胞倍增时间。④大鼠骨髓间充质干细胞表面标志分子表达情况。结果:①大鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养结果:原代培养48h后大部分细胞已贴壁,72h时贴壁细胞已开始分裂增殖。7￣8d后可见有明显集落形成,之后集落迅速增多,不断扩大,互相融合,14～16d时细胞克隆生长稠密。刚传代的细胞呈球形,很快沉降贴壁,少部分圆形细胞悬浮。贴壁细胞均匀分布,3～5d增殖迅速。虽然传代后细胞形态未变,但增殖速度明显增快,约6d长满培养瓶底。②不同处理方法对红细胞的裂解效果及其对骨髓间充质干细胞生长的影响:红细胞裂解液处理组,氯化氨处理组和4%乙酸处理组的血红蛋白浓度明显高于磷酸盐缓冲生理盐水处理组,差异有显著性(P<0.01)。③不同代骨髓间充质干细胞的生长曲线观察结果:第2,4,6代细胞生长曲线基本相同,经过一两天的潜伏适应期后进入对数生长期,第5天达顶点,以后进入平台期(在第5～7天)。第6代骨髓间充质干细胞的潜伏期表现不明显骨髓间充质干细胞的群体倍增时间平均约为34h。④不同代骨髓间充质干细胞的免疫表型鉴定:各代细胞CD44和CD106染色均呈阳性,表现为棕黄色颗粒沉淀,CD34染色呈阴性。结论:采用红细胞裂解液处理骨髓冲洗液后再行接种,能提高骨髓间充质干细胞的贴壁效率,同时不影响其贴壁后的生长,是一种可行的分离方法。细胞表面标记染色鉴定证明,本实验所分离细胞是骨髓间充质干细胞。

海洋生物毒素检测技术研究进展

海洋生物毒素具有分布广、毒性强及解毒难等特性,对我国公共安全和人民健康造成极大的威胁。为了保护我国的公共安全,保障人民健康,对海洋生物毒素检测的研究已经越来越多。目前,海洋生物毒素的检测方法有生物检测法、免疫分析法、液相色谱法、酶活力抑制分析法、细胞毒性试验等。本文将对海洋生物毒素检测技术的研究进展作一综述。

129株非结核分枝杆菌采用两种分子检测技术行菌种鉴定的结果分析

目的分析北京地区3个单位非结核分枝杆菌(NTM)临床分离株采用芯片杂交法(简称“芯片法”)和16SrRNA基因测序(简称“基因测序”)进行菌种鉴定的结果,为临床分枝杆菌病的快速准确诊断提供科学依据。方法用芯片法和基因测序进行北京地区3个单位129株NTM临床分离株的菌种鉴定,实验操作者之间采用双盲法,对两种鉴定方法的结果进行比较和评价。结果129株NTM菌株中,有107株进行分枝杆菌基因测序,其中59株为胞内分枝杆菌(55.1%);29株为堪萨斯分枝杆菌(27.1%);5株为龟分枝杆菌/脓肿分枝杆菌(4.7%);3株为鸟分枝杆菌(2.8%);2株为偶发分枝杆菌(1.9%);2株为戈登分枝杆菌(1.9%);1株为蟾蜍分枝杆菌(0.9%);1株为草分枝杆菌(0.9%);1株为瘰疬分枝杆菌(0.9%);4株为其他NTM(3.7%)。有116株进行芯片法分枝杆菌菌种鉴定,且有96株同时进行芯片法和基因测序法检测,两种方法进行菌种鉴定的符合率为88.5%(85/96)。基因测序发现有3株外来菌株,分别为明尼苏达分枝杆菌、熊本分枝杆菌、提门分枝杆菌(M.temen)。结论北京3家机构NTM菌种以胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和龟分枝杆菌/脓肿分枝杆菌为主。用芯片法和基因测序对NTM临床分离株进行菌种鉴定的一致率较高。

艳山姜药材的生药学鉴定

目的:对贵州产民族药艳山姜进行显微鉴别和质量评价。方法:采用性状、显微鉴别方法,参照2010年版中国药典一部附录方法(水分、挥发油、浸出物、总灰分与酸不溶灰分测定法)对贵州产民族药艳山姜进行质量评价研究。结果:描述了药材性状特征,横切面及粉末显微特征,艳山姜药材的水分、挥发油、浸出物、总灰分与酸不溶灰分测定结果分别在9.41%~10.36%,1.09%~1.15%,11.41%~17.28%,5.67%~7.65%,0.85%~1.09%。结论:研究结果可作为艳山姜药材的鉴别依据。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定食品真菌影响因素的探讨

目的探讨培养基成分、培养时间对基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析真菌的影响以及该法鉴别产毒和非产毒真菌的可能性。方法(1)实验模式菌株红曲菌分别接种于查氏酵母提取粉琼脂培养基(CYA)和麦芽提取粉琼脂培养基(MEA),曲霉属分别接种于CYA、查氏琼脂培养基(CA)、马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基(PDA)和麦芽汁琼脂培养基(MA),青霉属分别接种于CA、CYA和MA培养基,镰孢菌属分别接种于CA、MA和PDA培养基,培养10d(红曲菌)和7d后进行MALDI-TOF-MS分析;(2)模式菌株寄生曲霉接种于PDA培养基,在培养5、7、10和14d时进行MALDI-TOF-MS分析;(3)产毒和非产毒(或低产毒)红曲菌和黄曲霉分别接种于MEA和PDA培养基,培养7d后进行MALDI-TOF-MS分析。结果CYA、PDA、CA和MA分别是红曲菌、曲霉属黄绿组和镰孢菌属、曲霉属黑色组、青霉属进行MALDI-TOF-MS分析的最适培养基;真菌进行MALDI-TOF-MS分析的最佳培养时间为7d;从MALDI-TOF-MS质谱图上尚不能区分红曲菌高产毒株和低产毒株;黄曲霉产毒株和非产毒株的质谱图各异。结论MALDI-TOF-MS进行真菌鉴定时必须对培养基、培养时间进行标化。

中国实验用小型猪成骨细胞的培养与鉴定

目的:分离、诱导培养中国实验用小型猪成骨细胞作为骨组织工程种子细胞,并进行形态学与生物学性能鉴定,为骨组织工程研究提供新型种子细胞。方法:实验于2002-08/2004-08在天津市口腔医院暨天津市整形外科医院中心实验室组织工程实验室完成。采用胶原酶消化法和诱导条件培养法自新生中国实验用小型猪四肢骨松质分离成骨细胞,经细胞生活形态观察、细胞倍增时间测定、透射电镜超微结构分析、裂解上清碱性磷酸酶检测、矿化结节形成测定等方法进行成骨细胞的生物学性能鉴定,以获取中国实验用小型猪成骨细胞作为骨组织工程种子细胞的必备的增殖活性与成骨活性数据。结果:①原代培养中国实验用小型猪成骨样细胞具有很强的贴壁率,细胞分裂旺盛,2～3d即可达到完全融合。细胞形态呈多角形和星形、胞体大、胞核圆,核仁丰富,通常为两三个核仁;胞浆中核周见散在黑色颗粒。②条件培养液诱导后的猪成骨样细胞培养6d左右可见细胞呈旋涡状复层生长,胞突伸展互相连接并集结成细胞簇团,中心区形成褐色结节;细胞核周围胞浆中出现大量黑色颗粒。③细胞增殖曲线显示猪成骨样细胞在播种3d后进入对数生长期,15d左右达到生长峰值U经细胞倍增时间公式计算猪成骨样细胞倍增时间为67.2h。④透射电镜观察显示:中国实验用小型猪成骨样细胞表面突起极丰富;核大,有较多和较深的内陷U核仁大而多窗孔,胞质内细胞器常常分布于核的一侧,扩张的粗面内质网池内有中等电子密度的蛋白质沉淀,其膜表面的核糖体密集分布。Golgi氏复合体发达,并见胞质内微丝及多量的游离核糖体。核仁特征为高转录活动的核仁。细胞外形、核谱型、核位置以及胞质内细胞器的特征性分布符合成骨细胞的超微结构特征。⑤猪成骨样细胞的碱性磷酸酶活性在β-磷酸甘油和地塞米松刺激后3d开始上升,18d达到高峰,21d时开始下降。⑥VonKossa染色显示从培养6d开始,小型猪成骨样细胞培养细胞层出现散在的小矿化结节,以后数量渐多,体积渐大,21d达高峰,体外成骨活性显著。结论:中国实验用小型猪骨松质成骨细胞具备骨组织工程种子细胞必备的增殖活性与成骨活性,适合作为骨组织工程的种子细胞。

人巨细胞病毒地方分离株的鉴定及其UL83序列分析

目的鉴定从合肥市某医院先天性脑瘫患儿尿标本中分离的4株人巨细胞病毒（HCMV）毒株并对其UL83基因序列进行分析，为HCMV感染的预防及pp65蛋白疫苗的研制提供参考依据。方法应用细胞培养法复苏病毒，间接免疫荧光法检测pp65蛋白表达，并用特异性引物对UL73基因进行PCR，扩增的产物经凝胶纯化后测序；序列结果运用DNAMAN软件和GenBank登录的3株代表性HCMV毒株进行核苷酸和氨基酸序列比对。结果HCMV AD169株与HCMV-1分离株的UL83基因核苷酸及编码氨基酸序列的同源性均为100％，与其余3株的同源性也达99．26％～99．69％；4株HCMV分离株与Merlin株、Towne株在相应基因片段核苷酸及氨基酸的同源性最低的分别为98．95％，99．06％。结论UL83序列分析结果表明，HCMV UL83编码pp65蛋白的优势抗原决定簇氨基酸序列无变化。

人骨髓来源内皮前体细胞体外培养和鉴定的研究

目的:明确人骨髓单个核细胞中是否存在内皮前体细胞(EPCs),探讨从人骨髓中分离、培养EPCs的方法及体外进行EPCs的鉴定。方法:采集正常人骨髓单个核细胞进行体外培养,应用流式细胞术进行内皮细胞表面标记物检测,应用免疫荧光术对培养细胞进行内皮细胞功能特性检测。结果:人骨髓单个核细胞经体外培养,收获细胞可以表达内皮细胞的特异性抗原,包括CD34、VWF、KDR等,并显示出能摄取乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL),结合荆豆凝集素(UEA-1)等内皮细胞的特性。结论:人骨髓中存在具有内皮细胞潜能的EPCs,其具有内皮细胞的表型特征和功能,有希望作为种子细胞用于冠心病的血管新生治疗。

ACL-8000血凝仪两种测定纤维蛋白原方法的比较

目的两种方法测定纤维蛋白原(Fg),即Von Clauss法和PT演算法,比较两者差异性,探讨其临床应用。方法 ACL-8000血凝仪的Von Clauss法和PT演算法分别检测不同纤维蛋白原含量的患者血浆。结果当患者Fg含量在2～4g/L之间时,两种方法的测定结果差异无统计学意义(P>0.05)。当患者Fg含量大于4g/L时,两种方法测定结果有显著差异(P<0.05)。结论患者Fg在2～4g/L之间时,可以使用PT-der法替代Von Clauss法检测Fg;患者Fg大于4.00g/L时,不能用PT-der法替代Von Clauss法,PT在大于或等于48s时不能用演算法检测纤维蛋白原。

尿路感染检测方法研究进展

准确快速地识别病原微生物并鉴定抗菌药物的敏感性是尿路感染治疗的关键。目前临床中主要依赖尿常规、尿细菌培养检查来辅助诊断和治疗。但尿常规与尿培养检查通常缺乏时效性和准确性,因此经验抗生素的普遍使用不仅使得病原体耐药越来越严重,也使得患者的就诊花费大大增加。除了控制抗生素的滥用,新型检测手段的探索更成为尿路感染诊疗的关键。现阶段侧流免疫层析、流式细胞术、质谱、PCR等应用将提高病原体鉴定的时效性和精确性,从而对改善公共健康以及实现精准医疗提供了可能。