薄层色谱直接生物自显影方法(TLC-Bioautography)在抗菌剂分析中的应用

生物自显影法(Bioautography)是在复杂的基质中检测物质对生物体的生长速率和检测生物活性。这种技术主要用于研究源于植物、微生物、组合化学的活性物质来寻找新的具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤及抗蚤状幼体寄生虫活性的复合物,调查废水、饮用水、体液、饲料和食品中的抗生素及抗生素药品的质量控制,寻找能有效对抗植物致病细菌及真菌的抗生素类化合物,检测毒物(如黄曲霉毒素)及光毒性化合物(如呋喃香豆素)。本文讨论了生物自显影法的三种形式,即接触法,浸润法和直接法,重点讲述了直接法及其应用,包括测试各种类型的化合物,也包括研究生化过程及影响细菌生长的因素。

西索米星发酵液的薄层层析生物显影测定

通过对检定菌的敏感性，检定培养基、展开剂和发酵液样品等影响因素的考察，建立了一种检测发酵液中西索米星浓度的方法。采用短小芽孢杆菌为生物显影检定菌，双层琼脂扩散法于37℃培养16～18h，控制检定培养基的PH为7．5～8．0，发酵液样品pH为4．5～7，0，展开剂为15％的KH2PO4，点样量为10μl，薄板和菌层接触时间为20min等检定条件，能用于发酵液中西索米星效价的直接测定，其线性回归方程为 Y＝0．0115X＋1．747，r=0．9877。在相同条件下，对536μg/ml的西索米星标准液连续测定6次，测定结果为（531．0 ±12．7）μg/ml，RSD=3．28％，该法具有较高的实验重复性和准确性，分析稳定性基本符合要求。

TLC-生物自显影检测26种植物中的抗细菌和抗氧化活性物质

我国华南地区植物资源丰富,为快速筛选和检测具有抗菌和抗氧化活性的植物资源,本研究采用甲醇冷浸提取法制备植物提取物,并采用TLC-生物自显影法快速检测其抗细菌和抗氧化活性。活性测定的结果表明,豺皮樟和桂木的抗细菌活性最强,对所有供试细菌均表现出抑制活性,且抑菌斑的最大直径均大于10 mm。红果仔、锡叶藤和山油柑也对所有供试细菌表现出抑制活性,但其活性弱于豺皮樟和桂木。粪箕笃、海金沙和小蜡未表现出任何抗细菌活性,其他供试植物对部分供试细菌表现出抑制活性。白花酸藤子、海南杜英、黄牛木、山油柑和基及树表现出较好的抗氧化活性,抗氧化斑的R_f值范围为0.0～1.0,说明具有较多的活性化合物。TLC-生物自显影法能够快速、有效地筛选和检测具有抗细菌和抗氧化活性的植物提取物,本研究结果为植物资源的开发和利用提供重要的理论依据。

改良TLC-生物自显影引导裸脚菇中抗青、绿霉物质的分离

目的:分离和追踪野生裸脚菇属(0612-9)中抗青、绿霉活性物质。方法:采用正相硅胶柱色谱、ODS柱色谱、半制备HPLC等分离活性成分,用改良薄层色谱-生物自显影(即浇注法)追踪活性成分,牛津杯法、薄层色谱-紫外荧光法、10%浓硫酸乙醇显色等方法作为验证方法。结果:共制备5种化合物,分别为Ⅰ1.1、Ⅰ1.2、Ⅰ2、Ⅰ3和Ⅱ,改良TLC-生物自显影追踪到4种抗菌活性物质,即Ⅰ1.1、Ⅰ2、Ⅰ3和Ⅱ,样品检测量低至18.6μg/mL。结论:本方法具有清晰、准确的优点,适于引导中度极性活性物质,如该裸脚菇抗菌活性物质等的分离。

饲料中T—2毒素检测法的最佳选择

由镰刀菌、木霉等霉菌所产生的T—2毒素及其它单端孢烯霉菌毒素,是饲料的污染物。其特点是,毒性大,对农畜的损害极其严重。为预防该类毒素的中毒,必须有系统地进行饲料中霉菌毒素的检测。俄特列马索夫等对几种T—2毒素检测法作了比较。结果表明:薄层色谱法,当T—2毒素含量【500—800μg/Kg时,就检测不出来,且检测时间要6—7小时,此法适于T—2毒素污染严重的饲料,即】1000μg/Kg情况下的检测;气液色谱法,谷粒中T—2毒素在50μg/Kg时就能检测出来。

薄层色谱生物自显影法检测豆豉中乙酰胆碱酯酶抑制剂的研究

分别采用两种薄层色谱生物自显影法检测豆豉中乙酰胆碱酯酶抑制剂,结果表明两种方法均能较好检出豆豉中的抑酶组分,薄层色谱生物自显影法(二)深色背景与白色斑点对比更明显,检测效果更好。与薄层色谱生物自显影检测法相比,微孔板法的检测限更低,但最终检出所需试样量却更大。实验表明,采用薄层色谱生物自显影法检测豆豉中乙酰胆碱酯酶抑制剂是一个快捷、简便、高效的方法。

基于网络药理学和分子对接探讨多刺绿绒蒿中碎叶紫堇碱治疗氧化应激相关性疾病的作用机制

目的检测多刺绿绒蒿中碎叶紫堇碱的含量并探索碎叶紫堇碱的抗氧化活性,利用网络药理学和分子对接技术探索碎叶紫堇碱通过抗氧化作用对治疗糖尿病(DM)、颅内动脉瘤(IA)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和动脉瘤性蛛网膜下腔出血(aSAH)的作用机制,为多刺绿绒蒿用于治疗氧化应激性相关疾病提供依据。方法采用高效液相色谱-质谱联用仪(HPLC-MS/MS)对多刺绿绒蒿中碎叶紫堇碱的含量进行测定;通过TLC-生物自显影法判定其抗氧化活性;使用SuperPred、Genecards和DisGeNET等在线数据库搜集碎叶紫堇碱的靶点和治疗DM、IA、COPD和aSAH的靶点,构建碎叶紫堇碱治疗疾病的“化合物-靶点-疾病”图和蛋白互作网络;基于Metascape数据库和CytoNCA插件进行KEGG通路富集分析;使用Discovery Studio 2019 Client软件对活性成分与潜在靶点进行分子对接验证结合活性。结果研究显示多刺绿绒蒿中碎叶紫堇碱的含量为0.1137μg/mL;TLC-生物自显影结果显示碎叶紫堇碱具有抗氧化活性;通过网络药理学分析获得碎叶紫堇碱治疗以上4种疾病的34个核心靶点;KEGG通路结果显示参与癌症途径、PI3K-Akt信号通路等118条KEGG通路;分子对接结果显示碎叶紫堇碱与SRC、RPS6KB1、ITGB1等蛋白结合稳定。结论多刺绿绒蒿中碎叶紫堇碱含量相对较高且通过多靶点、多途径发挥抗氧化的作用。

9种夹竹桃科和大戟科植物抗菌和抗氧化活性测定

【目的】筛选具有抗菌和抗氧化活性的植物次生代谢产物,为夹竹桃科和大戟科植物资源的开发和利用提供理论依据。【方法】以华南地区常见的5种夹竹桃科植物和4种大戟科植物为研究对象,采用甲醇冷浸提取和乙酸乙酯萃取方法制备植物提取物,以薄层层析(TLC)—生物自显影法测定9种植物提取物的体外抗细菌和抗氧化活性,通过斑点及斑点的迁移率(R_f)初步评价样品中化合物的极性和活性,根据抑菌斑大小评价化合物的活性。【结果】除银柴外,其余8种植物提取物对供试细菌均表现出一定的抑制活性,其中红背桂、红背山麻杆和蝴蝶果对7种供试细菌均表现出较强的抑菌活性,且红背桂和蝴蝶果提取物的抑菌斑直径超过10 mm,R_f集中在0~0.13,说明活性化合物极性偏大。除夹竹桃科的羊角坳外,其余8种植物提取物均表现出一定的抗氧化活性,其中红背山麻杆的抗氧化活性最强,R_f为0~0.52,抗氧化斑直径为5~10 mm。【结论】TLC-生物自显影法能够快速检测和筛选具有抗菌和抗氧化活性的植物提取物。红背山麻杆、红背桂和蝴蝶果可作为抗细菌的候选植物资源利用,红背山麻杆可同时作为优良的抗氧化植物资源利用。

藏药中乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选

目的:从8种藏药中筛选对乙酰胆碱酯酶具有高抑制活性的提取物。方法:药材经乙醇提取、酸碱处理、氯仿和正丁醇萃取后,得到氯仿部分和正丁醇部分。各部分用薄层色谱生物自显影法初步筛选其乙酰胆碱酯酶抑制活性,再用改良的Ellman法进一步测定抑制率及半数抑制浓度(IC50)。结果:8种藏药生物碱提取物的氯仿部分有不同程度的乙酰胆碱酯酶抑制活性,其中止泻木Holarrhena antidysenterica、秦艽花Gentiana straminea、山莨菪Anisodus tanguticus抑制活性最强,IC50分别为6.32,28.20,34.80 mg·L-1。正丁醇部分中,山莨菪的抑制活性显著,IC50为51.70 mg·L-1。结论:止泻木、秦艽花、山莨菪具有显著的乙酰胆碱酯酶抑制活性,说明其含有抑制乙酰胆碱酯酶的成分,为进一步跟踪分离活性成分奠定基础。

维药骆驼蓬草质量标准研究

目的:建立维药骆驼蓬草的质量标准。方法:参照2010年版《中国药典》附录相关方法,对骆驼蓬草水分、总灰分、水溶性浸出物、酸不溶性灰分和重金属进行检测。采用硅胶HSGF254薄层板上,以乙酸乙酯-甲醇-氨水(10∶1.5∶0.5)为展开剂,分别采用置紫外光(254 nm)下检视、碘化铋钾显色以及乙酰胆碱脂酶导向的薄层色谱-生物自显影技术对骆驼蓬草进行鉴别。采用C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),以甲醇-0.1%三氟乙酸溶液(15∶85)为流动相,在280 nm波长下对骆驼蓬草中活性成分鸭嘴花碱进行定量分析。结果:采用紫外光(254 nm)下检视及乙酰胆碱脂酶生物自显影技术可对骆驼蓬草中的活性成分进行定性鉴别。鸭嘴花碱在0.7923～792.3 mg.L-1呈良好的线性关系,方法平均回收率为101.6%,RSD为1.9%,方法的日内和日间精密度均小于2%。10批骆驼蓬草中鸭嘴花碱质量分数在0.23%～1.47%,波动较大。结论:根据结果制定了药材中鸭嘴花碱的质量分数限度不得低于0.6%。水分、总灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物分别不得过10.0%,20.0%,1.7%和30.0%。重金属铅、镉、砷、汞、铜分别不得过5,3,2,2,20 mg.kg-1。建立的定性和定量方法可用于维药骆驼蓬草药材的质量控制。

维药骆驼蓬子药材质量标准研究

摘要：目的建立骆驼蓬子药材的质量标准。方法参照2010年版《中国药典》附录相关方法，对骆驼蓬子水分、总灰分、酸不溶性灰分、50％乙醇浸出物和重金属进行检测。采用硅胶HSGF。薄层板，以乙酸乙酯-甲醇-氨水（10：1．5：0．5）为展开剂，分别采用置紫外光（254、365nm）下检视、碘化铋钾显色及乙酰胆碱酯酶生物自显影技术对骆驼蓬子进行鉴别。采用C18色谱柱，以乙腈一醋酸铵缓冲盐（19：81）为流动相，检测波长为330nm，建立骆驼蓬子中去氢骆驼蓬碱（HAR）和骆驼蓬碱（HAL）的定量分析方法；以相同流动相梯度洗脱，检测波长为280nm，流速为0．7mL·min-1，建立骆驼蓬子药材特征图谱。结果采用紫外光（254、365nm）下检视、碘化铋钾显色及生物自显影技术联合分析可鉴别骆驼蓬子中的活性生物碱类成分。骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱分别在1．97—198．68和1．70～345．30I,zg·mL“内呈良好的线性关系，平均回收率分别为99．69％（RSD为1．89％）和100．66％（RSD为1．78％）。11批骆驼蓬子药材中去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱平均含量分别为3．76％和3．23％。在特征图谱中确定了4个峰为特征峰。结论药材中水分、总灰分、酸不溶性灰分、体积分数50％乙醇浸出物分别不得过9．0％、8．0％、1．0％和22．0％。重金属铅、镉、砷、汞、铜分别不得过5×10^-6、3×10^-6、2×10^-6、2×10^-6和20×10^-6。骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱的含量总和限度不得低于5．5％。以骆驼蓬碱为参照物峰，特征图谱中4个特征峰的相对保留时间应在各规定值的±5％之内。建立的定性和定量方法可用于骆驼蓬子药材的质量控制。