氧氟沙星单克隆抗体的制备及生物条形码检测技术的研究

目的制备氧氟沙星单克隆抗体,采用生物条形码技术测定氧氟沙星残留量。方法采用碳二亚胺法合成氧氟沙星完全抗原后,用免疫原免疫小鼠,将特异性强的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合。通过杂交瘤细胞的多次“筛选-亚克隆”过程,制备氧氟沙星单克隆抗体。其次,制备纳米金复合探针、磁性纳米探针,建立基于荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的生物条形码检测方法,在最优条件下采用荧光定量PCR生物条形码检测方法间接测定动物源性食品中氧氟沙星残留量。结果氧氟沙星线性回归方程为Y=14.4263logX+0.09184,r^(2)=0.96。在0.1~128.0 ng/mL范围内,检出限为1.14 ng/mL,添加回收实验结果显示,氧氟沙星平均回收率和相对标准偏差分别为85.8%~102.6%、1.8%~2.6%。结论基于荧光定量PCR生物条形码免疫分析方法检测氧氟沙星的结果可靠,能够应用于实际样品的检测,为氧氟沙星的检测技术提供新的方向。

环丙沙星生物条形码检测技术的研究

该文对快速检测食品中环丙沙星残留的生物条形码检测技术进行研究。首先将环丙沙星多克隆抗体与条形码DNA链共同修饰在纳米金颗粒上制备纳米金复合探针、环丙沙星单克隆抗体与磁性颗粒结合制备磁性探针,然后对其采用可见光光谱法、透射电镜法进行鉴定;其次将上述探针与环丙沙星标准品进行杂交反应,在磁场的作用下,去除未结合的纳米金复合探针,然后收集标记成功的纳米金复合探针释放出的DNA链,采用微孔板银染的生物条形码技术进行检测,得到环丙沙星残留量。检测环丙沙星的最低检出限为2.13 ng/mL。该方法与常规免疫检测方法相比灵敏度增强,具有实用性,为未来检测小分子物质残留量提供了新思路,也为制备环丙沙星生物条形码检测试剂盒奠定了基础。

基于纳米生物条形码和杂交链式反应构建电化学生物传感器用于蛋白激酶活性分析

该文结合纳米生物条形码和杂交链式反应(HCR)双重信号放大策略构建了一种电化学生物传感器用于蛋白激酶A(PKA)的活性分析。以MoS2/AuNPs纳米复合材料作为玻碳电极修饰材料,半胱氨酸修饰的底物肽链通过Au-S键自组装到修饰电极表面。当存在目标物PKA时,底物肽链被磷酸化,可与纳米生物条形码(S1-AuNPs-Ab)特异性结合,以S1-AuNPs-Ab探针中S1链作为引发链,可诱导发夹DNA(H1和H2)发生杂交链式反应。HCR产物吸附亚甲基蓝(MB)电活性分子,产生放大的电化学响应信号,实现对PKA活性的定量分析。该电化学传感器检测PKA的线性范围为10^(-3)~20 U/mL,检出限(S/N=3)为3×10^(-4) U/mL。构建的电化学传感器具有良好的选择性、重现性和稳定性,可用于实际样品细胞裂解液中PKA的活性测定和蛋白激酶抑制剂的筛选及激酶相关药物的发现。

纳米金生物条形码技术检测痕量二噁英类化合物

建立一种基于纳米金生物条形码技术的二噁英快速筛检方法.利用二噁英诱导激活的芳香烃受体复合物,特异识别以纳米金为报告基团的二噁英反应探针,该探针被释放后进行条形码放大,通过纳米金银染技术增强识别信号,并记录其吸光度值,从而可以简单灵敏地快速筛检二噁英类化合物.在一定的反应时间和浓度范围内(10-14～10-10mol/L),溶液的吸光度值与2,3,7,8-四氯二苯并二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)浓度之间呈正相关,方法检测限为0.01pmol/L,变异系数为5%～8%.用纳米金生物条形码(Nano-Barcode,nanoparticle-based bio-barcode)方法和现有的生物分析方法(CALUX,chemical-activated luciferase gene expression)分别测定TCDD标准品,并绘制剂量效应曲线.结果表明,本方法灵敏度高,线性范围宽,重复性好.本研究纳米金生物条形码方法的检测灵敏度高于CALUX将近5倍(EC50分别为4×10-12mol/L和2×10-11mol/L),检测限较CALUX降低了10倍(检测限分别为1×10-14mol/L和1×10-13mol/L),变异系数分别为5%～8%和15%～30%.

基于生物条形码探针和金纳米颗粒的大肠杆菌O157：H7检测

建立一种基于生物条形码探针和金纳米颗粒(gold nanoparticles,AuNPs)对致病性大肠杆菌O157:H7检测的新方法。用生物功能化的磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles,MNPs)和AuNPs与目标物大肠杆菌O157:H7进行免疫反应,形成MNPs/目标物/AuNPs"三明治"式复合体。利用去杂交将AuNPs上标记的条形码DNA释放出来,通过DNA探针杂交条形码DNA引起AuNPs颜色变化来确定大肠杆菌O157:H7的存在,这种颜色变化很容易用裸眼观察到并且可以通过紫外-可见吸收光谱定量分析,该方法在纯样品和牛奶中最低检测限为102CFU/mL,检测范围为102～106CFU/mL。应用基于生物条形码探针和AuNPs对大肠杆菌O157:H7检测具有准确、快速、操作简单的优点,为食品安全监测提供了新的方法。

生物条形码检测技术及其研究进展

生物条形码检测技术是利用磁场作用收集"金纳米颗粒-被检物-磁性微球"复合物,再释放其中的条形码链,然后可选用多种方法对条形码链进行下一步检测。生物条形码检测技术在蛋白质及核酸的检测方面显示出极高的灵敏度,在不依赖酶反应的情况下,检测蛋白质可以达到10-18mol水平,同时在核酸检测方面也能达到PCR反应的灵敏度。该技术是一种新型的诊断技术,在临床诊断方面有着广泛的应用前景。

丙肝病毒核心抗原荧光定量型生物条形码检测体系的建立与评价

目的建立丙肝病毒核心抗原(HCVcAg)的荧光定量型生物条形码检测体系,并对检测体系进行方法学评价。方法制备标记有HCVcAg多抗及特异DNA链的金纳米颗粒探针(NP探针)和标记有HCVcAg单抗的磁性微球探针(MMP探针),形成MMP探针-HCVcAg-NP探针复合物,再利用去杂交将NP探针上标记的DNA链释放出来,通过荧光定量PCR方法鉴定这些释放的DNA链可确定丙肝病毒的存在。结果建立了HCVcAg的荧光定量型生物条形码检测体系,检测灵敏度可达100fg/ml,是相应的HCVcAg ELISA检测方法的104倍。结论本研究为发展高灵敏度丙肝病毒的荧光定量型生物条形码检测试剂盒奠定了基础。

生物条形码在农产品检测中的研究进展

作为一项新兴的检测技术,生物条形码检测技术在蛋白质和核酸的检测方面有着广泛的应用,除在医学检验领域的成功应用外,该方法在食品安全、畜牧兽医和环境领域也得到了初步的应用研究。本文从生物条形码的原理、检测方法方面进行简要介绍,并详细介绍生物条形码技术在农产品检测中的国内外研究进展及问题,目前的研究表明该项技术在农产品检测中具有广阔的应用前景。

生物条形码检测技术与超微量病毒抗原蛋白检测

基于纳米材料的生物条形码检测技术,以其超灵敏度检测特性大大推动了超微量蛋白免疫学检测技术的发展,并在痕量病毒抗原蛋白超灵敏检测研究中得到较好的应用。本文主要介绍传统生物条形码检测技术和新型生物条形码检测技术,并阐述该技术在人免疫缺陷病毒(HIV)、蓝舌病病毒(BTV)和其他病原标志蛋白中的应用情况。

利用生物条形码技术对蓖麻毒素进行微量检测

目的建立蓖麻毒素的高灵敏检测方法。方法利用蓖麻毒素的多抗及特异DNA链标记的金纳米颗粒探针(NP)和蓖麻毒素单抗标记的磁性微球探针(MMP),形成MMP-蓖麻毒素-NP三明治复合物后再利用去杂交将NP探针上标记的DNA链释放出来,通过PCR方法或芯片检测方法鉴定这些释放的DNA链确定蓖麻毒素的存在。结果建立了蓖麻毒素的生物条形码检测体系,检测灵敏度可达1fg/ml。和临床上常规的检测方法相比,其检测灵敏度可达常规ELISA的106倍。结论生物条形码技术可作为蓖麻毒素一种高灵敏度的检测方法。

水果中毒死蜱农药残留生物条形码免疫分析方法研究

为了更加灵敏地检测水果中毒死蜱农药残留,研究建立基于实时荧光定量PCR (qPCR)的高灵敏生物条形码免疫分析方法。研究将毒死蜱半抗原与鸡卵清白蛋白(OVA)结合,再将此偶联物连接到磁性纳米颗粒上,另将毒死蜱特异性抗体、生物条形码以及经巯基修饰的与生物条形码互补DNA链连接到胶体金纳米颗粒上,随后待检毒死蜱分子会与固定在磁性纳米颗粒上的半抗原竞争性结合胶体金纳米颗粒上的抗体,最后将生物条形码解离下来,通过qPCR检测, DNA相对量与待检农药的含量成负相关。研究结果表明,该方法的最低检测限是0.27μg/L, IC_(50)为19.3μg/L,线性范围是1～1 000μg/L。在苹果和梨两种基质中平均添加回收率为79%～90%,相对标准偏差(RSD)为11%～16%。因此,该方法的建立对于实际样品的检测具有重要意义。

纳米生物条形码技术在分子诊断中的应用

纳米生物条形码技术是一种新型的分子诊断技术,在核酸和蛋白质检测领域已经分别达到和超过现今的检测灵敏度。该技术采用纳米颗粒修饰的核酸或抗体对靶分子进行识别,并利用磁场将其分离,操作简单,不依赖酶反应,具有广泛的应用前景。该技术在病毒DNA、癌症的指标蛋白质等方面的应用已有文献报道,并有望成为一种常规的分子诊断工具。

利用生物条形码技术对蓝舌病毒VP7蛋白进行微量检测

目的:建立高灵敏检测蓝舌病毒VP7蛋白的生物条形码检测方法。方法:制备VP7蛋白的多抗及特异DNA链标记的金纳米颗粒探针(NP)和VP7蛋白单抗标记的磁性微球探针(MMP),形成MMP-VP7蛋白-NP三明治复合物后,再利用去杂交将NP探针上标记的DNA链释放出来,通过PCR或芯片检测方法鉴定释放的DNA链,确定VP7蛋白的存在。结果:建立了蓝舌病毒VP7蛋白的生物条形码检测体系,检测灵敏度可达10fg/mL,为常规ELISA检测的106倍。结论:为发展高灵敏度的蓝舌病毒生物条形码检测试剂盒鉴定了基础。

生物条形码检测技术及其研究进展

生物条形码检测技术作为一种新的诊断工具,已逐渐应用于蛋白质、核酸和小分子物质的检测。生物条形码技术通过构建“纳米金颗粒-目标物-磁纳米颗粒”三明治结构,利用磁场作用,将结合在纳米金颗粒表面的大量相同序列的寡聚核苷酸洗脱下来,并进一步放大信号,实现对目标物的间接或直接检测。本文介绍了生物条形码检测技术的原理及其应用,综述了生物条形码与生物芯片银染技术、酶标纳米金技术、生物传感器技术、微孔板银染技术以及聚合酶链式反应技术等高灵敏放大信号技术的联合应用;并对其前景进行了展望,探索其最佳反应条件、优化操作步骤和多种物质的残留检测,开发标准化、商业化的生物条形码检测技术免疫试剂盒是未来重要的研究方向。

基于生物条形码结合杂交链式反应双重信号放大检测蓖麻毒素

建立了一种基于生物条形码结合杂交链式反应扩增的高灵敏、特异性检测蓖麻毒素(Ricin toxin,RT)的方法。使用RT多克隆抗体(p Ab)及条形码DNA (Barcode DNA)制备功能性金纳米探针(GNPs),通过与RT单克隆抗体(m Ab)共同识别作用,形成"m Ab-RT-pAb/Au NPs/Barcode DNA"三明治夹心结构,进一步利用条形码DNA作为引发链触发生物素标记的发卡探针进行杂交链式扩增,形成一条具有重复单元的长双链DNA。当使用辣根过氧化物酶标记链霉亲和素与长链DNA上的生物素结合后,通过鲁米诺与过氧化氢的化学发光底物发光进行测定。结果表明,本方法检测RT的线性范围为0.61 ng/m L～5.00μg/m L,检出限为0.52 ng/m L(S/N=3),本方法具有较宽的检测范围及较低的检出限,测定饮用水及脱脂牛奶样品中RT的加标回收率在83.4%～112.4%之间,相对标准偏差在2.2%～5.4%之间,表明本方法实用性良好,在食品和饮用水安全控制及防范生物恐怖袭击方面具有良好的应用前景。

基于生物条形码信号放大的电化学方法检测hIgG

通过抗原抗体的特异性识别作用以及生物条形码的信号放大作用,构建了一种新的电化学免疫传感器,用以检测人免疫球蛋白(hIgG)。将抗体Ab1修饰到金电极上,加入抗原(hIgG),经过抗原抗体的免疫反应再将已制备好的纳米金标记抗体Ab2和生物条形码(Ab2-AuNPs-B)修饰到该免疫传感器上,通过观察电化学阻抗的变化来监控免疫传感器的构建过程。利用生物条形码的信号放大作用,通过循环伏安法和差示脉冲伏安法对hIgG的含量进行定量检测,其检出限达到0.4×10-5mg/L。

纳米粒子-DNA生物条形码技术研究进展

纳米粒子-DNA生物条形码是指同时结合了大量DNA片段(生物条形码)和目标分析物识别探针的纳米粒子。纳米粒子-DNA生物条形码是有效的信号放大和检测系统,是目前报道的唯一一种具有聚合酶链扩增反应灵敏度而又不需要酶放大的检测体系。由于纳米粒子-DNA生物条形码的放大作用,这一技术在蛋白质,DNA等生物大分子的传感与检测中引起了广泛的兴趣。该文对该领域近期的进展进行了简单的综述。

HCV核心抗原荧光定量型生物条形码检测在筛查献血员HCV感染中的应用价值

目的探讨HCV核心抗原(HCV-cAg)荧光定量型生物条形码检测(FQ-BCA)在筛查献血员丙肝病毒(HCV)感染中的应用价值。方法收集3 302份献血者的血标本,采用实时-PCR(RT-PCR)及FQ-BCA分别检测血标本的HCV-RNA及HCV-cAg。以RT-PCR检测结果作为金标准,评价FQ-BCA诊断HCV阳性的效能。分析HCV-RNA拷贝数与HCV-cAg阳性检出率的相关性。结果 3 302份血标本中,HCV-RNA阳性共33份,HCV-cAg阳性共32份。FQ-BCA检测的灵敏度为96.97%(32/33),特异度为100.00%(3 269/3 269),符合率为99.97%(3 301/3 302)。HCV-RNA拷贝数与HCV-cAg阳性检出率呈正相关(P<0.05)。结论 HCV-cAg FQ-BCA诊断HCV感染具有极高的检测灵敏度及特异度,适用于献血者的血液筛检。

达氟沙星残留生物条形码检测技术的建立

将达氟沙星多克隆抗体和条形码DNA链同时修饰在金纳米颗粒表面用于制备纳米金复合探针(NP),达氟沙星单克隆抗体与磁性颗粒相结合制备磁性探针(MMP),待上述两种探针制备成功后与达氟沙星标准品进行杂交反应,同时发挥磁场作用固定MMP,除去未结合的NP探针,最后将标记在金纳米复合探针上的DNA链释放出来,对收集释放的DNA链应用微孔板银染的生物条形码技术进行检测间接得到达氟沙星的残留量,该检测方法不需要昂贵的仪器设备,普通实验室利用酶标仪即可完成全部实验操作,操作简单,检测速度快,其检测灵敏度要优于传统的酶联免疫吸附法。结果表明,在0.05~50 ng/mL范围内检测达氟沙星的最低检出限IC15为3.62 ng/mL,其检测灵敏度是常规免疫检测方法的100倍。本方法实现了对达氟沙星残留的超高灵敏度检测,同时本方法也可应用于其它类抗生素的高效快速检测,因此,本方法的建立具备一定的实用性。

一种利用CRISPR/Cas9对细胞添加生物条形码的新方法

旨在利用CRISPR/Cas9对细胞添加不同的生物条形码(Barcode),实现对细胞进行不同的标记。将生物条形码序列、条件诱导性Cas9序列及相应的sg RNA序列通过PB酶整合到细胞中,诱导Cas9表达之后对生物条形码序列测序分析细胞的标记情况。所设计的生物条形码含有6个相互重叠的sg RNA识别位点,这种设计可以使条形码序列只会被Cas9切割一次。结果显示,所设计的生物条形码序列在N2a细胞中经Dox诱导之后能够高效地被Cas9切割,所挑的9个克隆中,生物条形码序列有9种不同的基因型。含有受loxp-stop-loxp调控表达Cas9的序列及生物条形码序列的E14胚胎干细胞经Cre诱导之后,挑单克隆测序分析显示,21株细胞中仅2株单克隆细胞生物条形码保持原来的基因型,另外19株有18种不同的基因型。成功建立了可进行时空调控地在细胞内高效添加特异且相对稳定的生物条形码标记的方法。