不同接种方法下hBMSCs在生物珊瑚支架中的空间分布和基因表达分析

目的比较采用两种不同方法接种的hBMSCs在生物珊瑚支架中的三维空间分布和基因表达。方法采用传统接种法(A组)和纤维蛋白凝胶接种法(B组)构建hBMSCs和生物珊瑚支架复合体。A组孵育3h,B组孵育30min后检测两组细胞接种效率。培养后2、7、14、21d,两组分别取材行DAPI染色后,荧光显微镜观察,采用AxioVision图像分析软件测量每个切片10倍物镜视野中的细胞数量,以切片的不同水平区域(从表面到底部为L1～L5)和垂直区域(从中心到边缘)比较两组细胞分布情况;采用实时荧光RT-PCR检测成骨分化基因骨凝集素(osteonectin,ON)、核心结合因子α1(core binding factorα1,Cbfα1)和骨钙素(osteocalcin,OC)表达。结果B组细胞接种效率为88.32%±4.20%,明显高于A组66.51%±12.33%(P<0.01)。培养后2d,两组细胞水平区域分布由L1～L4逐渐减少(P<0.05);垂直区域细胞数目比较,A组差异无统计学意义(P>0.05),B组差异有统计学意义(P<0.05);两组间各成骨分化基因表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。培养后7d,A组细胞数目较2d时逐步减少,各水平区域间细胞数目比较差异均有统计学意义(P<0.05),而B组细胞数目和各成骨分化基因表达量迅速增加,各水平区域细胞数目趋于平衡,细胞分布均匀(P>0.05),ON和Cbfα1基因表达量明显高于A组,差异有统计学意义(P<0.05)。培养后14d,A组各水平及垂直区域内的细胞数目均较7d时急速减少(P<0.05),B组细胞增殖良好且细胞总数与7d时相近;B组OC基因表达量达峰值,两组间各基因表达比较差异均有统计学意义(P<0.05)。培养后21d,两组各水平区域细胞数目和两组间各基因表达比较差异均有统计学意义(P<0.05);两组各垂直区域细胞数目比较差异均无统计学意义(P>0.05)。培养后7、14、21d,B组大部分区域细胞数目均较A组多,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论通过纤维蛋白凝胶接种较传统方法接种可使hBMSCs在支架中空间分布更均匀,能达到更快的细胞增殖和更有效的成骨分化。