生物素化FOXM1真核表达体系的构建及鉴定

建立基于生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达载体,利用生物素与链霉亲和素的高特异性、高亲和力的结合性质对FOXM1蛋白进行纯化,为后续鉴定其互作分子的研究奠定基础。分别构建真核表达载体pc DNA3.1-AP-FOXM1和大肠杆菌生物素连接酶Bir A真核表达载体pcDNA3.1-Bir A,将pcDNA3.1-AP-FOXM1和pcDNA3.1-BirA共转染人胚肾293T(HEK293T)细胞,用银染及Western印迹检测细胞裂解液,确定相关蛋白表达;用链霉亲和素琼脂糖珠纯化生物素标记的FOXM1,并考察FOXM1的互作蛋白是否可以同时被洗脱下来。研究发现构建的生物素标签真核表达体系能有效表达生物素化的目标蛋白FOXM1;该蛋白在Western印迹、pull-down等实验中可实现无需抗体的一步法应用;该体系可用于FOXM1互作蛋白的鉴定和功能分析。结果表明建立了基于生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达体系,为FOXM1互作蛋白与功能的深入研究奠定了技术基础。

生物素标记重组猪圆环病毒2d基因型毒株感染性克隆的构建与鉴定

本试验旨在获得临床上逐渐增多的猪圆环病毒2d基因型毒株(PCV2d),并对其引入生物素标记。首先从陕西咸阳某临床发病猪场采集了2头发病仔猪和15头未发病仔猪的组织样本,对其进行猪圆环病毒2型(PCV2)检测,并对阳性样本进行测序及序列比对,将获得的PCV2d基因型毒株基因组orf 2中226~246 bp序列替换为生物素受体肽(BAP)编码序列并克隆入质粒载体,同时稳定构建表达原核生物素连接酶(BirA)的PK15细胞系,将替换有BAP的PCV2d基因组酶切并环化后转染稳定表达BirA的PK15细胞,连续盲传5代后鉴定获得的重组病毒。结果显示,检测的组织样本中共有5头仔猪的样本为PCV2阳性,其中1份样本为PCV2d基因型,4份样本为PCV2b基因型;在获得BAP序列替换的PCV2d,构建重组质粒T-PCV2d-BAP和稳定表达BirA的PK15细胞系后,将环化的PCV2d-BAP转染稳定表达BirA的PK15细胞并盲传5代,经PCR和Western blot检测均为PCV2阳性,且能被链酶亲和素识别。本试验成功获得的生物素标记重组PCV2d基因型毒株为后续探究PCV2d基因型毒株免疫逃避机制提供一个非常有效的工具。

邻近标记技术在弓形虫蛋白质组学研究中的应用进展

弓形虫编码数量众多的分泌蛋白,储存在微线体、棒状体和致密颗粒等虫体特有的细胞器中,于虫体入侵宿主细胞前后分泌到不同部位,并在虫体的感染、寄生和致病过程中发挥重要作用,对这些分泌蛋白的鉴定和功能研究是弓形虫致病机制研究中的热点和难点。传统的蛋白质组学技术在弓形虫亚细胞器的分离和组分鉴定上存在样品纯化困难和蛋白质组学信息覆盖率低等不足,且该技术在检测瞬时的或较弱的蛋白质相互作用时灵敏性较低。近年来,快速发展的邻近标记技术(PL)克服了传统技术的局限性。PL是将具有特定催化活性的工具酶与诱饵蛋白进行融合,进而添加生物素或生物素苯酚对诱饵蛋白邻近的靶蛋白进行生物素酰化标记的一门技术。该技术整合了酶促反应效率高的优点,可将特定空间内的蛋白进行高效标记,并可检测较弱的蛋白质相互作用,近年来在生物学研究中被广泛使用。本文对基于生物素连接酶(BirA)和抗坏血酸过氧化物酶(APEX)催化的PL在弓形虫蛋白质组学研究中的应用进行阐述,介绍2种标记方法在弓形虫分泌蛋白的挖掘和蛋白质相互作用研究中的贡献,为弓形虫致病机制的研究和弓形虫病的防控提供参考。

邻近标记技术在神经生物学中的应用与展望

通过综述基于过氧化物酶和生物素连接酶的邻近标记技术的原理、应用及常见问题,重点回顾目前邻近标记技术在神经生物学领域主要用于突触亚区分子成分的研究并取得一些成果,分析在应用过程中面临的活体脑组织中探针输入和高背景等挑战。展望该技术将为系统地鉴定神经组织中高度复杂的动态相互作用蛋白质组及亚细胞结构蛋白质组提供前所未有的机会,也为寻找神经生物学中的关键分子提供有效途径。

活细胞内临近标记技术BioID在蛋白质相互作用研究中的进展

蛋白质往往通过形成复合物或蛋白质间相互作用来执行功能,研究蛋白质相互作用网络具有重要意义。临近依赖的生物素识别技术(proximity-dependent biotin identification technology, BioID)是一种在活细胞中鉴定互作蛋白质组的新工具,其通过构建靶蛋白-生物素连接酶融合蛋白系统,使靶蛋白及其临近蛋白发生生物素化,进而直接鉴定生物素化蛋白,从而确定靶蛋白的相互作用网络。与其他传统的蛋白质互作研究方法相比,BioID可用于鉴定微弱/瞬时相互作用、难溶性蛋白的相互作用以及翻译后修饰介导的蛋白相互作用等。本文针对利用BioID鉴定不同类型蛋白质的相互作用蛋白质组展开综述。

新型抗菌靶点BPL抑制剂的研究进展

抗生素的耐药性不仅使患者难以治愈,严重威胁着人类的健康,而且增加了医疗负担。生物素蛋白连接酶(biotin protein ligase, BPL)通过调节微生物的乙酰辅酶A羧化酶和丙酮酸羧化酶,控制重要代谢途径的关键反应,从而有效控制微生物生长,因此成为极具开发前景的抗菌新靶点。本文介绍了BPL的结构特征、作用机理,分析了BPL抑制剂的特点及研究趋势,以期为基于BPL的新药研发提供理论依据和指导。