生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定双酚A

建立了可用于快速、灵敏地检测双酚A的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法,测得最佳实验条件为包被抗原浓度为13.8 mg/L、抗体稀释为2.4×105倍,生物素化二抗和酶标亲和素的最佳稀释倍数分别为2000倍和500倍.在优化条件下,方法的线性范围0.2～1000 μg/L;最低检出限0.05 μg/L.所建立的方法用于食品和唾液中双酚A含量的测定,样品处理简单,结果满意.

生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定二乙基磷酸酯类有机磷农药

基于生物素和亲和素之间发生特异性反应,形成多酶系统,建立了二乙基磷酸酯类有机磷农药的竞争酶联免疫分析技术和生物素-亲和素放大酶联免疫分析技术。在优化条件下,二乙基磷酸酯类有机磷农药浓度在1×10-1～1×104mg/L范围内与抑制率线性关系良好,其线性回归方程为y=0.1168x+0.6259(r=0.9889),半抑制浓度和检出限分别为34 mg/L和0.0248 mg/L,与间接竞争酶联免疫分析方法相比,在交叉反应率基本不变的情况下,检测灵敏度和检测范围都得到显著提高,实际样品的加标回收率为70.1%～117.8%,基本满足痕量物质分析的要求。

生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定呋喃西林代谢物

目的建立竞争生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法(biotin-avidin enzyme linked immumosobent assay,BA-ELISA)检测呋喃西林代谢物。方法采用棋盘法确定单克隆抗体和包被原的最佳稀释倍数,通过单因素试验优化辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(streptavidin-horseradish peroxidase,SA-HRP)稀释倍数、封闭液浓度、竞争反应时间、生物素标记羊抗鼠二抗(biotinylated goat anti-mouse Immunoglobulin G,Biotin-IgG)孵育时间、SA-HRP孵育时间和显色时间,建立标准曲线,并对方法的灵敏度、特异性、准确度和精密度进行方法学评价。结果最佳实验条件为:包被原稀释倍数为1:800,单克隆抗体稀释倍数为1:12800,SA-HRP稀释倍数为1:8000,封闭液为1%的脱脂乳,竞争反应时间为30 min,Biotin-IgG孵育时间为30 min,SA-HRP孵育时间为60 min,显色时间为15 min;在优化条件下,线性方程为Y=-0.3299X+0.4272(r^2=0.990),IC_(50)为0.601ng/m L,线性范围为0.074~4.883 ng/m L;加标回收率为88.8%~98.5%,批内变异系数(coefficient of variation,CV)和批间CV分别为1.2%~3.6%和2.5%~5.1%,建立的方法与其他结构类似物及衍生化试剂的交叉反应率(cross reactivity,CR)均小于0.1%。BA-ELISA与高效液相色谱-串联质谱法的回收率均在85%~115%范围内。结论 BA-ELISA法灵敏度高、特异性好、重现性好,可适用于动物组织中呋喃西林代谢物的快速筛查。

生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法测定甲氨蝶呤

目的将生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法（BA-c ELISA）引入甲氨蝶呤血药浓度检测,建立一种快速、简便、敏感、特异的甲氨蝶呤检测方法。方法将NH2活性生物素与MTX单抗Ig G化学连接,采用亲和素-HRP酶标记系统,建立放大竞争酶联免疫吸附法,连续制备5批试剂盒,对试剂盒进行批内批间精密度、敏感性、特异性、准确性和稳定性进行验证,检测口服MTX的类风湿关节炎患者血清MTX浓度,并对其检测结果进行判定。结果建立的生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法测定甲氨蝶呤的方法具有很好的敏感性和特异性,检测MTX的灵敏度达到0.087 ng/m L,检测下限为0.137 ng/m L,检测线性范围为0.1~10 ng/m L;批内RSD为3.3%~8.7%,平均批内差异为6.5%,批间RSD为7.6%~9.9%,重复性教好,检测回收率为94.2%~112.8%。结论生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法检测MTX,操作简单,具有较好的灵敏度和特异性。

圆斑酶联免疫吸附试验诊断囊虫病——生物素-亲和素酶复合物在该方法中的应用

目的：应用生物素－亲和素－酶复合物系统，建立一种繁感、特异、经济简便的囊虫病血清学诊断。方法：生物素－亲和素－酶复合物圆斑酶联免疫吸附试验（ＡＢＣ－Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）、滤纸血斑ＡＢＣ－Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ。结果：ＡＢＣ－Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ 诊断囊虫病，检出率（９５．９２％ ）远较圆斑酶联免疫吸附试验（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）高８３．６７％ ，平均几何滴度（１∶２ ８０１．７３）约为Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ（１∶５８７．２６）的５ 倍；用该方法对４℃条件下保存３ 月的患者滤纸血斑样本进行检测，阳性率为９４．７４％ （５４／５７），无假阳性反应（０／４５）；对相同患者血清和滤纸血斑双份血样进行检测，阳性率均为９０％ （２０／２２）。结论：该方法提高了检出率，简化了采样及送样程序，适合于边远地区和用于流行病学调查。

生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定氯胺酮

建立了检测氯胺酮的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法(BA-ELISA)。实验最佳测定条件:抗原包被浓度为2.0mg/L、氯胺酮单克隆抗体浓度为10.2mg/L,生物素化羊抗小鼠IgG(Biotin-IgG)和酶标链霉亲和素(SA-HRP)的最佳反应浓度分别为0.29和1.0mg/L。在此优化条件下,方法的线性范围为0.1～1000μg/L;检出限为0.03μg/L。氯胺酮生物样品的加标回收率为94%～102%。与酶标二抗体系ELISA法相比,BA-ELISA具有更高的灵敏度,适于低浓度氯胺酮的检测。

生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定牛奶中雌三醇

建立了检测牛奶中雌三醇的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法(BA-ELISA),实验最佳工作条件为,包被原浓度为125 ng/m L,生物化抗体的稀释倍数为1∶16000,缓冲体系为pH=7.4的0.01 mol/L的PBS缓冲溶液,体系中甲醇浓度低于5%,生物素化抗体孵育时间和亲和素-HRP孵育时间均为30 min。在此最佳条件下,方法的检测范围(IC20~IC80)为0.149~3.27 ng/m L,灵敏度IC50=0.689 ng/m L。建立了液-液提取样品前处理方法,前处理净化后稀释10倍可消除基质效应,雌三醇牛奶样品加标回收率为94.9%~115.2%,CV<15%。与ELISA法相比,BA-ELISA具有更高的灵敏度,适于低浓度雌三醇的检测。

CA125的生物素-亲和素酶联免疫检测方法的建立

目的:建立CA125的生物素-亲和素酶联免疫检测(BA-ELISA)方法,进行方法学评价。方法:纯化卵巢癌患者腹水得到CA125抗原,制备生物素化CA125抗体,酶标板包被生物素化BSA,建立BA-ELISA反应系统。观察本方法的灵敏度、回收率、特异度、稳定性等指标。测定卵巢癌患者以及卵巢良性肿瘤患者血清CA125水平,与化学发光免疫检测结果对比。结果:BA-ELISA方法灵敏度为3.18U/L,与CEA、PSA等交叉反应率低;高低浓度样品平均回收率分别为107.11%、99.96%,批内和批间变异分别为7.97%、8.04%,稳定性好。本研究与化学发光免疫检测检出结果差异无统计学意义,检测卵巢癌患者血清CA125水平,回归方程为y=-6.830+1.014x,r=0.993。检测卵巢良性肿瘤患者血清CA125水平,回归方程为y=1.936+0.937x,r=0.986。结论:BA-ELISA检测方法的建立在诊断卵巢癌等方面灵敏度高、特异性强,操作简便,无需昂贵仪器,适合广泛应用。

人生长激素的生物素-亲和素放大酶联免疫法的建立

为建立有生物素和亲和素放大系统的人血清生长激素 (hGH)酶联免疫分析法 (BA ELISA) ,以微量的GH抗原免疫BALB/C小鼠 ,利用杂交瘤技术制备出 2 9株分泌抗hGH单克隆抗体 (MCA)的杂交瘤株。选择最佳配对MCA ,利用亲和素与生物素高亲和力的特性 ,建立了血清hGH双位点的BA ELISA法。我们的MCA滴度为 (0 5～ 5 0 0 )× 10 4,亲和常数Ka =(0 13～ 1 40 )× 10 10 L/mol。血清hGH的ELISA的灵敏度为 0 0 4± 0 0 1μg/L ;在血清中分别加入 1,2 5 ,5 μg/L的hGH ,其回收率为 90 7%～ 10 7 6 % (平均为 10 1 2 0 %± 0 0 3 % ) ;hGH含量为 2 8、10 0、2 9 8μg/L的血清批内、批间变异系数分别为 4 9%、3 8%、7 9%和 6 2 %、3 5 %、9 5 % ;用本法测定了正常儿童、生长激素缺乏症 (GHD)患儿和活动性肢端肥大症患者空腹血清hGH水平 ,分别为 1 87± 3 0、0 30± 0 42和 8 71± 6 95 μg/L。上述结果表明 ,本ELISA方法灵敏、特异、稳定、准确 ,能确切反映hGH分泌功能 ,在诸多方面均优于RIA。

基于己烯雌酚-生物素双功能配体的己烯雌酚化学发光酶联免疫吸附检测技术研究

目的基于己烯雌酚-生物素双功能配体和生物素-亲和素信号放大系统建立生物素-亲和素化学发光酶联免疫吸附试验(biotin-avidin-amplified chemiluminescent immunosorbent assay,BA-CLIA)法检测牛奶中的己烯雌酚的方法。方法采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺法[N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride/N-hydroxysuccinimide,EDC/NHS]制备己烯雌酚-生物素双功能配体;棋盘滴定法优化己烯雌酚-生物素双功能配体与抗己烯雌酚单克隆抗体的最佳稀释比例;对有机溶剂、离子强度、pH等影响因素进行优化后建立基于直接竞争化学发光免疫吸附试验检测己烯雌酚的标准曲线;通过特异性试验测定该方法与己烯雌酚结构类似物的交叉反应率;最后选取牛奶进行加标回收试验验证该方法在实际样品中检测的可行性。结果BA-CLIA法对己烯雌酚的半数抑制浓度为3.45 ng/mL,检出限为0.020 ng/mL,与传统竞争酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法比较,检测灵敏度提高了6.22倍;BA-CLIA法与己烯雌酚类似物(双烯雌酚、雌二醇、雌三醇和双酚A)的交叉反应性较低,显示了较好的特异性;采用该方法检测牛奶中的己烯雌酚,平均加标回收率为92.80%~95.74%,变异系数小于等于8.05%。结论该方法灵敏度高、特异性好,适用于牛奶中的己烯雌酚的测定。

游离三碘甲腺原氨酸(FT3)生物素-亲合素酶联免疫分析

采用T3抗体包被酶标板微孔、生物素化T3和辣根过氧化物酶(HRP)标记链亲合素作为信号放大体系,一系列定量游离T3(FT3)为标准品,并以四甲基联苯胺-过氧化氢为显色底物,建立了FT3的生物素-亲合素(BA)酶联免疫分析(FT3-BA-EIA)法。其灵敏度为0.90pmol/L,标准曲线范围0.9～45.0pmol/L,批内变异系数3.1%～8.1%,批间变异系数4.9%～10.6%。测定了101例临床血样,其中正常人46例,实测范围2.5～11.1pmol/L,均值为5.1±2.0pmol/L;27例甲亢病人,实测范围9.7～37.3pmol/L,均值为20.5±7.1pmol/L;20例甲低病人,实测范围0.9～3.8pmol/L,均值为2.0±0.9pmol/L;8例孕妇,实测范围为3.4～8.5pmol/L,均值为6.0±2.5pmol/L。通过对临床血样的检测,本法与化学发光法(CIA)及放免法(RIA)的测定结果有良好的相关性。应用本法可有效地诊断甲状腺疾病,具有操作简便、灵敏、快速的特点,适于临床检测和科研应用。

检测牛乳样品生物素酶联免疫吸附法特异性高于间接酶联免疫吸附法

印度DRKalorey等人用高纯度李斯特溶血素O作为抗原，通过与细菌学检查作比较，评估检测牛乳样品中单增李斯特菌抗体的间接酶联免疫吸附法（1ndirect ELISA）和生物素酶联免疫吸附法（A—BELISA）。

人血清甲状腺素的生物素-亲和素竞争酶联免疫分析

目的:建立人血清T4-BA-ELISA分析方法。方法:合成的3种生物素化的T4-衍生物、经过筛选,Biotin-BSA-T4被用于以下实验中:T4在三氯乙酸作用下与甲状腺T4结合球蛋白（TBG）分离,并与Biotin-BSA-T4对有限量的兔抗人T4IgG形成竞争,在链霉亲和素化辣根过氧化物酶（streptavidin-HRP）存在下,以四甲基联苯胺（TMB）为底物,进行T4的ELISA定量分析。结果:标准曲线的可测量范围是10～20μg/L,批内变异系数为7.1％,批间变异系数为 8.03％。另外,用EIA和RIA同时测定了71份血清标本,对两套数据作了回归分析.r=0.969 5,P<0.001。结论:此方法的灵敏度已达到甚至超过了放射免疫分析的灵敏度,标准曲线范围与放射免疫分析相同。

酶联反应板包被链霉亲合素的优化方法

目的对链霉亲合素(streptavidin,SA)预包被酶联反应板的优化方法进行研究,比较干法、湿法包被的优越性。方法通过对包被缓冲液、SA浓度、17种市售反应板的比较试验,得出SA包被的较优条件。结果选择洁特高亲和力板,采用碳酸缓冲液干法包被,37℃温育16 h至全干,达最佳包被效果,此时SA浓度为2μg/ml。干法包被的孔间差2.95%,批间差7.37%,37℃保存7 d结合生物素的效果无显著改变。生物素结合量为每孔1 ng,是国产SA预包被反应板的5倍。结论用干法预包被SA优于传统的湿法包被,效果等同甚至超过现有进口SA预包被板。

双抗体夹心生物素-亲和素ELISA法检测相思子毒素

目的建立相思子毒素(abrin)的酶联免疫检测方法,为abrin临床诊断、中毒治疗、法医学鉴定等应用领域提供技术基础和参考依据。方法采用双抗体夹心生物素-亲和素ELISA法来检测微量abrin。结果该法检测abrin线性范围为0.125～31.25μg/L,线性回归方程为Y=0.52369X+0.51632(r=0.9816,P<0.0001,n=9),检测限为0.125μg/L。不同浓度蓖麻毒素(ricin)、葡萄球菌肠毒素(SEB)对检测结果基本无干扰,表明该法检测abrin具有很好的特异性。该法能用于abrin毒素污染水样、土样、食品、血液等模拟样品的分析,相对标准差为2.35%～4.14%,具有较好的重现性。结论成功建立了夹心BA-ELISA法检测abrin,巧妙地将多克隆抗体的强富集能力、单克隆抗体的特异性以及生物素-亲和素系统的放大作用结合起来,达到了提高检测的灵敏度和特异性的目的,可适用于各种微量abrin样品的分析。

人血清癌胚抗原的生物素-亲和素ELISA检测方法的建立

目的:建立检测血清癌胚抗原(CEA)的高灵敏度生物素-亲和素酶联免疫检测(BA-ELISA)方法。方法:亲和层析纯化得到CEA,免疫新西兰家兔制备多克隆抗体。将得到的抗体连接生物素和辣根过氧化物酶,在生物素化BSA包被的96微孔板上建立生物素-亲和素ELISA(BA-ELISA)。对这一体系的线性、灵敏度、特异度、稳定性、回收率等参数进行鉴定,并和常规ELISA、放射免疫检测以及化学发光法相比较检测了临床标本中的CEA浓度。结果:线性检测范围为(0.42～50)U/mL,检测结果表明,体系稳定性良好;灵敏度为0.42 U/mL,批内、批间差异均小于10.0%。该研究建立的方法与常规ELISA对比差异有统计学意义,与放射免疫检测对比差别无统计学意义。与化学发光法相比较,回归方程为:y=0.04825+0.99674x,r=0.994,差异无统计学意义。结论:建立的CEA的BA-ELISA检测方法易于操作、灵敏度高、价格低廉,适合应用于临床检测。

应用生物素-链霉亲合素放大ELISA系统检测抗环瓜氨酸肽抗体

目的用生物素-链霉亲合素放大ELISA系统建立一种敏感、特异、经济简便的抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体的测定法。方法用链霉亲合素(SA)预包被,使生物素化的CCP(bio-CCP)固相化,摸索检测抗CCP抗体的最优实验条件,并进行方法学考核和临床应用评价。结果本法对类风湿关节炎(RA)的诊断敏感性为69.4%,特异性为96.8%,阳性预测值为89.1%,阴性预测值为94.1%,阳性似然比为19.28,阴性似然比为0.317,Youden指数为0.658。与欧蒙试剂比对,两法所测抗CCP抗体吸光度/cutoff比值显著相关(n=61,r=0.9253,P<0.001)。在所统计的168例血清样本中,两法同时阳性者60例,同时阴性者105例,一致性百分率达98.2%,结果具有高度一致性(Kappa=0.961,P<0.001)。ROC曲线分析结果显示本法所测抗CCP抗体对RA诊断准确性达到了一个较高水平(AUCROC值=0.901)。在13例诊断为早期RA者中,有10例抗CCP抗体阳性(阳性率76.9%),未发现抗CCP抗体与RA患者临床症状、疾病活动指标(ESR)及RF水平有关。结论成功将生物素-链霉亲合素ELISA系统应用于抗CCP抗体检测,方法敏感、特异、可靠,可用于RA的常规实验室诊断。

高灵敏度人促甲状腺激素(hTSH)酶联免疫分析试剂盒

以辣根过氧化物酶标记链亲合素 (SA) ,二株识别人促甲状腺激素 (hTSH)高度特异的单克隆抗体分别用于包被微孔和生物素化 ,以四甲基联苯胺 (TMB)为底物 ,建立了高灵敏度人促甲状腺激素生物素 亲合素酶联免疫分析 (sTSH BA ELISA)试剂盒的制备方法。本试剂盒的灵敏度为 0 0 2mIU/L ,批内变异系数 <7 8% ,批间变异系数 <9 6% ,回收率为 93 3 %～ 1 0 7 8% ,特异性鉴定显示与其它糖蛋白激素 (如FSH ,HCG ,LH)无明显的交叉反应性。正常参考值范围为 0 3～ 4 1mIU/L。本法所制备的试剂盒与中国原子能科学研究院同位素研究所的TSH IRMA试剂盒的相关方程为 y =1 .2xIRMA+0 1 4,相关系数r =0 969。本试剂盒较常规ELISA灵敏度高、简便、快速 。

谷氨酸脱羧酶抗体检测的生物素．链霉亲合素放大ELISA系统构建及其临床应用

目的建立检测谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)的新方法,即生物素-链霉亲合素放大ELISA系统(ELISA,BAS ELISA),并进行验证及初步临床应用。方法人脑组织经过破碎、抽提、二次凝胶过滤层析与阴、阳离子交换层析分离蛋白,收集纯化的谷氨酸脱羧酶(GAD);以链霉亲和素(SA)预包被,使GAD生物素化(bio-GAD),探讨检测GADA的最优实验条件,并对BAS ELISA的灵敏度、特异性、准确性及精密性进行验证。然后选择新诊断的成年1型糖尿病患者106例(T1DM组),以健康体检者98例为对照组,抽取空腹外周静脉血3 ml,分离血清冷冻标本,用构建的BASELISA和德国宝灵曼公司Anti-GAD65 ELISA检测血清中的GADA,对比研究并进行统计学分析。结果成功构建了检测GADA的BAS ELISA新方法;在T1DM组中,BAS ELISA方法测得T1DM的GADA阳性率显著高于anti-GAD65 ELISA方法(82.08%vs 52.83%,P<0.01);在对照组中BASELISA方法测得T1DM的GADA阳性率也明显高于anti-GAD65 ELISA方法(10.20%vs 6.12%,P<0.05)。结论利用生物素-链霉亲合素放大系统可以构建检测GADA的ELISA新方法;生物素-链霉亲合素放大ELISA系统在检测GADA方面具有较高的特异性、灵敏度、准确性和精密性,提高了GADA检测的阳性率,降低T1DM的漏检率,为早期检测T1DM提供新方法。

心肌营养素-1 ELISA测定法的建立及初步应用

目的应用生物素链霉亲和素酶联免疫吸附法(BSA ELISA)建立血浆心肌营养素1(CT1)测定法,并初步应用于冠心病患者血浆CT1水平的检测。方法用鼠抗重组人CT1单抗包被酶标板,加入待测抗原,并依次加入生物素化羊抗重组人CT1多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记链霉亲合素,用H2O2邻苯二胺显色。检测35名冠心病患者及对照组血浆CT1含量的变化。结果方法的线性范围为10～2000pg/ml,检测下限为10pg/ml,批内变异系数为1.76%～7.64%,批间变异系数为5.96%～9.04%。结论该方法简便、快速,特异性、敏感性、重复性均在临床检测可接受范围内,标准曲线线性良好,适用于基础研究与临床检验。