生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定双酚A

建立了可用于快速、灵敏地检测双酚A的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法,测得最佳实验条件为包被抗原浓度为13.8 mg/L、抗体稀释为2.4×105倍,生物素化二抗和酶标亲和素的最佳稀释倍数分别为2000倍和500倍.在优化条件下,方法的线性范围0.2～1000 μg/L;最低检出限0.05 μg/L.所建立的方法用于食品和唾液中双酚A含量的测定,样品处理简单,结果满意.

生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定二乙基磷酸酯类有机磷农药

基于生物素和亲和素之间发生特异性反应,形成多酶系统,建立了二乙基磷酸酯类有机磷农药的竞争酶联免疫分析技术和生物素-亲和素放大酶联免疫分析技术。在优化条件下,二乙基磷酸酯类有机磷农药浓度在1×10-1～1×104mg/L范围内与抑制率线性关系良好,其线性回归方程为y=0.1168x+0.6259(r=0.9889),半抑制浓度和检出限分别为34 mg/L和0.0248 mg/L,与间接竞争酶联免疫分析方法相比,在交叉反应率基本不变的情况下,检测灵敏度和检测范围都得到显著提高,实际样品的加标回收率为70.1%～117.8%,基本满足痕量物质分析的要求。

生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定呋喃西林代谢物

目的建立竞争生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法(biotin-avidin enzyme linked immumosobent assay,BA-ELISA)检测呋喃西林代谢物。方法采用棋盘法确定单克隆抗体和包被原的最佳稀释倍数,通过单因素试验优化辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(streptavidin-horseradish peroxidase,SA-HRP)稀释倍数、封闭液浓度、竞争反应时间、生物素标记羊抗鼠二抗(biotinylated goat anti-mouse Immunoglobulin G,Biotin-IgG)孵育时间、SA-HRP孵育时间和显色时间,建立标准曲线,并对方法的灵敏度、特异性、准确度和精密度进行方法学评价。结果最佳实验条件为:包被原稀释倍数为1:800,单克隆抗体稀释倍数为1:12800,SA-HRP稀释倍数为1:8000,封闭液为1%的脱脂乳,竞争反应时间为30 min,Biotin-IgG孵育时间为30 min,SA-HRP孵育时间为60 min,显色时间为15 min;在优化条件下,线性方程为Y=-0.3299X+0.4272(r^2=0.990),IC_(50)为0.601ng/m L,线性范围为0.074~4.883 ng/m L;加标回收率为88.8%~98.5%,批内变异系数(coefficient of variation,CV)和批间CV分别为1.2%~3.6%和2.5%~5.1%,建立的方法与其他结构类似物及衍生化试剂的交叉反应率(cross reactivity,CR)均小于0.1%。BA-ELISA与高效液相色谱-串联质谱法的回收率均在85%~115%范围内。结论 BA-ELISA法灵敏度高、特异性好、重现性好,可适用于动物组织中呋喃西林代谢物的快速筛查。

生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定氯胺酮

建立了检测氯胺酮的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法(BA-ELISA)。实验最佳测定条件:抗原包被浓度为2.0mg/L、氯胺酮单克隆抗体浓度为10.2mg/L,生物素化羊抗小鼠IgG(Biotin-IgG)和酶标链霉亲和素(SA-HRP)的最佳反应浓度分别为0.29和1.0mg/L。在此优化条件下,方法的线性范围为0.1～1000μg/L;检出限为0.03μg/L。氯胺酮生物样品的加标回收率为94%～102%。与酶标二抗体系ELISA法相比,BA-ELISA具有更高的灵敏度,适于低浓度氯胺酮的检测。

生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定牛奶中雌三醇

建立了检测牛奶中雌三醇的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法(BA-ELISA),实验最佳工作条件为,包被原浓度为125 ng/m L,生物化抗体的稀释倍数为1∶16000,缓冲体系为pH=7.4的0.01 mol/L的PBS缓冲溶液,体系中甲醇浓度低于5%,生物素化抗体孵育时间和亲和素-HRP孵育时间均为30 min。在此最佳条件下,方法的检测范围(IC20~IC80)为0.149~3.27 ng/m L,灵敏度IC50=0.689 ng/m L。建立了液-液提取样品前处理方法,前处理净化后稀释10倍可消除基质效应,雌三醇牛奶样品加标回收率为94.9%~115.2%,CV<15%。与ELISA法相比,BA-ELISA具有更高的灵敏度,适于低浓度雌三醇的检测。

人生长激素的生物素-亲和素放大酶联免疫法的建立

为建立有生物素和亲和素放大系统的人血清生长激素 (hGH)酶联免疫分析法 (BA ELISA) ,以微量的GH抗原免疫BALB/C小鼠 ,利用杂交瘤技术制备出 2 9株分泌抗hGH单克隆抗体 (MCA)的杂交瘤株。选择最佳配对MCA ,利用亲和素与生物素高亲和力的特性 ,建立了血清hGH双位点的BA ELISA法。我们的MCA滴度为 (0 5～ 5 0 0 )× 10 4,亲和常数Ka =(0 13～ 1 40 )× 10 10 L/mol。血清hGH的ELISA的灵敏度为 0 0 4± 0 0 1μg/L ;在血清中分别加入 1,2 5 ,5 μg/L的hGH ,其回收率为 90 7%～ 10 7 6 % (平均为 10 1 2 0 %± 0 0 3 % ) ;hGH含量为 2 8、10 0、2 9 8μg/L的血清批内、批间变异系数分别为 4 9%、3 8%、7 9%和 6 2 %、3 5 %、9 5 % ;用本法测定了正常儿童、生长激素缺乏症 (GHD)患儿和活动性肢端肥大症患者空腹血清hGH水平 ,分别为 1 87± 3 0、0 30± 0 42和 8 71± 6 95 μg/L。上述结果表明 ,本ELISA方法灵敏、特异、稳定、准确 ,能确切反映hGH分泌功能 ,在诸多方面均优于RIA。

双抗体夹心生物素-亲和素ELISA法检测相思子毒素

目的建立相思子毒素(abrin)的酶联免疫检测方法,为abrin临床诊断、中毒治疗、法医学鉴定等应用领域提供技术基础和参考依据。方法采用双抗体夹心生物素-亲和素ELISA法来检测微量abrin。结果该法检测abrin线性范围为0.125～31.25μg/L,线性回归方程为Y=0.52369X+0.51632(r=0.9816,P<0.0001,n=9),检测限为0.125μg/L。不同浓度蓖麻毒素(ricin)、葡萄球菌肠毒素(SEB)对检测结果基本无干扰,表明该法检测abrin具有很好的特异性。该法能用于abrin毒素污染水样、土样、食品、血液等模拟样品的分析,相对标准差为2.35%～4.14%,具有较好的重现性。结论成功建立了夹心BA-ELISA法检测abrin,巧妙地将多克隆抗体的强富集能力、单克隆抗体的特异性以及生物素-亲和素系统的放大作用结合起来,达到了提高检测的灵敏度和特异性的目的,可适用于各种微量abrin样品的分析。

人血清癌胚抗原的生物素-亲和素ELISA检测方法的建立

目的:建立检测血清癌胚抗原(CEA)的高灵敏度生物素-亲和素酶联免疫检测(BA-ELISA)方法。方法:亲和层析纯化得到CEA,免疫新西兰家兔制备多克隆抗体。将得到的抗体连接生物素和辣根过氧化物酶,在生物素化BSA包被的96微孔板上建立生物素-亲和素ELISA(BA-ELISA)。对这一体系的线性、灵敏度、特异度、稳定性、回收率等参数进行鉴定,并和常规ELISA、放射免疫检测以及化学发光法相比较检测了临床标本中的CEA浓度。结果:线性检测范围为(0.42～50)U/mL,检测结果表明,体系稳定性良好;灵敏度为0.42 U/mL,批内、批间差异均小于10.0%。该研究建立的方法与常规ELISA对比差异有统计学意义,与放射免疫检测对比差别无统计学意义。与化学发光法相比较,回归方程为:y=0.04825+0.99674x,r=0.994,差异无统计学意义。结论:建立的CEA的BA-ELISA检测方法易于操作、灵敏度高、价格低廉,适合应用于临床检测。

检测华支睾吸虫特异性IgG4生物素-亲和素复合酶联免疫吸附法的建立及检测效能分析

目的探讨亲和素-生物素复合酶联免疫吸附法(ABC-ELISA)检测特异性Ig G4抗体用于诊断华支睾吸虫病的效果。方法建立检测华支睾吸虫特异性抗体Ig G4的ABC-ELISA法(Ig G4-ABC-ELISA),以此方法检测华支睾吸虫病、日本血吸虫病、卫氏并殖吸虫病、弓形虫病、棘球蚴病、囊尾蚴病和曼氏裂头蚴病患者血清样本。以Ig G4-ELISA和Ig GELISA法为对照,比较3种方法用于诊断华支睾吸虫病的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值及诊断效率。结果成功建立了用于检测华支睾吸虫特异性抗体的Ig G4-ABC-ELISA法,用此方法检测华支睾吸虫病患者血清特异性抗体Ig G4的敏感性为90.0%,特异性为98.2%,阳性预测值为93.8%,阴性预测值为97.0%,诊断效率为96.3%;Ig G4-ELISA法检测华支睾吸虫病患者血清特异性抗体敏感性为86.0%,特异性为98.2%,阳性预测值为93.5%,阴性预测值为95.9%,诊断效率为95.4%;Ig G-ELISA法检测华支睾吸虫病患者血清特异性抗体Ig G的敏感性为94.0%,特异性为88.1%,阳性预测值为70.1%,阴性预测值为98.0%,诊断效率为89.4%。Ig G4-ABC-ELISA法检测华支睾吸虫病患者血清特异性抗体的敏感性高于Ig G4-ELISA法(P<0.05),特异性高于Ig G-ELISA法(P<0.05)。结论 Ig G4-ABC-ELISA法检测华支睾吸虫特异性抗体IgG4具有高度敏感性与特异性,在华支睾吸虫病诊断中具有较好应用价值。

生物素—链霉亲和素免疫学测定地高辛的研究

方法为竞争酶联免疫吸附方法，待测物质为血清中地高辛，采用国产链霉素和素直接包被塑料板孔，生物素标记地高辛抗体。其测定灵敏度为0．0964μg/L,最低检测限为0．225μg/L,测定三份低、中、高浓度的血清标本，批内变异系数分别为8．9％、5．9％和2．4％；批间变异系数分别为15．8％，10．1％和9．2％，测定回收率在89．1％－107．22％之间，此法与FPIA方法相关良好（r=0.9488).

生物素—亲和素体系测定雌酮

雌酮与牛血清白蛋白共价结合,合成雌酮的完全抗原.利用此抗原免疫小鼠,通过细胞融合技术制备了雌酮的单克隆抗体经纯化表征知,抗本是IgGl型,相对分子量为164000,与固定抗原的亲和常数为8 2×108L/mol. 以生物素化的羊抗鼠免疫球蛋白及辣根过氧化物酶标记的链亲和素为标记体系,通过竞争抑制的方式测定游离的雌酮.结果表明:雌酮在10～10000

原花青素对脑缺血再灌注小鼠脑组织细胞因子、一氧化氮合酶和血脑屏障的影响

目的探讨葡萄籽原花青素对缺血再灌注小鼠脑组织细胞因子、一氧化氮合酶和血脑屏障通透性的影响。方法采用夹闭小鼠双侧颈总动脉30 min再灌注72 h的脑缺血再灌注模型,并于双侧颈总动脉夹闭时及再灌注后每隔24 h分别腹腔注射蒸馏水、葡萄籽原花青素(10、20及40 mg/kg)和尼莫地平(2 mg/kg)。在处死动物前1 h经尾静脉注射2%伊文思蓝,采用ABC-ELISA法检测脑组织中白细胞介素1β和白细胞介素10含量,采用分光光度法检测脑组织中一氧化氮合酶活性及伊文思蓝含量。同时光镜观察小鼠海马CA1区脑组织的病理变化。结果与假手术组相比,缺血再灌注组脑组织中白细胞介素1β含量、一氧化氮合酶活性及伊文思蓝含量明显增高(P<0.01),而白细胞介素10含量降低,但无统计学意义。与缺血再灌注组相比,葡萄籽原花青素及尼莫地平治疗组脑组织中白细胞介素1β含量、一氧化氮合酶活性及伊文思蓝含量有不同程度的降低,而白细胞介素10含量有不同程度的升高。病理学组织检查发现,葡萄籽原花青素能改善脑缺血再灌注所造成的神经细胞损伤,减少神经细胞坏死。结论葡萄籽原花青素可能通过降低小鼠脑缺血再灌注时一氧化氮合酶活性和促炎因子白细胞介素1β含量,提高抗炎因子白细胞介素10含量进而降低血脑屏障的通透性而发挥脑保护作用。

金葡菌肠毒素SEC2的抗体制备及应用

生产厂家以金葡菌肠毒素C2(SEC2)的标示量作为金葡素注射液的质量控制标准,但其真正的含量由于滤液成分复杂而很难检测,本实验试图建立一种方便的鉴定金葡素注射液中的SEC2的方法。首先将重组的SEC2分别免疫BALB/c小鼠和新西兰兔,制备并纯化了单克隆及多克隆抗体。采用自制的抗体建立了检测SEC2的生物素-链霉亲和素酶联免疫吸附实验,检测目标蛋白的质量浓度范围为2～20ng.mL-1,在检测范围内检测值的平均变异系数为5.08%,采用本法检测质量浓度分别为100ng.mL-1的重组肠毒素(SEA/SEO/SEM/SEN/SEG/SEI),均呈现阴性反应,说明此检测方法的专一性较好。采用此方法对金葡素注射液中的SEC2含量进行了检测,发现SEC2标识量与实际含量存在一定的差距。

水产品中孔雀石绿BA-ELISA检测方法的建立及应用

建立了基于生物素-链霉亲合素放大的酶联免疫吸附法(BA-ELISA)检测水产品中的孔雀石绿(MG)含量的方法。优化了包被原和生物素化抗体的工作浓度,以及封闭液、温育时间、pH值和盐离子强度等实验条件。结果显示,最佳实验条件为:包被原和生物素化抗体的稀释倍数均为1∶ 2 000,封闭液为1%明胶,抗原抗体反应时间为 60 min ,缓冲液的pH值为7.0,盐离子强度为0.1 mol/L。在此条件下,该方法的线性范围为0.05~20.00 ng/mL,检出限(LOD)为0.037 μg/kg,回收率为83.5%~115.0%,变异系数( CV )为4.53%~13.80%。将该方法用于实际样品的分析检测,检测结果与LC/MS相比,具有较好的相关性。上述结果表明,本实验建立的方法灵敏度高,特异性和稳定性较好,可用于水产品中MG的分析筛查。

嗜水气单胞菌BA-ELISA的建立及其在病原检测中的应用

从中华鳖中分离的嗜水气单胞菌致病株T0608经福尔马林灭活后,注射免疫新西兰兔,制备了高价免疫血清,血清的菌体凝集效价可达1/1 280;G蛋白亲和层析纯化兔IgG,将IgG用生物素标记,建立了生物素-亲和素双抗体夹心酶联免疫吸附法(BA-ELISA);其最低检出限为2.5×103cfu,相当于0.5 ng菌体蛋白,其检测灵敏度为ABC-ELISA(4.0×104cfu)和间接ELISA(4.0×104cfu)的16倍;特异性试验结果表明,本法与鱼类气单胞菌、拟态弧菌、海豚链球菌、大肠杆菌等无交叉反应。BA-ELISA可不经细菌培养直接检测人工感染48 h中华鳖的肝、肠道组织中的嗜水气单胞菌。用该方法对湖州市龟鳖养殖场的水样、中华鳖和巴西龟肝、肠道内容物进行检测,结果表明该方法可较好地应用于发病中华鳖的病原早期诊断及养殖中华鳖的病原检测。

检测土拉弗朗西斯菌的生物素—亲和素ELISA法的建立

〔目的〕建立一种快速、敏感、特异检测土拉弗朗西斯菌的免疫学方法。〔方法〕应用生物素-亲和素标记系统,建立双抗体夹心ELISA方法,检测土拉弗朗西斯菌,并进行"模拟样品"的检测判定其定量检测能力。〔结果〕建立的生物素—亲和素ELISA检测土拉弗朗西斯菌的方法具有很好的敏感性和特异性,检测FopA蛋白的灵敏度达到6ng/ml;批内变异系数1.96%～6.64%,批间变异系数8.94%～10.02%,重复性好;检测不同浓度马秋波GP2蛋白、天花M1R蛋白、黄热YF-E-D3蛋白、禽流感NP蛋白、登革病毒Deng-E-D3蛋白和普氏立克次体120N蛋白,未发现交叉反应;对"模拟样品"中土拉弗朗西斯菌FopA蛋白的检测回收率为91.7%～125.0%。〔结论〕应用生物化的FopA多抗与酶标亲合素结合,建立了检测土拉弗朗西斯菌的生物素—亲和素放大酶联免疫吸附法(BSA-ELISA),具有较好的灵敏度和特异性,在病原菌的识别、快速检测、应对生物恐怖威胁中具有广阔的应用前景。

雌鼠抗透明带抗体检测及结果分析

目的建立大鼠抗透明带抗体的检测方法,探讨抗透明带抗体与母鼠年龄的关系。方法用BA-ELISA法,检测了28只老年母鼠、20只青年母鼠血清抗透明带抗体,并与40只正常妊娠大鼠对照。结果老年母鼠组阳性率为32．14%,青年母鼠阳性率为15．00%,正常妊娠大鼠阳性率为5．00%;抗透明带抗体阳性14例,总阳性率为15．9%(14/88)。结论用BA-ELISA法能够检测大鼠血清抗透明带抗体,正常妊娠组抗透明带抗体含量低。

特应性皮炎和湿疹患者血清金黄色葡萄球菌肠毒素B特异性抗体的检测及其意义

目的探讨特应性皮炎(AD)和湿疹患者血清金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)特异性抗体水平及其意义。方法采用多中心、随机双盲、对照法,将118例AD和207例湿疹患者分为莫匹罗星治疗组和对照组,于治疗前和治疗28d取血清行间接酶联免疫吸附测定法测定抗SEB特异性IgG、IgM水平,采用链霉亲和素-生物素法检测抗SEBIgE水平。结果治疗前,抗SEBIgE水平AD组显著高于正常人对照组(P=0.019)和湿疹组(P=0.048),湿疹组与正常人对照组之间差异无统计学意义(P=0.883);抗SEBIgM水平AD组(P=0.012)和湿疹组(P=0.000)均显著高于正常人对照组,AD组与湿疹组之间差异无统计学意义(P=0.088);抗SEBIgG水平各组间均差异无统计学意义(P=0.897)。临床症状评分与抗SEBIgE水平之间AD组(P=0.842)和湿疹组(P=0.134)均无显著相关性。治疗28d后,抗SEBIgM水平AD组显著下降(P=0.003),湿疹组亦显著下降(P=0.000),但治疗组与对照组间AD组(P=0.331)和湿疹组(P=0.815)差异均无统计学意义。结论AD和湿疹患者血中抗SEBIgM、IgE升高,反映皮损处近期金黄色葡萄球菌定植并参与了皮肤变应性炎症性反应。

NTX在兔实验性骨不连早期诊断中的作用

目的建立骨不连的动物模型,发现实验性骨不连的生化指标变化规律。方法选取纯种新西兰大白兔分为两组,实验组在前臂桡骨中段截除1.5 cm（包括骨膜）,骨断端用骨蜡封闭髓腔,对照组只是在前臂桡骨中段造成骨折,两组分别于术前、术后2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、10周、12周进行X线检查及抽取血样。骨形成特异标志物选择：骨特异性碱性磷酸酶（bone-specific alkaline phosphatase,BSAP）。骨吸收特异标志物包括Ⅰ型胶原氨基端末肽（N-terminal telopeptide of type I collagen,NTX）,人抗酒石酸酸性磷酸酶5b（tartrate-resistant acid phosphatase5b,TRACP 5b）。检测方法采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）。结果实验组第2周3例有少许骨痂形成,但5周后骨痂情况稳定,术后8周仍无一例愈合。骨折组术后2周开始骨折线模糊,术后6~8周骨痂大量生长。两组间的BSAP、NTX有统计学意义（NTX F值187.512,P〈0.001。BSAP F值16.051,P=0.001）,BSAP术前、术后两组内各数值无统计学意义,TRACP 5b术前术后、组间、组内各数值无统计学意义。实验组NTX在术后5周开始出现明显下降,术后5周与术前术后各个时间均有统计学意义,术后7周、8周、10周、12周均与术后3周、4周、5周有统计学意义,术后6周以后NTX水平基本稳定。结论新西兰大白兔骨不连缺损的模型可以选择为前臂桡骨中段,截除1.5 cm（包括骨膜）,骨断端用骨蜡封闭髓腔。多个血清生化指标的检测有益于骨折愈合过程的临床评估。术后5周,NTX的显著下降,是否可以早期诊断兔实验性骨不连。

胆管癌细胞神经转移与其基质金属蛋白酶-9的表达及其意义

我们采用双抗体夹心式酶联免疫吸附法（ELISA）检测人胆管癌细胞株（QBC939）在神经、淋巴组织中基质金属蛋白酶（MMP）的表达，探索MMP在胆管癌的特异性神经、淋巴结转移中的分子生物学机制。