基于数据分析及生物膜干涉探讨中医治疗糖尿病肾病的用药规律

目的 探讨中医治疗糖尿病肾病(DN)的用药规律,分析核心成分与关键靶点的相互作用。方法 利用古今医案云平台DN专病医案库进行中药频次统计、关联分析,发掘中医治疗DN的组方规律。通过筛选中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)和疾病数据库获得药对治疗DN的靶点,建立成分-蛋白互作网络,对靶点进行京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析,明确活性成分与核心靶点、通路的对应关系。运用分子对接及生物膜干涉的方法检测活性成分与核心靶点的结合程度。结果 在183条医案所载录方剂中,黄芪的使用频次与平均使用剂量均最高,分别为43次与37 g,其次是丹参与茯苓。以黄芪为基础,关联分析到置信度最高的核心组合为黄芪-丹参-茯苓。网络药理学筛选到黄芪-丹参-茯苓治疗DN的关键信号通路15条,潜在靶点89个,其中肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、NOD样受体信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路为疾病相关通路,白细胞介素(IL)-6、TNF、血管内皮生长因子A(VEGFA)为核心靶点。药对中的2个活性成分异鼠李素、槲皮素与IL-6均具有较高的结合力,对接得分分别为8.2和7.4,解离常数(KD)分别为5.6×10-5和6.8×10-5mol·L^(-1)。结论 初步发现以黄芪-丹参-茯苓为核心药对治疗DN的组方规律,异鼠李素、槲皮素可能是其治疗DN的主要药效物质,为DN临床治疗及中药活性成分挖掘提供了依据。

生物膜干涉法检测花生蛋白与花生过敏患者血清IgE的结合能力

探索基于生物膜干涉技术对花生蛋白与花生过敏患者血清中免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)的结合能力进行检测的方法。利用链霉亲和素(streptavidin,SA)标记的传感器、生物素化的羊抗人IgE抗体、花生过敏患者血清池以及花生蛋白建立了一种测定花生蛋白与花生过敏患者血清IgE结合能力的新方法,优化检测条件为抗体1∶100稀释后线下固化20 min,血清1∶10稀释后过夜结合,完成传感器修饰。在线洗基线后用质量浓度为1 mg/mL的花生蛋白与传感器结合3 600 s,解离120 s。利用该法对不同热加工后花生蛋白与患者血清IgE的结合能力进行评估,并与常用的酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测进行比较。结果表明,本方法可以直接评估过敏原蛋白与血清IgE的结合能力,与ELISA结果相关系数达到0.91。热加工中,油炸处理提高了花生蛋白的IgE结合能力,水煮和烘烤降低了花生蛋白的IgE结合能力,且去壳热加工比带壳热加工花生的蛋白的IgE结合能力更强。

生物膜干涉技术在生物分子间相互作用检测中的应用

生物膜干涉技术可以实现生物分子之间相互作用的实时分析检测,广泛应用于高校科研实验室的药物开发过程,是一种非标记的、实时监测的先进技术。本文结合生物分子相互作用分析系统的技术原理和实际使用情况,详尽叙述了其在生物分子间相互作用检测的方法和应用,旨在为相关领域的科研工作者提供实验帮助和参考。

应用生物膜干涉技术检测鱼腥藻HetR结合靶DNA的亲和力

鱼腥藻PCC7120是一种固氮丝状蓝藻,当环境中化合态氮源充足时,其藻丝只有进行光合作用的营养细胞;在环境中缺乏可利用的氮源时,部分营养细胞会在藻丝上以一种半规律的格式分化成异形胞（异形胞间隔约10个营养细胞）,从而进行固氮作用。早在1984年,Wolk实验室通过与大肠杆菌接合转移的方式,成功地将穿梭质粒转入鱼腥藻PCC7120,建立了遗传转移系统。在2001年,日本Kazusa研究中心完成了对鱼腥藻PCC7120全基因组测序。

基于生物膜干涉技术检测PDL1抗体与PDL1抗原的亲和力

生物膜干涉(biolayer interferometry,BLI)技术可对抗体与抗原的相互作用进行亲和力、动力学的全面分析。在抗体克隆筛选、动力学常数测定中对链霉亲和素(streptavidin,SA)生物传感器的需求量较大,但目前鲜有关于SA传感器重复利用的报道。基于BLI技术、再生SA生物传感器建立一种使用再生后的传感器检测PDL1抗体与PDL1抗原亲和力的方法。通过将生物素化的PDL1抗原偶联至SA生物传感器上,再与单链抗体、双价单链抗体、完整抗体和双特异性抗体这4类PDL1抗体结合,计算抗原抗体的亲和力常数,利用甘氨酸(10 mmol·L^(-1),pH 1.7)再生SA传感器,再次进行分子间相互作用力分析。结果显示,重复性相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均值为6.87%,批间重复性RSD为0.82%,稳定性RSD均值为6.13%,说明运用甘氨酸再生后的SA生物传感器测分子间的亲和力数据可靠、重现性好、稳定性高,再生后的传感器可继续用于本样品的实时、无标记的抗原抗体相互作用力分析。BLI技术可节省检测成本,为SA传感器的重复利用提供理论依据。

用生物膜干涉技术快速检测牛乳中β-内酰胺类抗生素残留

[目的]采用生物膜干涉技术建立快速检测牛乳中β-内酰胺类抗生素残留的方法。[方法]首先通过疏水作用力在APS光线生物传感器探头末端固定氨苄青霉素-BSA偶联物,结合40 nm纳米金标记的β-内酰胺类抗生素受体,建立了检测牛乳中β-内酰胺类抗生素的方法。[结果]生物膜干涉技术检测牛乳中的β-内酰胺类抗生素的灵敏度比胶体金免疫层析试纸条的灵敏度高1倍。该技术还具有良好的特异性,与浓度为1 000 ng/ml的黄曲霉毒素M1、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、泰乐菌素、氯霉素、三聚氰胺无交叉反应。[结论]研究表明,金标记BLI检测β-内酰胺类抗生素的定量范围较小,并不适用于实际生产中的定量检测,但却是一种简便、快捷的定性检测方法,可用于牛乳中β-内酰胺类抗生素残留的快速检测。

生物膜干涉技术、HPLC及ELISA在抗体定量检测中的比较分析

目的比较3种方法定量检测抗体样品的异同，为抗体药物研发和生产过程中不同类型的样品定量检测选择合适的方法提供依据。方法分别利用生物膜干涉技术、ProteinG—HPLC以及双抗体夹心ELISA法建立定量检测抗体样品的方法，比较其检测的准确度、精密度及其检测特点。结果3种方法检测同一抗体样品的含量基本一致，生物膜干涉技术检测值相对标准偏差最小（CV〈5％），HPLC次之（CV〈8％）．ELISA法的CV值为5％～15％。结论生物膜干涉技术检测快速，结果精确，通量高，无需样品前处理，适合于样品筛选以及发酵原液、中间品等检测；ProteinG-HPLC检测准确，线性范围宽，回收率高，认可度高，适合于样品含量的确证；ELISA法最低检测限值小，操作简单，仪器要求低，适合于微量样品的检测。

过敏原表位肽与血清IgE结合能力的生物膜干涉法检测

现有血清学方法不能实现过敏原表位肽段与IgE结合能力的定量检测和实时动态观察,生物膜干涉(biolayer interferometry,BLI)技术有望弥补这一缺点。本研究选取花生过敏原Ara h 2的一个表位肽及其点突变体为检测对象,利用生物素标记的羊抗人IgE抗体偶联亲和素标记的生物传感器,特异性结合花生过敏患者血清IgE后,再监测花生过敏原表位肽及其突变体与IgE结合和解离的过程,并计算亲和力常数,评价它们的IgE结合能力。结果显示,表位肽及其突变体与花生过敏患者IgE的亲和力常数介于2.04×10-4到2.11之间。关键氨基酸的突变对亲和力常数影响较大,将过敏原表位肽中的34Q突变34N,38E突变为38D后,其IgE结合能力降低为1/2366。这说明BLI技术可以检测过敏原表位肽与IgE的结合能力,关键氨基酸分子量的减小或疏水性的增加,有望降低过敏原肽段的IgE结合能力。

基于网络药理学及生物膜干涉技术分析冠心宁片抗冠状动脉粥样硬化的作用机制

目的运用网络药理学、生物膜干涉技术研究冠心宁片抗冠状动脉粥样硬化的作用机制。方法利用中药系统药理学分析平台(TCMSP)检索冠心宁片中丹参、川芎的活性成分及对应靶点,与GENECARD及DisGeNET数据库获得的冠状动脉粥样硬化靶点进行整合。使用Cytoscape3.7.1软件及STRING、DAVID 3.0数据库构建蛋白-蛋白、活性成分-靶蛋白的作用网络,并进行GO及KEGG富集分析。应用生物膜干涉技术验证主要活性成分与关键靶点的结合强度。结果检索到冠心宁片活性成分72个,主要包括木犀草素、丹酚酸B、杨梅酮、丹参新醌丁、二氢丹参内酯等;活性成分与冠状动脉粥样硬化共有靶点17个,包括VEGFA、IL6、TNF、SERPINE1、PTGS2等;涉及一氧化氮生物合成、凝血及纤溶等生物过程,补体和凝血级联、TNF、HIF-1等信号通路。生物膜干涉实验发现丹酚酸B与COX-2存在结合作用。结论冠心宁片主要通过抑制炎性反应、调节凝血及纤溶系统、改善血管功能等多靶点、多通路抗冠状动脉粥样硬化。

生物膜干涉技术快速定性检测牛乳中喹诺酮类药物残留

[目的]基于生物膜干涉技术建立一种快速检测牛乳中喹诺酮类抗生素残留的方法。[方法]通过疏水作用力在APS光线生物传感器探头末端固定环丙沙星-BSA偶联物,结合纳米金-喹诺酮类抗生素单克隆抗体偶联物,建立了检测牛乳中喹诺酮类抗生素的方法。[结果]所建立的检测方法具有良好的灵敏度,比免疫层析法至少高出1倍。该检测方法还具有良好的特异性,与浓度1 000ng/ml的黄曲霉毒素M1、青霉素G、头孢噻呋、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、泰乐菌素、氯霉素、三聚氰胺无交叉反应。该方法还具有良好的重复性,不同基质牛乳检测对检测结果无显著影响。分别采用免疫层析试纸条和建立的金标记BLI检测方法检测43份牛乳(原奶)样品中的喹诺酮类抗生素残留,二者检测结果一致。[结论]生物膜干涉技术检测牛乳中的喹诺酮类抗生素为一种简便、快捷的检测方法,可以用于牛乳中喹诺酮类抗生素残留的快速定性检测。

多光谱法、分子对接模拟和生物膜干涉研究槲皮素与小窝蛋白-1的相互作用

小窝蛋白-1(CAV-1)在动脉粥样硬化等心血管疾病的发生发展中发挥关键作用。为了解槲皮素与CAV-1的相互作用,在模拟生理环境和不同温度条件下,采用多光谱法、同源模建、分子对接模拟和生物膜(BLI)技术进行研究。荧光猝灭数据结果显示,猝灭速率常数Kq值远大于2.0×10^(10) L·mol^(-1)·s^(-1),且猝灭常数KSV随温度升高而降低,证明槲皮素和CAV-1相互作用的猝灭过程为静态猝灭;而热力学参数,焓变ΔH<0、熵变ΔS<0且ΔG<0,表明二者的结合过程是自发、焓驱动的,其相互作用的主要类型为范德华力和氢键作用。通过对槲皮素与CAV-1相互作用的同步荧光光谱和三维荧光光谱分析,随着槲皮素的加入,CAV-1的荧光强度逐渐降低,证明二者之间发生了相互作用。进一步分析发现,同步荧光光谱中槲皮素使CAV-1中的芳香族氨基酸残基的最大发射波长发生了轻微红移,周围的微环境极性增强,亲水性增加,表明槲皮素的加入使CAV-1的蛋白质构象发生了改变。紫外-可见光谱结果显示,CAV-1与槲皮素之间形成了一个基态复合物,进一步证实了CAV-1与槲皮素之间的静态猝灭机制。采用同源模建技术建立CAV-1的X射线晶体结构模板。分子对接模拟结果显示两者结合力为-7.372 kcal·mol^(-1)。对接结果表明槲皮素结合点位于由GLU20,ASP70,VAL16和ARG19等氨基酸形成的活性口袋中,与GLN21,VAL16和ARG19位点产生范德华力作用,与GLU20,ASP70位点存在氢键作用力。各种作用力影响了CAV-1的微环境变化,导致其荧光猝灭,是参与复合物形成的关键因素。最后,利用BLI技术对槲皮素和CAV-1的结合进行定量研究,研究结果显示,二者具有良好的的结合活性,结合解离平衡常数K_(D)值为2.50×10^(-5) mol·L^(-1);其响应信号值随槲皮素浓度的升高而增强,表明CAV-1与槲皮素之间存在特异性结合。该研究有助于了解槲皮素与CAV-1的相互作用机制,为槲皮素治疗动脉粥样硬化的作用靶点研究提供参考。

单克隆抗体与Fc受体结合力检测的生物膜层干涉方法

采用生物膜层干涉技术建立了一种准确评估单克隆抗体与Fc受体结合力的方法。通过优化关键参数,包括配体固化浓度、高度、结合时间和分析物浓度,确定了最佳的实验条件:配体固化浓度为10μg/mL,固化高度控制低于0.5 nm,单克隆抗体与Fc受体结合时间为90 s,检测分析物浓度低于100 nmol/L。实验结果显示,该方法能形成良好的结合解离曲线,不同浓度范围内呈现明显的跨度,并且具有良好的实验重复性。这种无需标记的单克隆抗体与Fc受体结合力检测方法,对于研究蛋白相互作用以及复杂生物样品的检测具有重要意义。

应用生物膜干涉技术测定治疗性单抗与新生儿Fc受体的亲和力

目的:建立基于生物膜干涉(Biolayer interferometry,BLI)技术检测治疗性单抗与新生儿Fc受体(neonatal Fc receptor,FcRn)亲和力的方法。方法:链霉亲和素(streptavidin,SA)偶联传感器结合生物素标记FcRn后,使用稀释液(0.1%BSA/0.05%Tween20/PBS,p H 6.0)封闭传感器后采用BLI方法检测,以稀释液1∶2系列稀释样品(浓度范围为125~16 000 nmol·L^(-1)),空白对照采用未结合FcRn的传感器检测上述系列稀释样品。结果采用Steady state analysis方式拟合,计算样品平衡常数(KD)值,计算样品各自的95%可信区间(confidence interval,CI),对不同抗体与FcRn的亲和力进行比较。结果:Ig G-FcRn结合曲线呈现明显的快结合-快解离形态。应用建立的方法检测不同单抗与FcRn的亲和力结果:bevacizumab与FcRn的亲和力较trastuzumab高95%,存在显著性差异;bevacizumab生物类似药(similar biotherapeutic products,SBP)-1与FcRn亲和力较原研药(reference biotherapeutic products,RBP)有32%的升高,且有显著性差异。其他Cys-偶联药物前后、Lys-偶联药物前后、表达细胞系由SP2/0更换为CHO均未对Ig G-FcRn亲和力产生影响。结论:建立了优化的基于生物膜干涉技术检测Ig G抗体与FcRn亲和力测定方法,可用于单抗及抗体偶联药物与FcRn亲和力的评价。

生物膜层干涉技术在生物分子分析和检测中应用的研究进展

生物膜层干涉技术是基于光干涉信号实现对生物分子动力学分析或快速检测的非标记分析检测技术。因具有实时提供分析物信息、分析速度快和样品耗量少等优点,该技术已被应用于蛋白质、核酸、脂质、糖类及其他生物分子之间相互作用的分析;所需样品量少、特异性强等优点也为该技术应用于快速检测奠定了基础。该文介绍了生物膜层干涉技术的基本原理,综述了其在动力学分析和快速检测领域的相关应用研究,并对其发展趋势和应用前景进行了展望。

基于光学检测的分子间相互作用表征技术研究进展

分子间相互作用的表征技术是阐明细胞生物学事件、了解疾病发生机制、辅助药物研发的有力手段。近年来,分子间相互作用的表征技术发展迅速,不断向着高灵敏度、高通量、极短时间、极低检测限的方向发展。本文对表面等离子体共振、生物膜干涉、背向散射干涉以及微量热泳动这4种常见的、基于光学检测的分子间相互作用表征技术的原理、特点及最新应用进展进行了综述与比较,为分子间相互作用表征技术的选择提供参考。

基于BLI技术的BamAβ-barrel结合化合物检测方法的建立

目的以革兰阴性菌外膜蛋白折叠辅助因子关键蛋白BamA为靶蛋白,基于生物膜干涉(Biolayer interferometry,BLI)技术建立化合物与BamA蛋白β折叠结构域(BamA_(β-barrel))结合活性的评价方法,为建立靶向BamA蛋白的抗革兰阴性菌先导物奠定基础。方法应用BLI方法检测BamA_(β-barrel)与已知的阳性化合物darobactin的结合活性。原核表达并纯化带有His标签的大肠埃希菌BamA_(β-barrel)蛋白,使用表面活性剂LDAO对其进行复性和折叠;使用生物素标记折叠和未折叠蛋白,并结合到超级链霉亲和素(super streptavidin,SSA)生物传感器,然后检测蛋白与不同浓度的darobactin结合信号的变化,同时做无蛋白或darobactin稀释液对照;空白对照采用未结合生物素化的BamA_(β-barrel)蛋白的传感器,检测上述系列稀释样品。相应信号采用Steady state analysis方式拟合分析,计算平衡常数(KD)值。结果成功获得高纯度的折叠状态BamA_(β-barrel)蛋白,通过BLI技术检测到折叠状态的BamA_(β-barrel)与阳性化合物darobactin具有良好结合活性且呈现浓度依赖性,R^(2)为0.9998,KD值为(2.2E-06±8.0E-08)M。结论基于BLI技术成功建立了折叠状态的BamA_(β-barrel)-化合物结合活性的评价方法,为后续BamA蛋白靶向性抗革兰阴性菌抗生素的发现建立基础。

动物源性食品中氯霉素残留的快速筛查方法

以氯霉素半琥珀酸酯为母体直接偶联物固着在传感器末端形成具有双层结构的生物膜,通过检测端面生物膜层厚度变化所引起的光谱相位改变,实现样品中氯霉素的快速检测。结果表明,该传感器表现出良好的抗干扰性、重复性和稳定性,所建立的检测方法具有良好的灵敏度,不同样品基质检测对检测结果无显著影响。分别采用液相质谱和建立的金标记检测方法分析水性样品,其目标物检测结果一致,该方法检测下限为0.0125 ng/mL。生物膜干涉技术具有快捷、灵敏、特异性等特点,可在8 h内提供快速、特异的检测结果,尤适合大批量样品的现场快速筛查。

β-乳球蛋白对VE热稳定性的影响

为改善超高温瞬时灭菌(ultra-high temperature instantaneous sterilization,UHT)乳中VE的热稳定性,以β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)和VE为材料制备复合物,探究β-LG对VE热稳定性的影响。通过浊度、粒径、Zeta电位、扫描电子显微镜、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、红外光谱和荧光光谱研究β-LG与VE的结合情况;利用生物膜干涉技术进一步分析β-LG与VE之间的结合程度;通过高效液相色谱法测定普通强化乳(添加VE)和复合物强化乳(添加β-LG/VE复合物)中UHT前后的VE含量并计算VE热损失率,以确定β-LG对VE热稳定性的影响。结果表明,β-LG可以通过氢键和疏水相互作用与VE结合形成复合物,β-LG与VE结合后,可以减少VE在水溶液中的聚集,使VE的溶解性增加;生物膜干涉技术也证明β-LG与VE之间存在结合,亲和力常数为7.493×10^(-2) mol/L;复合物强化乳中VE损失率为(4.01±0.18)%,显著低于普通强化乳((10.90±0.17)%)(P<0.05)。以上说明,β-LG可以显著提高VE的热稳定性,为开发维生素强化乳制品提供理论基础。

T7噬菌体展示人肺癌cDNA文库筛选丹参-人参组分复方靶点研究

目的通过噬菌体展示技术筛选丹参-人参组分复方(丹参总酚酸、人参总皂苷、人参多糖)的作用靶点。方法经过T7噬菌体展示人肺癌c DNA文库的4轮淘选,获得阳性噬菌体克隆,随机挑选10个克隆进行DNA提取和测序。基因序列用Ex PASy网站的Translate tool查找开放阅读框(ORF)。选取代表性多肽用生物膜干涉技术检测亲和力。结果 4轮淘选后阳性噬菌体克隆得到高度富集,10个样品中7个有相同的DNA序列,长度为471 bp(序列1),另外3个完全一致,长度为58 bp(序列2)。序列1得到4个ORFs,序列2未进行分析。丹参-人参组分复方和多肽His-MNTGRFGKTTSSPALTLGNFQKPL亲和力最高,K_D=4.57×10^(-8)mol/L,人参多糖、丹参总酚酸和多肽亲和力分别为K_D=7.23×10^(-8)mol/L、K_D=7.66×10^(-8)mol/L,人参总皂苷与多肽没有典型的结合和解离效应。结论本研究获得了与丹参-人参组分复方高亲和力多肽,为丹参-人参组分复方肺癌靶向治疗研究提供依据。

植物乳杆菌KLDS1.0391 PurR和PurL蛋白的原核表达、纯化及其与细菌素合成启动子的相互作用

通过体外实验探究purR、purL基因对植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KLDS1.0391细菌素合成是否具有直接调控作用。基于植物乳杆菌KLDS1.0391全基因组序列,通过聚合酶链式反应扩增得到PurR和PurL蛋白的编码基因,构建原核表达载体,将重组质粒导入大肠杆菌M15中进行诱导表达,采用镍柱亲和层析法纯化得到目的蛋白,透析后超滤浓缩,通过凝胶阻滞实验以及生物膜干涉技术研究两种蛋白与菌株细菌素合成调控区域是否具有结合作用。结果表明,PurR蛋白以可溶性蛋白形式存在,PurL蛋白以包涵体蛋白形式存在,纯化后经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示条带单一,达到电泳纯,经过浓缩后PurR蛋白质量浓度为0.74 mg/mL,PurL蛋白质量浓度为3.8 mg/mL。凝胶阻滞实验以及生物膜干涉技术结果表明,2个重组蛋白与菌株细菌素合成基因的启动子在菌体外无直接的结合作用,对于两种蛋白对细菌素合成的调控是否属于间接调控作用以及在菌体内的调控情况,需进一步研究。