鸽屠宰加工环节金黄色葡萄球菌肠毒素、生物膜形成能力及其相关基因的检测

为了解鸽屠宰加工环节中金黄色葡萄球菌的肠毒素、生物被膜形成能力、肠毒素及生物被膜形成相关基因的情况。采用金黄色葡萄球菌肠毒素酶联免疫分析试剂盒和结晶紫染色法检测41株金黄色葡萄球菌的肠毒素含量和生物被膜形成能力,同时通过PCR方法扩增金黄色葡萄球菌12种肠毒素基因和10种生物被膜形成相关基因。41株金黄色葡萄球菌在肠毒素酶联免疫法检测中,有30株为产肠毒素的菌株。肠毒素基因的检测中,有35株菌含肠毒素基因,检出率为85.36%,且有携带一种或多种肠毒素基因的情况。经典肠毒素基因的检出率分别为:sea(29.27%)、seb(29.27%)、sec(4.88%)、sed(65.85%)和see(2.44%);新型肠毒素基因的检出率分别为:sel(36.59%)、seg(29.27%)、sem(17.07%)、seu(17.07%)、sei(14.63%)、seh(7.32%)和sek(0.00%)。结晶紫染色法测定菌株生物被膜形成能力弱、中等和强的检出率分别为39.02%、43.90%和17.07%。生物被膜形成相关基因的检测中,clfB、luxS和clfA的检出率最高均为100.00%,其次是sarA和ccp均为97.56%,sigB、cna、icaA、agrC的检出率分别为85.37%、65.85%、41.46%、2.44%,bap未检出。此外,所有菌株均有携带多种生物被膜相关基因的情况,以携带7种基因的菌株最多(15/41,36.59%)。鸽屠宰加工环节污染中金黄色葡萄球菌存在较多的肠毒素且生物被膜形成能力较高,预测该鸽屠宰加工环节中金黄色葡萄球菌具有致病性,存在引起食物中毒的潜在风险。

四种藏兽医药用植物和屎肠球菌联用对大肠杆菌E6生物被膜的影响

采用改良结晶紫半定量法和微量肉汤稀释法分别对152株大肠杆菌进行生物被膜形成能力分析和12种常用抗菌药物敏感性试验。同时,利用棋盘稀释法评价四种藏兽医药用植物(马蹄黄、偏翅唐松草、华丽龙胆和岩生忍冬)不同提取部位(甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和石油醚)、屎肠球菌乙酸乙酯提取物与高耐药率抗生素(氯霉素、土霉素、氨苄西林和磺胺甲噁唑)联合对10株多重耐药大肠杆菌(E1-E10)杀菌活性,以探讨不同药物组合对E6生物被膜的清除作用。实验结果显示:152株大肠杆菌多表现为中等成膜能力和无成膜能力表型,对氯霉素、磺胺二甲嘧啶、土霉素、氨苄西林、磺胺甲噁唑的耐药率均高于90%,对二氟沙星、环丙沙星、阿米卡星、头孢噻呋、妥布霉素和头孢曲松的耐药率均低于50%,其中阿米卡星的敏感率最高,耐药率仅为19.90%;马蹄黄甲醇提取物、偏翅唐松草乙酸乙酯提取物、华丽龙胆甲醇提取物和岩生忍冬乙酸乙酯提取物、屎肠球菌S16和S17乙酸乙酯提取物对E1~E10的MIC范围分别为3.93~15.63、3.93~31.52,7.81~15.63、7.81~31.52、0.42~13.38和0.45~3.63 mg/mL;四种藏兽医药用植物不同提取部位和屎肠球菌乙酸乙酯提取物与高耐药率抗菌药物分别呈现不同的联合作用;在MIC浓度下,药物联合对E6表现出较强的生物被膜清除能力,其中岩生忍冬和偏翅唐松草乙酸乙酯提取物与土霉素和氨苄西林联用对E6生物被膜的抑制率高于其他组合,岩生忍冬和偏翅唐松草乙酸乙酯提取部位与土霉素联用的抑制率分别为48.92%、42.58%,与氨苄西林联用的抑制率分别为48.58%、47.84%。选用的四种藏兽医药用植物、益生菌和抗菌药物联合应用在一定程度上能够解决本研究藏猪和藏鸡源大肠杆菌耐药性和生物被膜形成等问题。

大肠埃希菌生物被膜形成能力及超广谱β-内酰胺酶检测

目的了解大肠埃希菌临床分离株生物被膜的形成能力及对常用抗菌药物的耐药特性,以便指导临床更合理使用抗菌药物。方法半定量微量板法检测389株大肠埃希菌临床分离株生物被膜形成情况。采用表型确证试验检测超广谱β-内酰胺酶(ESBLs),药敏试验采用K-B法。结果389株大肠埃希菌中有301株生物被膜形成阳性,阳性率为77.4%,其中绝大部分形成中等或较大量的生物被膜;能形成生物被膜的大肠埃希菌中产ESBLs酶占53.2%(160/301);产酶的生物被膜菌对12种抗菌药物(除亚胺培南全部敏感外)的耐药率均较高。结论大肠埃希菌临床分离株生物被膜形成能力非常强,耐药及多重耐药性较严重。

铜绿假单胞菌鞭毛基因fliI的敲除对其鞭毛形成及生物膜生成的影响

目的探讨铜绿假单胞菌鞭毛相关基因fliI的缺失对其鞭毛生长、生物膜形成及运动能力的影响。方法应用Red同源重组技术构建铜绿假单胞菌鞭毛相关基因fliI的缺失株,通过菌落形态观察、动力试验、生物膜检查以及扫描电镜菌体观察等比较fliI基因缺失后对铜绿假单胞菌活力的影响。结果与原始菌株比较,fliI缺失株的菌落迁徙能力减弱,细菌运动能力下降,生成的生物膜附着能力下降;但fliI基因缺失株仍有鞭毛存在。结论铜绿假单胞菌fliI基因的缺失不影响其鞭毛的形成,但可使得其运动能力减弱和生物膜产生受抑,可能导致其致病性降低。

食源性金黄色葡萄球菌的生物被膜形成能力及其基质组成研究

为了控制食品生产环境中金黄色葡萄球菌生物被膜污染,对分离自河北省不同食物样品的33株金黄色葡萄球菌的生物被膜形成能力及其基质组成进行了研究。首先,使用微效价板培养生物被膜,结果表明,在培养24和48h后,分别有13和16个菌株形成了强弱不同的生物被膜,其中,生牛乳来源的菌株产生物被膜能力较强。然后,分别使用蛋白酶K和DNaseⅠ处理不同菌株的生物被膜,结果表明,在所有菌株的生物被膜基质中,都含有蛋白质和DNA组分,但是在大多数菌株的生物被膜基质中,蛋白质是一种重要的组分,而DNA不是一种主要组分。

基于RNA-Seq技术分析不同生物被膜形成能力的临床耐药鲍曼不动杆菌基因表达差异

目的了解不同生物被膜形成能力的临床分离耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌菌株(CRAB)基因表达的差异。方法选取8株临床分离CRAB,将生物被膜形成能力强的菌株4、55、78、117号作为强生物被膜(BF)组,将生物被膜形成能力弱的菌株13、177、191、196号作为弱生物被膜(WBF)组,培养两组菌株形成生物被膜,分别提取RNA进行文库构建和转录组测序(RNA-Seq),以鲍曼不动杆菌AB030(NZ_CP009257.1)的基因组作为参考基因组对测序数据进行分析,鉴定差异表达基因(DEGs),并进行基因本体(GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,选取8个DEGs利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证转录组测序结果。结果RNA样品完整无污染,测序数据错误率为0.03%;BF组与WBF组相比,鉴定到171个DEGs,其中106条基因为上调表达,65条基因为下调表达;这些基因主要涉及DNA结合、膜蛋白、菌毛调控、ATP的合成和分解等;GO分析显示较多基因被注释到生物过程部分,KEGG分析显示DEGs富集到多种物质代谢途径;选取的8个DEGs利用qRT-PCR进行验证,结果与转录组测序结果趋势一致。结论不同生物被膜形成能力的临床CRAB的基因表达存在差异,多基因和多条信号通路影响生物被膜的形成。

壳聚糖及其季铵盐对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响

目的探讨壳聚糖(CHI)及其衍生物可能具有的广谱抗菌作用。方法采用CHI、壳聚糖季铵盐(QCHI)进行铜绿假单胞菌体外抑菌试验。采用CHI和QCHI分别作用0、3、6、9、12 h,每个时间点取1 mL菌液进行菌落计数并与对照孔比较,同时抽提铜绿假单胞菌RNA,扩增其ahpF、pa3187、aprA和rpoS基因,并检测各基因表达水平;剩余铜绿假单胞菌用LB培养基培养3 d,PBS缓冲液冲洗浮游细菌,结晶紫染色,95%乙醇脱色后用酶标仪570 nm检测并比较铜绿假单胞菌生物膜的形成能力。结果与对照孔比较,自6 h起CHI和QCHI孔的存活菌量即有明显差异(P<0.05);但CHI孔和QCHI孔之间差异无统计学意义。CHI和QCHI均可使铜绿假单胞菌pa3187基因表达上调,aprA基因表达下调;QCHI可使ahpF基因表达下调,而CHI可使ahpF基因表达上调;QCHI对rpoS基因的表达有下调趋势。从6 h起,CHI和QCHI对铜绿假单胞菌生物膜的形成均有明显的抑制作用。结论 CHI及QCHI能在一定程度上抑制铜绿假单胞菌的增殖及其生物膜的形成。

膜生物反应器处理废水硝化/反硝化能力研究

本研究采用前置缺氧/好氧膜生物反应器(Anoxic/Oxic M em brane Bioreactor,A O M B R)处理废水,分别对N H4+-N及总氮(TN)的去除效果、硝化/反硝化能力以及影响因素进行了研究。试验结果表明:在碳源充足、水力停留时间(H RT)为6.5h、污泥泥龄(SRT)为30d、pH值范围为7.0～8.5条件下,进水N H4+-N平均值为240m g/L时,反应器能够保持良好的硝化、反硝化能力,出水N H4+-N值能稳定在2.5m g/L左右,平均去除率为98.5%,TN平均去除率为65%。

猪链球菌的分型鉴定及其体外形成生物被膜的研究

通过生化试验及PCR等方法对13株猪链球菌进行鉴定分型,用结晶紫染色(CV)和扫描电镜(SEM)的方法对其形成生物被膜的能力进行研究,并对形成的生物被膜进行形态观察。结果显示:经鉴定的13株猪链球菌中1株为1型,4株为9型,2株为7型,另2株为2型,其他菌株为未知;13株菌均能形成生物被膜,其中1号、2号、3号、4号、7号、9号、10号、12号、13号菌形成生物被膜能力较弱,5号、6号、8号、11号菌形成生物被膜能力中等。这些结果为研究猪链球菌致病性及为生物被膜研究提供物质基础。

致犊牛脑炎大肠杆菌生物膜形成特性的研究

目的探讨致犊牛脑炎大肠杆菌生物膜形成能力及相关特性。方法本试验以致犊牛脑炎大肠杆菌NJY9957株为对象,设定不同pH、不同温度以及不同时间,于96孔板上制备生物膜,结晶紫染色后酶标仪测OD 600nm值,倒置显微镜观察生物膜形态,确定其生物膜形成的最适条件;在最适条件下,与肠内共生型及禽肠外致病性大肠杆菌同时培养制备生物膜并进行比较。结果致犊牛脑炎大肠杆菌NJY9957株生物膜最适形成条件是温度为37℃,培养基pH=7.0,培养时间为24 h;在最适条件下,与肠内共生型及禽肠外致病性大肠杆菌相比较,共生型大肠杆菌形成生物膜能力较强。结论确定了致犊牛脑炎大肠杆菌NJY9957株形成生物膜的最适条件,并比较了其与肠内共生型及禽肠外致病性大肠杆菌生物膜的形成能力,细菌生物膜的形成能力与其粘附、侵袭、耐药性以及毒力有关。

健康牦牛源大肠杆菌耐药性、生物被膜能力及Ⅰ类整合子检测

试验分别采用微量肉汤稀释法、改良结晶紫半定量染色法和普通PCR方法对分离自健康牦牛的大肠杆菌进行耐药性、生物被膜能力及Ⅰ类整合子检测。结果表明:分离菌株对利福平、氟苯尼考和头孢噻呋的耐药率较高,对多西环素和庆大霉素次之,对氟喹诺酮类恩诺沙星和左旋氧氟沙星的耐药率在30%以上。96.84%的菌株有不同的生物被膜表型,只有3.16%的菌株无生物被膜形成能力,且大多数菌株表现出弱的生物被膜表型,占菌株总数的57.52%。30.82%的菌株携带Ⅰ类整合酶基因intⅠ1。

屎肠球菌临床分离株的耐药性及生物膜形成与毒力因子的相关性分析

目的分析陕西地区屎肠球菌临床分离株的耐药性、生物膜及溶血性的相关性。方法收集西安市某大型三甲医院2017年5月-8月临床标本分离的174株屎肠球菌分离株。药敏法测定其耐药表型,结晶紫法测定其生物膜形成能力,并定量检测其溶血活性,多分类Logistic回归检验菌株多重耐药性、溶血活性及生物膜形成能力的关联。结果屎肠球菌对β-内酰胺类抗菌药物的耐药比例高于90%,只检出1株利奈唑胺耐药,未检出万古霉素耐药。女性患者标本的分离株对青霉素的耐药率高于男性(χ2=4.925,P=0.027)。尿标本中屎肠球菌的分离率最高(67/38.5%),其分离株对喹诺酮类和β-内酰胺类、红霉素的耐药性显著高于非尿液标本(χ2=6.578,P=0.010;χ2=8.797,P=0.003;χ2=9.533,P=0.002)。分离株的生物膜阳性率为66.7%(116/174),溶血阳性率为90.2%(157/174),对β-内酰胺类和喹诺酮类抗生素耐药的菌株中生物膜阳性率高于生物膜阴性率、溶血阳性率低于溶血阴性率。分离株的主要多重耐药谱型为左氧氟沙星、环丙沙星、青霉素、氨苄西林和红霉素多重耐药菌(72/41.4%),其中73.6%形成生物膜,该谱型耐药且形成生物膜的菌株中86.8%的菌株溶血阳性;多重耐药谱型为左氧氟沙星、环丙沙星、青霉素、氨苄西林、红霉素和四环素的多重耐药菌(62/35.6%),其中71.0%形成生物膜,该谱型耐药且形成生物膜的菌株中的95.5%溶血阳性。菌株的5重耐药性与溶血活性负向关联(RRR=0.46,P=0.030),与生物膜形成能力正向关联,但差异无统计学意义(RRR=1.984,P=0.051)。结论在屎肠球菌引起的感染,特别是泌尿系统感染的临床治疗中应避免经验使用β-内酰胺类、喹诺酮类及红霉素类抗生素,以降低生物膜形成,有效控制细菌耐药的产生和发展。

犬源奇异变形杆菌的分离鉴定及生物学特性、诱导结石形成能力研究

为了评估引起犬结石病原菌的耐药性、致病性及诱导结石形成的能力,试验从泌尿系统结石反复发作、伴有血尿的宠物犬尿液中分离到1株细菌,并对其进行了革兰氏染色、培养特性分析、分子生物学鉴定、药敏试验、生物被膜形成能力和结石形成能力检测。结果表明:分离株为革兰氏阴性菌,无芽孢及荚膜,具有多形态性,呈杆状、球状;能产生脲酶分解尿素,具有溶血性,可迁徙生长;分离株16S rRNA基因核苷酸序列与参考菌株的同源性为99.1%~99.4%,证明为奇异变形杆菌;分离株仅对第四代头孢抗生素头孢吡肟敏感,对其他种类药物耐药;分离株能够形成生物被膜,使尿液产生大量结晶。说明犬源奇异变形杆菌具有较高的耐药性和致病性,可诱导形成结石,严重威胁人类健康。

环境因素对哈密瓜细菌性果斑病病菌生物膜形成的影响

为研究哈密瓜细菌性果斑病病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli,简称Aac)在不同培养条件下形成生物膜的能力,选用微孔板体外培养、结晶紫染色、分光光度测定法检测哈密瓜细菌性果斑病病菌在不同载体、培养基、培养温度、培养时间、葡萄糖浓度、初始p H值条件下生物膜的形成能力。结果发现,在11种供试载体中,Aac在聚苯乙烯表面易形成稳定、明显的生物膜;在供试的6种培养基中,牛肉膏蛋白胨培养基(LB)形成生物膜能力最强;以LB为培养基、聚苯乙烯孔板为载体、初始p H值为7、培养温度28℃、培养24 h、葡萄糖浓度为30.0 mmol/L时,Aac形成生物膜能力最强。结果表明,不同载体、培养基、培养温度、培养时间、葡萄糖浓度、初始培养p H值均对Aac生物膜形成能力有明显影响。研究结果能为有效阻止Aac生物膜形成、有效防治哈密瓜细菌性果斑病病菌提供理论依据。

山东地区驴源沙门氏菌的分离鉴定及其生物学特性比较分析

为了解山东地区驴源沙门氏菌的流行情况及其生物学特性,试验将采自山东多地的14份驴流产病料及137份驴粪便样本分别接种于沙门氏菌显色培养基中对沙门氏菌进行分离培养,提取细菌基因组DNA后采用双重PCR方法判定分离菌是否为沙门氏菌并进一步判定是否为马流产沙门氏菌,并对分离到的沙门氏菌进行血清型鉴定、生化试验、细菌运动力和生物膜形成能力检测及药敏试验,选取部分菌株进行致病性试验,并采用双层平板法检测分离菌对9株噬菌体A18028、C59102、F59102、F18024、F18038、E17016、DS2、DS4、5FS4的敏感性。结果表明:从驴流产病料中共分离到14株马流产沙门氏菌(A1~A14株);从驴粪便样本中共分离到22株其他血清型沙门氏菌(F1~F22株),其中F1株为山夫顿堡沙门氏菌,F2、F3、F4、F5、F7、F8、F9、F10、F12、F13、F15株为肯塔基沙门氏菌,F6、F11株为Give沙门氏菌,F14株为乙型副伤寒Java型沙门氏菌,F16、F20株为阿哥纳沙门氏菌;F17株为鼠伤寒沙门氏菌,F18、F19株为汤卜逊沙门氏菌,F21株为阿伯丁沙门氏菌,F22株未鉴定出血清型;36株分离菌均符合沙门氏菌属的生化特性,但马流产沙门氏菌与其他血清型沙门氏菌生化特性略有差异;14株马流产沙门氏菌的平均运动力较22株其他血清型沙门氏菌弱;36株沙门氏菌均能形成生物膜;36株沙门氏菌对链霉素、庆大霉素、哌拉西林的耐药率较高,对亚胺培南和美罗培南的耐药率为0;小鼠接种A2株14 d后的死亡率为100%,接种F14株和F20株14 d后死亡率分别为50.0%和62.5%,接种F1、F2、F6、F18、F21、F22株14 d后无死亡情况;14株马流产沙门氏菌对9株噬菌体均敏感,而22株其他血清型沙门氏菌对9株噬菌体的敏感性不同,其中沙门氏菌F1、F6、F11株仅对1株噬菌体敏感,F18、F19、F20株对9株噬菌体均不敏感。说明不同沙门氏菌的生物学特性存在差异,马流产沙门氏菌对噬菌体具有很高的敏感性。

池塘生物膜低碳养殖模式及对水质影响的试验研究

我国淡水养殖产量约占全世界养殖产量的68%,其中池塘养殖是最主要方式。近些年来农村的水产养殖业获得迅猛发展,已经成为推动农村经济发展的支柱产业,逐渐成为促进农村经济发展的主要增长点。然而由于追求高产量,养殖密度大于水体的养殖容量,大量残饵、肥料及生物代谢物的累积,导致水体自净能力下降,加剧了水体富养化,养殖自身污染日趋严重,引发养殖生态系统失衡。采用微生物修复养殖水体,不但能有效消除污染物、净化水质,而且能够抑制水中有害微生物的繁殖,改善养殖生态环境。

铜绿假单胞菌临床菌株生物被膜的定量分析

目的定量分析铜绿假单胞菌临床分离株生物被膜形成能力。方法采用平板培养结合结晶紫染色法建立生物被膜定量检测法,用该法对56株铜绿假单胞菌临床分离株的生物被膜形成能力进行分析。结果平板培养结合结晶紫染色法可对铜绿假单胞菌生物被膜形成能力进行定量检测。在所检测的56株铜绿假单胞菌中,46株(82.1%)具有生物被膜形成能力,其中生物被膜形成能力弱者为16株(28.6%),生物被膜形成能力强者为30株(53.6%);10株菌(17.9%)不能形成生物被膜。结论绝大多数铜绿假单胞菌临床分离株具有生物被膜形成能力,半数以上菌株具有较强的生物被膜形成能力。

表皮葡萄球菌AtlE蛋白介导生物膜起始黏附的相关机制

目的探讨表皮葡萄球菌atlE基因编码的AtlE蛋白介导生物膜起始黏附的相关机制。方法采用RT-PCR法检测表皮葡萄球菌atlE基因在不同时期的表达水平，用紫外分光光度计检测DNA的方法检测了相应时期的胞外DNA的释放量，并用DNA酶（DNase□）研究表皮葡萄球菌胞外DNA在生物膜形成和起始黏附中的作用；采用pBT2质粒同源重组敲除的方法构建了表皮葡萄球菌1457的atlE基因突变株。研究atlE基因敲除突变对起始黏附能力、生物膜形成及胞外DNA释放能力的影响。结果表皮葡萄球菌atlE基因的表达与胞外DNA的释放量有相关性；DNA酶能影响未成熟生物膜且能降低起始黏附能力；□atlE菌株胞外DNA的释放减少，起始黏附能力明显降低，不形成生物膜。结论表皮葡萄球菌atlE基因编码的AtlE蛋白能通过释放胞外DNA在表皮葡萄球菌的生物膜起作用。