生物钟蛋白Rev-erbα激动剂抑制高脂饮食诱导小鼠前列腺组织炎症的实验研究

目的验证生物钟蛋白Rev-erbα激动剂是否能够抑制高脂饮食诱导的小鼠前列腺组织炎症,并探讨其机制。方法C57B/6J雄性小鼠分为4组:普通饮食组;高脂饮食组;高脂饮食+SR9009组;高脂饮食+control组。检测小鼠体重、外周血胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)及前列腺重量。前列腺组织HE染色并转录组测序,免疫组化评估IL-6、IL-8、IL-1β、NF-κB-P65和CCL21的表达水平。结果与普通饮食组相比,高脂饮食组小鼠的体重、前列腺指数、血清TG和TC水平均明显升高,高脂饮食+SR9009组小鼠的体重、前列腺指数、血清TG和TC水平明显低于高脂饮食+control组。HE染色,高脂饮食组小鼠前列腺组织内炎性细胞浸润较普通饮食组增多,SR9009干预后的高脂饮食小鼠前列腺组织炎性细胞浸润减少。转录组测序差异基因分析NF-κB通路中的Ccl21a、Ccr7、Tlr4、Il6、Il1b、Cxcr2的表达水平在高脂饮食组较普通饮食组升高,而其表达水平在高脂饮食+SR9009组较高脂饮食+control组降低。IL-6、IL-8、IL-1β、NF-κB-P65和CCL21a在4组小鼠前列腺中的表达强度差异趋势与测序结果的差异趋势一致。结论生物钟蛋白Rev-erbα可能通过NF-κB通路调节高脂饮食诱导的前列腺组织炎症水平。

生物钟蛋白Rev-erbα在不同程度的前列腺组织炎症中的表达变化

目的:探讨良性前列腺增生(BPH)人群中前列腺组织炎症与生物钟蛋白Rev-erbα表达的相关性。方法:收集诊断为BPH并行经尿道前列腺手术的前列腺组织标本。对前列腺组织进行炎症程度分级。免疫组化(IHC)评估前列腺组织中CD4、CD8、白细胞介素(IL)-6、IL-8、IL-1β和Rev-erbα的表达情况;qRT-PCR检测前列腺组织中IL-1β、IL-6和IL-8和Rev-erbα的表达水平。分析前列腺组织炎症程度与前列腺组织Rev-erbα表达强度的相关性。结果:收集84例BPH组织标本,73例(86.9%)伴有不同程度的组织炎症。IHC提示前列腺组织中不同炎症程度与炎症因子(IL-6、IL-8和IL-1β)表达强度一致;组织炎症细胞中,CD4^(+)细胞数量远多于CD8^(+)细胞数量;前列腺组织中Rev-erbα的表达强度与前列腺组织炎症程度呈负相关,其相关系数为-0.691(P<0.001)。qRT-PCR提示不同的前列腺组织炎症程度与组织中IL-1β、IL-6、IL-8的mRNA表达差异趋势一致,与组织中Rev-erbα的mRNA表达差异趋势相反。结论:生物钟蛋白Rev-erbα可能在前列腺组织中有降低组织局部炎症的作用,可能成为防治前列腺组织炎症的潜在靶点。

生物钟蛋白Bmal1对实验性牙周炎相关肾损伤的影响

目的通过建立大鼠牙周炎模型,探讨生物钟蛋白Bmal1对慢性牙周炎相关肾损伤的影响。方法将12只雄性Wistar大鼠随机分为对照组和牙周炎组,每组6只。采用正畸结扎丝对牙周炎组大鼠双侧上颌第一磨牙进行结扎处理,对照组大鼠不进行任何干预措施。8周后,检测2组大鼠的牙周临床指标,包括牙周探诊深度、牙龈出血指数和牙齿松动度。采用Micro-CT对大鼠上颌骨进行扫描和三维图像重建,评估牙槽骨吸收情况。采用苏木精-伊红(HE)和过碘酸雪夫(PAS)染色对牙周组织和肾组织进行病理学观察。采用生化试剂盒检测肾脏功能指标肌酐、白蛋白、血尿素氮的水平,以及氧化应激指标超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和丙二醛的水平。MitoSOX red染色检测肾组织内活性氧(ROS)含量。实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和免疫组织化学染色检测大鼠肾组织中Bmal1、核因子-E2相关因子2(Nrf2)和血红素加氧酶1(HO-1)的基因及蛋白表达水平。结果与对照组相比,牙周组织Micro-CT及HE染色结果显示,牙周炎组上颌第一磨牙区出现明显的骨吸收和附着丧失;肾组织HE及PAS染色结果表明,牙周炎组大鼠肾组织有显著的组织病理损伤;肾功能和氧化应激指标结果显示,牙周炎组的氧化应激水平出现异常而肾功能指标无明显异常;MitoSOX red结果显示,牙周炎组肾组织内ROS含量升高;RT-qPCR和免疫组织化学结果显示,牙周炎组肾组织内Bmal1、Nrf2和HO-1表达水平降低。结论生物钟蛋白Bmal1在牙周炎大鼠肾脏的氧化损伤过程中发挥重要作用。

生物钟PRR蛋白促进拟南芥幼苗中花青素的合成

生物钟(circadian clock)是激发植物生理特征节律性表达,并使之维持稳定的保守内源调节机制。PRR(PSEUDO-RESPONSE REGULATOR)蛋白家族是生物钟中央振荡器的重要组成部分,调控植物的种子萌发、下胚轴伸长和开花等多种生命过程。花青素(anthocyanin)是植物次生代谢产物,对植物的繁衍、生长发育和抵抗逆境胁迫具有重要作用。该研究以拟南芥(Arabidopsis thaliana)为对象,探讨生物钟PRR蛋白对花青素生物合成的调控功能和分子机制。结果表明:(1)在PRR基因单突变体及多突变体幼苗中,花青素的积累明显降低,某些花青素合成相关基因的表达也显著降低。(2)相反,在PRR5过表达幼苗中,花青素的积累以及某些花青素合成相关基因的表达则显著升高。(3)蛋白相互作用结果显示,PRR5蛋白能与MYB75、TT8、MYB90及MYB113等花青素调控蛋白相互作用,并形成复合物。(4)遗传学分析结果显示,拟南芥PRR5诱导幼苗中花青素的合成依赖于MYB家族花青素调控蛋白。综上认为,生物钟PRR蛋白可能通过PRR5与MYB75、TT8等相互作用,促进拟南芥幼苗中花青素的合成和积累。该研究结果对发掘PRR蛋白新的生物学功能,以及深入理解生物钟信号调控植物幼苗的环境适应性具有重要意义。

REV-ERB蛋白在生物钟中发挥关键作用

圣路易斯大学药理和生理科学Thomas Burris博士等揭示了能调控“生物钟蛋白”活性的小分子，提供了潜在调控昼夜节奏和治疗与它有关的功能障碍如睡眠和焦虑症问题。研究结果发表在Nature Communications杂志上。

生物钟蛋白TIMELESS对乳腺癌细胞增殖和侵袭转移的差异调控

生物钟蛋白TIMELESS是生物体周期节律相关的核心分子钟的一员。TIMELESS可以调节细胞的增殖和代谢,DNA损伤的识别和修复等。研究发现,TIMELESS的表达与肝癌、肺癌、结直肠癌和鼻咽癌等的发生发展明显关联。在乳腺癌中,TIMELESS的调节作用和机制仍不十分清晰。本文分别研究了TIMELESS在乳腺癌细胞增殖和转移方面的调控作用。通过细胞增殖实验发现,TIMELESS可明显促进乳腺癌细胞的增殖。克隆形成实验发现,在乳腺癌细胞ZR-75-30和T-47D中,TIMELESS过表达分别上调克隆数量约1.6倍和1.8倍。通过报告基因检测对雌激素信号通路的研究发现,TIMELESS和雌激素受体ERα(estrogen receptor)共表达与单转ERα相比,使得雌激素受体ERα的转录活性提高约3倍;而通过对于Basal型乳腺癌患者生存曲线分析发现,Timeless高表达与basal型乳腺癌患者的生存率正相关。基于此,我们进一步研究了TIMELESS对于乳腺癌细胞转移的调控作用。通过细胞划痕实验和F-肌动蛋白组装检测发现,TIMELESS抑制乳腺癌细胞的转移;同时,TIMELESS敲低提高了乳腺癌细胞的转移数量约1.6倍,并下调了上皮标志物E-钙黏着蛋白的表达,上调了间质标志物N-钙黏着蛋白表达。本研究提示,TIMELESS在调控乳腺癌的增殖和转移过程中存在差异调控,即TIMELESS促进乳腺癌细胞增殖,而抑制了乳腺癌细胞的转移。这为生物钟蛋白质调控乳腺癌的发生发展提供了分子基础,同时为乳腺癌的分型治疗提供了一定的理论依据。

利用酵母双杂交研究铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiB的自身相互作用

从铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)PCC7820中克隆了生物钟基因kaiB,并将其克隆入酵母双杂交系统的两个质粒pGADT7和pGBKT7中。经测序验证后,将重组质粒pGADT7-kaiB和pGBKT7-kaiB转化酵母菌AH109进行自激活性和自身相互作用的检测和验证。结果表明,铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiB无自激活性,KaiB蛋白自身能发生相互作用。因此,可用KaiB蛋白为诱饵利用酵母双杂交系统筛选文库钓取与KaiB发生相互作用的蛋白。

表观遗传对生物钟基因的调控在肿瘤中的作用

生物钟在分子水平上受生物钟基因的转录-翻译反馈环的调控,并参与协调各种生物活动的24 h昼夜节律,包括细胞代谢、细胞增殖、细胞凋亡、肿瘤发生等,来维持机体的稳态。因此,生物钟的紊乱将打破机体的稳态,导致多种疾病,包括肿瘤、代谢综合征、帕金森病、慢性阻塞性肺疾病及各类心血管疾病等。生物钟的紊乱与肿瘤发生发展密切相关,生物钟的紊乱通过作用于多种分子和途径,导致肿瘤发生,例如癌基因和抑癌基因、细胞周期、代谢重编程、肿瘤免疫逃逸、破坏内分泌稳态、改变肠道菌群等。该文聚焦于生物钟基因表达的改变对细胞周期的扰乱在肿瘤发生发展中的作用,以及表观遗传调控生物钟基因的表达在肿瘤中的重要作用。

棉铃虫生物钟蛋白质TIME-EA4同源基因克隆及分子进化分析

时间间隔测定酶(TIME-EA4)是近年在家蚕中首先发现的一种生物测时蛋白质,具有正常的SOD酶活性与酯酶ATPase瞬时活性,参与家蚕滞育卵的活化调控。利用RACE技术克隆了棉铃虫TIME-EA4的同源基因Haea4(GenBank登录号:GU143551),全长cDNA 799 bp,编码199个氨基酸,蛋白质等电点为5.45,相对分子质量18 768.88,含有1个Cu/Zn SOD核心结构域。RT-PCR分析发现,Haea4基因在棉铃虫的头、中肠、脂肪体、生殖腺、体壁、丝腺中均有高量表达。氨基酸遗传距离和同源性分析结果,棉铃虫的TIME-EA4与家蚕和野蚕间的遗传距离分别为0.536、0.548,同源性均为44%;分子进化分析表明,棉铃虫和家蚕、野桑蚕的TIME-EA4同源蛋白质都与Cu-Zn/SOD蛋白的进化距离较近,蛋白质二级结构分析也显示,棉铃虫与家蚕TIME-EA4基本特性有很大相似性。

生物钟基因Rev-erb和ROR在抗炎及免疫调节中的作用研究进展

生物钟广泛存在于生物体,调节生物的生长发育。随着生物钟分子机制的逐步明确,学者发现生物钟基因Rev-erb和ROR参与许多生理过程,并在抗炎及免疫调节过程中发挥重要作用。针对该类受体的靶向研究可用于调控机体免疫。该文重点介绍生物钟基因Rev-erb和ROR在抗炎及免疫调节中的作用,包括该受体的相关作用机制及针对该受体的配体研究。

铜绿微囊藻生物钟蛋白的表达纯化与抗体制备

为了获得融合表达的铜绿微囊藻（Microcystic aeruginosa）生物钟蛋白KaiA、KaiB、KaiC并制备其相应的多克隆抗体,将kaiA、kaiB、kaiC基因分别克隆到原核表达质粒pET-His中.重组质粒pET-His-KaiA,pET-His-KaiB和pET-His-KaiC经酶切和测序鉴定后,分别转化E.coli BL21（DE3）进行融合表达.经SDS-PAGE分析可知,融合表达的KaiA、KaiB和KaiC蛋白表达量可分别达到菌体总蛋白的25%、40%和20%.经亲和层析后融合蛋白KaiA和KaiB的纯度分别达95%和92%,而KaiC经胶回收纯化后纯度也可达93%.将纯化后的三种Kai蛋白作为抗原分别免疫小鼠制备多克隆抗体,经ELISA检测抗体滴度表明,制备的抗KaiA、抗KaiB和抗KaiC的多克隆抗体效价高,分别可达到1：50000、1：60000和1：100000.Western blotting结果表明：获得的多克隆抗体具有较高的效价,抗体能识别相应的Kai蛋白,具有较高的特异性,能用于铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiA、KaiB和KaiC的表达节律检测.

利用酵母双杂交系统筛选玉米ZmPRR73的互作蛋白

为了阐明 ZmPRR73基因的生物学功能,构建诱饵表达载体pGBKT7-ZmPRR73,利用酵母双杂交技术,从长日照光照环境诱导的热带玉米自交系的cDNA文库中筛选与ZmPRR73互作的蛋白。结果显示:构建的诱饵载体pGBKT7-ZmPRR73对酵母菌株无毒性,且对报告基因无自激活活性,共鉴定出12个与ZmPRR73互作的候选蛋白。生物信息学分析表明,这些候选互作蛋白的功能涉及植物的转录调控、离子跨膜转运的调节、信号转导、电子传递链等多个方面,推测ZmPRR73蛋白与以上蛋白互作参与多个信号转导和代谢途径,研究结果补充和完善了ZmPRR73蛋白参与的调控途径,为进一步研究生物钟核心元件ZmPRR73的分子功能提供了新的分子证据。

乙型肝炎病毒X蛋白A1762T/G1764A双突变对肝癌细胞生物钟基因表达的影响

目的研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)A1762T/G1764A双突变对肝癌细胞生物钟基因表达的影响。方法将Bel-7404细胞接种于6孔板中,待细胞生长至60%融合时按照Lipofectamine2000的说明书分别将1.0μg的pc DNA3.1-HBx和pc DNA3.1-m HBx(A1762T/G1764A双突变)质粒转染肝癌细胞系Bel-7404细胞。采用Realtime PCR和Western blotting法检测Bel-7404细胞中CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、CKIεmRNA及蛋白表达。结果与转染pc DNA3.1-HBx相比,转染A1762T/G1764A双突变的pc DNA3.1-m HBx表达载体后Bel-7404细胞中Clock、Bmal1、Per2、Per3、Cry1、Cry2 mRNA和蛋白表达均降低(P均<0.05)。结论 HBx A1762T/G1764A双突变可引起肝癌细胞生物钟基因表达紊乱。

科学家发现影响生物钟节律蛋白质

很多植物春季开花,秋季结果;夜行动物白天睡大觉,夜晚则四处＂狩猎＂。例如,十字花科植物——拟南芥的生物周期约为24h;果蝇通常白天活动,夜晚休息。决定这些生理节律的生物周期被称为＂生物钟＂。

美科学家发现一种将生物钟与新陈代谢关联起来的蛋白质

据东方网2008年8月1日援引《科技日报》消息，美国加州大学欧文分校药理学系教授保罗·撒森·柯西及其同事，在2008年7月25日出版的《细胞》杂志上发表了相关论文，公布了他们的研究成果。

生物钟基因Per家族在肝内胆管癌组织中的表达及意义

目的探讨生物钟基因同期蛋白Per家族(Per1、Per2、Per3)在肝内胆管癌发生发展中的作用。方法采用免疫组化法检测60例肝内胆管癌患者癌组织及癌旁组织中Per1、Per2、Per3蛋白的表达,分析三者与肝内胆管癌患者临床病理特征的关系。结果肝内胆管癌组织、癌旁组织Per1蛋白阳性表达率分别为41.7%、93.3%,Per2蛋白阳性表达率分别为31.7%、88.3%,Per3蛋白阳性表达率分别为43.3%、91.7%,肝内胆管癌组织中Per1、Per2及Per3蛋白的阳性表达率均低于癌旁组织(P均<0.05)。肿瘤直径≥5 cm者Per2、Per3蛋白的阳性表达率低于直径<5 cm者(P均<0.05)。肿瘤组织有血管侵犯者Per2、Per3蛋白的阳性表达率低于无血管侵犯者(P均<0.05)。结论 Per1、Per2及Per3蛋白在肝内胆管癌组织中表达均降低,可能与肝内胆管癌的发生发展有关。

AFP对正常肝细胞和肝癌细胞生物钟基因表达的影响

目的探讨甲胎蛋白(AFP)对正常肝细胞和肝癌细胞生物钟基因表达的影响。方法将AFP过表达的慢病毒载体感染正常肝细胞L02细胞和肝癌细胞株SMMC-7721细胞构建AFP过表达的正常肝细胞系和肝癌细胞系,分别通过real-time PCR法和Western blotting法检测细胞中生物钟基因Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、NPAS2的mRNA与蛋白。结果与转染AFP空载体L02细胞相比,AFP过表达的L02细胞中Clock的表达上调,Bmal1、Per1、Per2、Per3的表达下调(P均<0.05)。与转染AFP空载体SMMC-7721细胞相比,AFP过表达的SMMC-7721细胞中Clock的表达上调,Bmal1、Per1、Per2、Per3、Cry1的表达下调(P均<0.05)。结论AFP可引起正常肝细胞和肝癌细胞生物钟基因表达紊乱,这可能是AFP促进肝癌细胞恶性生物学行为的原因之一。

生物钟基因Period2对卵巢癌裸鼠移植瘤生长抑制作用的机制研究

目的:探讨生物钟基因Period2对卵巢癌裸鼠移植瘤生长抑制的作用机制。方法:采用卵巢癌SKVO3细胞株构建裸鼠卵巢癌移植瘤,利用基因转染技术外源性导入重组基因质粒Period2。采用Real-time PCR法和Western bolt法检测移植瘤中Period2表达,治疗期间测量移植瘤体积。治疗后2周处死裸鼠,称取瘤重,采用Real-time PCR和Western blot法检测肿瘤组织中Bcl-2和Bax基因的表达。结果:外源性导入Period2基因在裸鼠移植瘤肿瘤组织中成功稳定表达。与对照组比较,Period2基因过表达组的肿瘤生长速度减慢,肿瘤体积和重量降低,抑瘤率升高,凋亡基因Bax表达明显升高,凋亡抑制基因Bcl-2表达明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:Period2可能通过下调肿瘤凋亡抑制基因Bcl-2,促进凋亡基因Bax表达,促进肿瘤细胞凋亡,从而抑制卵巢癌的生长转移,发挥抑瘤作用。

生物钟基因与癌细胞调控的研究进展

近年,时间生物学(chronobiology)的重大进展是发现调控生物周期活动的核心元件-生物钟基因:clock基因、frq基因、period基因、bmall基因timeless基因和crys基因等。生物周期是一个多层次的网络调控过程,其包括:外界信号级联、转录调控、染色质重构、转录物稳态性、蛋白质核一质穿梭、翻译调控及输出节律同步化等。在这个过程中,生物钟基因起了核心的调控作用。 在最早发现的钟基因中,clock基因和period基因(per)有以下共同特征:1)在哺乳动物中最早发现的生物钟基因,并在人的同源物上鉴定出来。2)

果蝇生物钟基因

Rosbash等报告了果蝇昼夜节律的分子遗传学研究进展,确定了具有昼夜节律起搏点功能的周期蛋白(PER)和永久蛋白(TIM).两种基因都显示出强大的转录和表达功能.