西瓜枯萎病菌生理小种1抗性基因连锁标记开发

【目的】开发与栽培西瓜枯萎病菌生理小种1抗性基因Fon-1紧密连锁的分子标记,为开展西瓜抗枯萎病分子辅助育种提供技术支撑。【方法】以栽培西瓜抗枯萎病品种Calhoun Gray为父本,感病品种Black Diamond为母本杂交获得的F2分离群体为供试材料,采用BSA法对Fon-1基因进行区间定位。依据11份栽培西瓜重测序信息,获取位于定位区间内的候选SNP位点。针对候选SNP位点设计CAPS/dCAPS标记,通过F2代分离群体和种质资源验证上述标记与Fon-1基因的连锁关系。【结果】通过BSA法,将Fon-1基因定位于1号染色体15 cM区间内。利用候选SNP位点信息,开发3个CAPS/dCAPS标记7716_fon、7419_fon和4451_fon,F2代分离群体以及164份西瓜育种材料验证显示,上述3个标记与Fon-1基因的连锁距离分别为0.8、1.0和2.8 cM。【结论】利用栽培品种Calhoun Gray的抗性遗传机制,开发的3个CAPS/dCAPS标记可以有效区分栽培西瓜对枯萎病菌生理小种1的抗病、感病性,为栽培西瓜品种枯萎病菌生理小种1抗性基因快速应用于栽培品种枯萎病抗性改良建立有效的技术手段。

西瓜枯萎病生理小种1抗性QTL精细定位与InDel标记开发

【目的】通过QTL初定位检测栽培西瓜枯萎病生理小种1抗性的主效QTL,验证枯萎病抗性基因Fon-1的存在,结合亲本重测序信息开发紧密连锁易于检测的InDe1(insertion/deletion)分子标记,为西瓜枯萎病分子标记辅助育种提供技术支撑,并实现该QTL的精细定位,加速Fon-1的克隆和功能验证进程。【方法】以高抗枯萎病的栽培西瓜‘ZXG01478'和高感病的栽培西瓜‘14CB11'为亲本构建的F_2群体为试验材料,利用WinQTL cartographer 2.5软件基于复合区间作图法对枯萎病生理小种1抗性进行QTL定位。依据两个亲本材料进行高通量的重测序,并利用重测序信息,获取位于QTL置信区间的InDe1信息,利用自编的Per1程序提取参考基因组中插入缺失相应位置前后500 bp的序列,并利用Primer 5.0软件设计对应的InDe1引物对,开发InDe1标记。利用开发的InDe1标记进行精细定位(根据基因型鉴定结果找到群体中的交换单株,逐步缩小QTL区间)、图谱(利用JoinMap 4.0计算标记的连锁关系)和QTL的重新分析。并利用具有广泛代表性的130份不同抗性的西瓜种质资源的基因型和表型鉴定结果进行验证分析。【结果】F_2群体的病株率频率分布呈现明显的双峰分布且抗病和感病两种类型的株系分离比基本符合3:1的分离比(χ~2=0.52,P=0.47),表明西瓜枯萎病生理小种1抗性主要受一个主效QTL控制。F_2群体的QTL初定位在LG1鉴定到一个枯萎病抗性相关的主效QTL(fon1),其LOD峰值为26.05,解释80.18%的表型变异,置信区间对应的物理位置为1号染色体的193 333-2 775 577 bp。通过两个亲本重测序在QTL置信区间发现19个插入缺失片段大于20 bp的InDe1s,经引物设计与亲本筛选,获得理想引物12对,根据位于端点位置的插入缺失选取了6对InDe1引物利用F_2群体进行验证。初步的精细定位利用群体中的5个交换单株将QTL的置信区间锁定到InDe12_fon1的上游区域,连锁和QTL的重新分析结果显示新开发的一个分子标记InDe11_fon1出现在该QTL的峰值,LOD值为31.65,解释91.46%的表型变异。新开发的分子标记InDe11_fon1与已应用于枯萎病抗性研究的CAPS标记7716_fon在130份不同抗性的西瓜种质资源中的基因型鉴定结果完全一致,且基因型鉴定结果与田间抗病表型性状的符合率达70.8%。利用QTL峰值附近的SNP和InDe1标记与群体中的9个交换单株最终将fon1精细定位至246 kb的物理区间。【结论】主效QTL(fon1)验证了1号染色体上Fon-1的存在,并实现了精细定位。新开发的标记InDe11_fon1与Fon-1紧密连锁,且检测简单,成本低廉,能够更好的用于栽培西瓜枯萎病的分子标记辅助育种。

四倍体西瓜抗枯萎病菌生理小种1的机理

【目的】近年来由于西瓜重茬种植面积的不断增加及连作障碍的发生导致枯萎病在西瓜上迅速蔓延,该病害已经成为限制西瓜生产的主要因素之一。田间观察发现四倍体西瓜比其同源二倍体西瓜抗枯萎病。本研究通过对比四倍体与二倍体抗性差异,揭示四倍体西瓜抗枯萎病的机理,为西瓜多倍体育种和抗病育种提供理论依据。【方法】以同基因型的郑州3号二倍体和四倍体西瓜幼苗为材料,在一叶一心时期接种枯萎病菌生理小种1(Fusarium oxysporum f.sp.niveum race 1,Fon 1),比较不同倍性西瓜苗期枯萎病抗性差异;运用绿色荧光蛋白标记技术观察枯萎病菌的侵染过程;并分析过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、丙二醛(MDA)、总酚及类黄酮等与抗病相关代谢物质活性/含量差异,及PR3、MPK7、PAL、MYB基因表达变化。【结果】西瓜苗期接种枯萎病菌后,二倍体西瓜幼苗4 d发病,10 d时大部分枯死;四倍体西瓜幼苗7 d开始发病,13 d时大部分枯死,四倍体相对其同源二倍体延后3 d发病。枯萎病菌侵染过程对比发现,病菌在二倍体和四倍体西瓜中的侵染路径相同;此外不同倍性西瓜根系分生孢子的萌发率无明显差别,但是随着病菌的侵染,枯萎病菌在四倍体幼苗中的侵染速度明显较慢,细胞间菌丝较少;枯萎病菌在四倍体西瓜幼苗维管束中的定殖率比其同源二倍体低,且在幼苗根部差异显著、叶柄部差异极显著,病菌在四倍体植株茎部及叶部的扩展得到了一定的限制;枯萎病菌在四倍体西瓜中的侵染过程明显滞后,与枯萎病的发病症状相吻合。接种枯萎病菌后,四倍体西瓜幼苗根系POD、PAL活性均呈增加的趋势,且四倍体幼苗根系POD活性增加的幅度比二倍体大,病菌侵染后四倍体根系生成了更多的PAL和POD以增强植物抗病能力,保护细胞免受伤害;四倍体西瓜根系中总酚、类黄酮含量的增加量明显高于同源二倍体,这些次生代谢物质含量的优势,使得四倍体植株更易于抵御枯萎病菌的入侵;另外四倍体西瓜根系MDA含量明显比同时期的二倍体低,表明接种枯萎病菌后四倍体西瓜幼苗根系细胞膜损伤程度更小。抗病基因的表达分析发现,接种枯萎病菌后四倍体PR3的表达量不断增加,在接种后10 d表达量达到最大,是二倍体同时期表达量的10倍;接种后期四倍体根系能表达更多的MPK7,传递抗病信号,促进抗病基因的表达,从而降低枯萎病菌对西瓜幼苗的伤害;PAL的表达量呈现先增高后降低的趋势,表达量均高于同时期的二倍体幼苗,最大表达量是二倍体PAL表达量的6倍;四倍体MYB的表达量明显高于其同源二倍体,接种后7、10 d四倍体根系的表达量分别是二倍体的80、35倍。【结论】通过苗期枯萎病菌接种鉴定、病菌侵染过程观察、代谢物质含量及基因表达水平变化等多方面的研究,表明四倍体西瓜幼苗比同源二倍体抗枯萎病。

四倍体西瓜抗枯萎病生理小种1分子标记辅助选择技术研究

基于已获得的二倍体西瓜与抗枯萎病基因Fon-1紧密连锁的分子标记,进一步完成了Fon-1基因的精细定位。利用两个四倍体西瓜材料(易感病的NF3为受体,抗病的JH为供体),构建以NF3为轮回亲本的回交群体,使用新开发出的SNP标记对各世代群体进行分子标记辅助选择,及苗期抗病性接种鉴定。结果发现,在分离世代群体中通过接种鉴定获得抗病株比例较分子标记检测值低12.64%~15.34%,这可能是由于基因剂量效应造成的。抗病基因杂合位点对枯萎病抗性依次为:三显体(AAAa)】二显体(AAaa)】单显体(Aaaa)。目前分子标记尚无法检测杂合基因型的剂量效应,容易将感病的单显体(Aaaa)误判为抗病株。在构建的673株BC1F2代自交群体中检测到29株纯合基因型(AAAA)抗病单株,占总检测株数的4.31%,与苗期抗病性接种鉴定结果符合度达到100%。

香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的快速检测与鉴定

【目的】从香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种特有的基因序列入手,建立一种快速可靠的分子检测技术,为防止香蕉枯萎病的传播蔓延、尽早采取防治对策、指导香蕉生产进行品种配置提供理论依据。【方法】根据研究室已经筛选到的4号生理小种候选致病相关基因序列设计引物,分别以来自海南、广东和广西的6个香蕉枯萎病菌1号生理小种菌株、7个4号生理小种菌株、7个尖镰孢其它专化型菌株以及2个外围菌株DNA为模板进行PCR扩增,筛选香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种特异性引物及尖镰孢菌的通用引物。【结果】筛选到的特异性引物不仅可用于香蕉枯萎病菌DNA的检测,还可直接用于对罹病香蕉组织和土壤中的香蕉枯萎病菌的检测;筛选到的尖镰孢菌通用引物,可作为内参照以检测DNA的质量,以避免假阴性情况的出现。【结论】所建立的三重PCR检测方法实现了在一次PCR反应中快速、准确地同步检测香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种,对检测香蕉苗是否感染枯萎病及蕉园土壤是否受到香蕉枯萎病菌的污染具有重要意义。

香蕉枯萎病菌1号生理小种遗传转化体系的建立

利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化方法,建立香蕉枯萎病菌1号生理小种(Fusariumoxysporum f.sp cubense race 1)遗传转化体系,并对影响转化效率的因子进行优化,明确了高效转化的条件为:农杆菌OD600为0.15,AS诱导浓度为150μmol/L,诱导时间为7 h,Focr1-N2孢子浓度为1×106个/mL,潮霉素B筛选的浓度为150μg/mL,诱导培养基pH值为5.5,共培养温度为25℃,共培养时间为48 h为最佳条件。构建了包含1 200个突变体的突变体库,并对1 200个突变体进行了致病性测定,初步筛选出致病性丧失突变体20个,致病性显著减弱突变体18个,致病性严重增强突变体53个。

根癌农杆菌介导的香蕉枯萎病1号生理小种遗传转化体系的优化

针对香蕉枯萎病病原菌的1号生理小（Fusariumoxysporumf.spcubenseracel，Focl），以潮霉素抗性为选择标记，建立了根癌农杆菌介导的转化体系，确定影响转化效率主要因子是：YEB平板上单菌落培养时间为40h、在LB液体摇床培养中培养时间28～30h（200r／min）、乙酰丁香酮（AS）浓度为200μmol]L、共培养温度为25℃、IM固体培养基pH值为5．5。在此条件下，转化效率能达到150-200个转化子／10s个Focl孢子。在选择性培养基筛选转化子时，我们首次采用了直接覆盖选择性培养基方法，比传统的转膜反贴方法更方便简单。在荧光显微镜下观察到转化子的绿色荧光。潮霉素抗性测试发现转化子的抗性表现稳定。

海南省香蕉枯萎菌生理小种的RAPD分析

利用随机扩增多态性DNA(RAPD)分子标记方法对海南省香蕉枯萎病菌2个生理小种(小种1和小种4)进行遗传多样性分析,以筛选出的15个随机引物对采自海南省各市县发病蕉区的分别属于1号生理小种和4号生理小种的16个代表菌株及广东省2个1号和4号生理小种对照菌株进行RAPD-PCR扩增,结果产生97个RAPD分子标记,其中多态性的条带有76条,通过聚类分析探讨了供试小种间的亲缘关系,并寻找到了1、4号生理小种的特异性条带,为在分子水平上进行香蕉枯萎病菌生理小种鉴定提供更为便利的手段。

海南省香蕉枯萎病病原菌的分离鉴定及1号、4号小种的生物学特性

香蕉枯萎病是目前国内和世界很多地区香蕉种植区的一种毁灭性病害,目前尚未找到有效的防治方法。本文采集了海南省不同地区香蕉枯萎病的病原菌,通过经典病理学与分子生物学的方法进行了鉴定,此外还优化了快速检测的方法。结果表明,通过接种巴西香蕉和粉蕉进行致病性检测以及分离菌rDNA-ITS测序结果,明确鉴定出供试的香蕉分离菌株为4号生理小种,粉蕉分离菌株为1号生理小种。为了对1号、4号生理小种有更多的了解,本文还对1号、4号小种菌株生物学特性进行了测定,确定了影响菌丝生长的最佳条件。结果显示,pH5时最适合1号、4号生理小种的菌丝生长,适合菌丝生长的温度为19～28℃之间,温度达到37℃时菌丝不能生长,碳源对菌丝的生长影响不大。这些方法和数据可以有利于田间香蕉枯萎病病害的检测和最终确定,生物学特性的测定可以为耕作技术的改进和农药的研发提供参考依据。

香蕉枯萎和细菌性软腐病菌的多重PCR检测

香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense和细菌性软腐病菌Dickeya zeae的复合侵染为害给香蕉产业发展带来严重挑战,有必要建立相关病害的多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction, multiplex PCR)检测技术。本文基于尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种(F.oxysporum f.sp.cubense race 1,FOC1)基因组contig 438区间(35 631-37 693 bp)(GenBank:AMGP01000438.1)和4号生理小种(F.oxysporum f.sp.cubense race 4,FOC4)基因组contig 195区间(4 028-6 126 bp)(GenBank:AMGQ01000195.1)存在160 bp插入序列差异设计特异扩增引物FOC-F/-R,同时以香蕉细菌性软腐病菌D.zeae的促旋酶B亚单位基因(the subunit B of gyrase gene)(GenBank:JQ284039)序列设计特异扩增引物gyrB-F/-R。多重PCR检测结果显示:本技术可在一次PCR扩增反应内同时检测香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种和细菌性软腐病菌;多重PCR的灵敏度结果表明:检测香蕉枯萎病菌的DNA浓度最低限为0.1 ng/μL,细菌性软腐病菌的灵敏度为103cfu/mL;检测结果稳定可靠。因此,本研究建立的多重PCR检测方法可有效应用于检测香蕉发病组织中的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌,也可用于香蕉种苗和田间土壤带病菌的监测,为香蕉种植保驾护航。

甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种的快速检测与鉴定

甘蓝枯萎病菌生理小种传统鉴定方法费时费力,不能满足生产的要求,因此需要建立一种快速、可靠的分子检测技术。本研究在甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种基因组测序的基础上,通过比较基因组学方法筛选1、2号生理小种各自的特异基因片段并设计引物,并分别以10个甘蓝枯萎病菌1号生理小种菌株、2个2号生理小种菌株、7个尖孢镰刀菌其他专化型菌株及4个外围菌株DNA为模板进行常规PCR扩增,筛选出甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种特异性引物,同时引入尖孢镰刀菌通用引物W106R/W106S,建立起一步三重PCR检测甘蓝枯萎病菌1、2号生理小种的分子检测技术。结果表明,该分子检测技术实现了在一次PCR反应中快速、准确地同步检测出甘蓝枯萎病菌DNA、罹病甘蓝组织和土壤中的甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种,对检测甘蓝植株是否感染枯萎菌及甘蓝种植区土壤是否受到枯萎菌的污染有实用价值。

结球甘蓝黑腐病抗性评价及鉴定方法比较研究

黑腐病是由野油菜黄单胞菌野油菜致病变种引起的细菌性病害,是为害结球甘蓝的产量与品质的主要病害之一.尽管黑腐病的病原菌有多个生理小种,但是世界上黑腐病的发生主要是由Xcc1和Xcc4引起的,而甘蓝中抗Xcc1和Xcc4的种质资源相对较少.为了明确重庆地区的黑腐病病原菌,筛选抗黑腐病的甘蓝种质,本研究首先利用分子标记辅助鉴定重庆地区病原菌,然后采用离体整叶喷雾接种法评价30份甘蓝资源的抗病性,对筛选出的抗病种质采用离体叶片打孔喷雾法和滴接法复检,以及分子标记辅助鉴定.结果发现,重庆地区黑腐菌为Xcc1生理小种;离体整叶喷雾接种法接种16 d后,1份甘蓝材料(S18)表现为抗病,6份为耐病(S18S,S232,S23S,165,167,169);相比离体叶片打孔喷雾法,打孔滴接法能更准确区分抗病材料(S18)和耐病材料(S232);抗病材料(S18)和耐病材料(S232)均不含来自埃塞俄比亚芥抗黑腐病标记,但是它们同时具有BR6-InDel分子标记.该研究结果确定了重庆地区黑腐病病原菌生理小种为Xcc1,筛选出了抗该生理小种的甘蓝种质,明确了快速鉴定黑腐病抗性的方法,可为甘蓝抗黑腐病的种质创新和新品种选育提供技术支撑.

发掘大豆资源中灰斑病1号生理小种抗性优异等位变异

通过发掘大豆资源中抗灰斑病1号生理小种的优异等位变异和载体材料,为开展抗灰斑病品种分子设计育种提供理论基础。以205份大豆资源构建的自然群体为试验材料,对其进行灰斑病1号生理小种的抗性鉴定;利用117对SSR标记进行全基因组扫描,分析群体的遗传多样性和群体结构,应用GLM和MLM程序对标记与大豆灰斑病抗性开展关联分析。结果表明:205份大豆资源对灰斑病1号生理小种抗性遗传变异系数为20.90%;2个模型共检测到与灰斑病1号生理小种抗性关联的位点7个,表型变异解释率在7.58%~16.06%;发掘到增效等位变异36个,其中效应值较大的等位变异为Satt244-230(26.16)、Satt142-154(21.94)和Satt244-186(20.19),携带上述3个等位变异的载体材料均为野生资源,3个典型材料分别为12C8646、12C8670和12C6175;育成品种中具有最大增效值的等位变异为Satt142-189(8.94),有7个品种携带该等位片段,均为黑龙江品种,典型载体材料为东农43。上述信息可用于分子标记辅助选择育种和抗源筛选。

不同砧木对西瓜枯萎病的抗性鉴定

以21个砧木品种(系)为试材,采用苗期浸根接种的方法,研究了不同试材对西瓜枯萎病菌1号、2号生理小种的抗性,以期筛选到高抗西瓜枯萎病的砧木资源,为西瓜嫁接苗的生产提供参考依据。结果表明:高抗西瓜枯萎病菌1号生理小种的砧木有‘大壮'‘雪峰'‘1号葫芦'‘南宁市本地葫芦'等4个葫芦品种(系)和‘金批箭'‘雪藤木二号'‘雪砧金刚'等3个南瓜品种;高抗西瓜枯萎病菌2号生理小种的砧木有‘大壮'‘壮根'‘1号葫芦'‘隆安县本地葫芦'‘南宁市本地葫芦'等5个葫芦品种(系)和‘壮士'‘金批箭'‘雪藤木二号'‘雪砧金刚'等4个南瓜品种;测试的野生西瓜没有表现高抗或抗的资源。葫芦类和南瓜类砧木对西瓜枯萎病抗性都较强,野生西瓜类抗病性较弱。

甜瓜‘PMR6’抗白粉病基因的遗传及其定位研究

以甜瓜(Cucumis melo L.)感白粉病品种‘Hami413’为受体亲本,抗白粉病品种‘PMR6’为供体亲本构建的255株BC2分离群体为材料,研究‘PMR6’抗白粉病的遗传规律及基因定位。群体遗传分析表明,BC2群体中对白粉病菌Podosphaera xanthii生理小种1的抗性由显性单基因控制,基因命名为Pm-PMR6-1;利用混合分组分析法(Bulked segregant analysis,BSA)从分布于甜瓜12个连锁群上的390个SSR分子标记中筛选出5个多态性标记;通过连锁分析,将该抗性基因定位于12号连锁群SSR标记DM0191与CMBR111之间;根据甜瓜基因组信息设计SSR引物,进一步将该基因定位于SSR12407与SSR12202之间,并且该抗性基因与标记Mu7191共分离;比对基因组序列,两标记间物理距离约226 kb,预测35个候选基因。