生米卡链霉菌变株丙酰化酶基因的克隆和表达

麦迪霉素产生菌生米卡链霉菌(Streptomyces mycarofaciens)变株具有丙酰化酶活性,可以将螺旋霉素转化为丙酰螺旋霉素。为了进行丙酰化酶基因克隆,本实验以质粒pIJ702为载体通过鸟枪克隆法将变株DNA片段克隆至变铅青链霉菌TK54(Streptomyces lividanTK54),经薄层层析和高压液相色谱分析结果表明,在转化子中,No.9菌株可以将螺旋霉素转化为丙酰螺旋霉素,这证明丙酰化酶基因已在变铅青链霉菌TK54中克隆并得到初步表达,No.9重组质粒插入DNA片段为4.16kb,经Soutnern杂交表明确实来源于变株。此外还构建了No.9重组质粒的限制酶酶切图谱。

麦迪霉素产生菌生米卡链霉菌1748变株68的特性研究

从麦迪霉紊产生菌 S.mycarofaciens 1748中筛选分离到一株无活性变株68,对其进行了培养特征、生理生化特性及阻断部位的研究。

生米卡链霉菌原生质体电融合重组研究

采用电融合新技术可提高生米卡链霉菌原生质体融合频率,并且在原生质体稳定液中加入2.5mol/L的MgCl_2,比使用PEG助融方法的融合频率高10倍。经过UV灭活高产菌株和另一脯氨酸缺陷型菌株的原生质体的电融合,其融合子的抗生素产量变异幅度大,发酵产物的各组份比例改变,经过选择获得了一新的高产菌株,麦迪霉素产量提高77％,其有效组份A_1比例增加。

生米卡链霉菌质粒DNA的分离及特性

用碱性裂解法从麦迪霉素产生菌(Str.mycarofaciens)10204中分离到质粒DNA,经琼脂糖凝胶电泳分析和电镜观察得到证实,分子量为11.5kb(7.6×10~6道尔顿),名为pSMVI。该质粒经酶切分析表明具有4个Bam HI位点和1个EcoRI位点,用质粒消除和转化实验,说明该质粒与麦迪霉素产生有一定的关系。

生米卡链霉菌(STREPTOMYCES MYCAROFACIENS)麦迪霉素的产生和抗性关系

抗生素产生菌的基因克隆研究表明,有关抗生素产生的基因位于一紧密连锁的DNA区域,形成基因簇,抗性基因常同其抗生素的生物合成结构基因位于同一基因簇中,故抗生素的产生与其对自身产生抗生素的抗性紧密相关。据报道,许多抗生素产生菌具有抗自身所产抗生素的能力,并随其产生抗生素能力的提高,其抗性也随之增加。由于链霉菌基因簇具有不同的启动子和多个抗性基因,在不同条件或处于不同生长阶段,菌丝体表现出对其自身所产抗生素的抗性强弱不同。所以,通过抗性基因的克隆,增加抗性基因的拷贝数,使其某些抗生素产生菌得到了比亲本高几倍产量的转化株。本文研究了生米卡链霉菌的不同产量株和同一产量株处于不同生长期的菌丝体对麦迪霉素(MDM)的抗性,以及MDM的产生和其抗性的相互关系。

生米卡链霉菌突变引起生理代谢改变的研究

链霉菌每个菌种都有自己的生理代谢特征，同一菌种经过不同的处理获得的突变株由于遗传物质突变，其生理代谢也发生了变化，生米卡链霉菌的几种不同来源的菌株不仅产生麦迪霉素的效价有差异，而且菌体的生理特征、菌体蛋白及胞外酶也发生了改变，并且对外界加入的诱导物质也存在不同的反应．这表明经过不同的诱变处理后，菌株遗传调控改变引起生理代谢变化，导致麦迪霉素发酵效价各异．

生米卡链霉菌突变株生理特性的研究

产生麦迪霉素的生米卡链霉菌经过诱变育种后，其生理代谢特征发生了变化，不仅产生麦迪霉素单位有差异，而且孢子形成和发酵生理特征与菌体蛋白及胞外酶也发生了改变，并且对外界加入的诱导物质也存在不同的反应．这表明经过不同的诱变处理后，菌株遗传调控改变引起生理代谢变化，导致不同的麦迪霉素发酵单位．

生米卡链霉菌启动子的克隆和表达

用高拷贝启动子探针质粒pIJ486为载体,变青链霉菌(S.lividans)TK24为受体,克隆并表达了生米卡链霉菌(S.mycarofaciens)的启动子,得到了对新霉素抗性不同的5个转化子。其中对新霉素有高抗性的转化子中重组质粒pIJM2的插入片段约为2kb,将 pIJM2转化生米卡链霉菌SM90919原生质体,得到新的转化子SM9pM201和SM9pM205,从SM9pM205菌株中分离到的质粒要比pIJ486和pIJM2小,约3.5kb。

生米卡链霉菌的耐前体变株选育及发酵工艺优化

目的提高生米卡链霉菌的发酵水平和有效组分A1含量。方法出发菌株109S通过紫外线、亚硝基胍的组合诱变处理后筛选高产前体抗性突变株,并考察高产变株的发酵周期、最适补加前体的时间和剂量。结果和结论共筛选了368个抗性突变株,得到一株生产能力比出发菌株提高33%、A1组分提高16%的高产变株B64-5,连续传4代生产能力基本不变,较稳定;确定了变株发酵周期为52 h,发酵最佳补加前体时间为0 h,最佳补加剂量为0.3 g.L-1。

生米卡链霉菌的菌种选育和发酵的研究

以生米卡链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｍｙｃａｒｏｆａｃｉｅｎｓ）０２８１为出发菌株，采用紫外线处理和理性化筛选，选出了麦白霉素产量比出发菌株提高２５％的高产变株，并考察了种子培养基和发酵培养基对变株发酵的影响．

响应面方法优化生米卡链霉菌基因工程菌W-08发酵培养基

目的优化生米卡链霉菌基因工程菌W-08发酵培养基,以提高麦迪霉素A1产量。方法首先,用Plackett-Burman设计评价发酵培养基的8个成分对麦迪霉素A1的影响。然后用最速上升实验确定重要成分在中心复合设计中的取值变化范围。最后采用中心复合设计响应面方法优化了重要成分的浓度。结果葡萄糖和鱼粉对麦迪霉素A1影响最大(P<0.05),是重要成分,其优化浓度分别为20.15g/L和1.80g/L。发酵培养基优化后麦迪霉素A1效价达到1410.16μg/mL,比优化前的A1效价1021.10μg/mL提高了38.1%。结论数理统计实验设计和分析的方法成功地用于了生米卡链霉菌基因工程菌W-08发酵培养基优化。该方法结果准确可靠、有效且节约时间。

生米卡链霉菌与北里链霉菌种间原生质体融合重组的研究

生米卡链霉菌和北里链霉菌用42％PEG4000做助融剂进行多配对原生质体种间融合,融合率为10^(-2)。同时,进行了UV灭活亲株的种间融合,融合率也为10^(-2)。采用液体培养基再生,表观融合率达10^(-1)。随机挑选形态各异的一定数量的融合子作产物分析,发现它们产生柱晶白霉素,总效价比直接亲本高5.9倍,比间接亲本高27％。高效液相色谱测定表明A_5组份从9.1％提高到43.4％。

生米卡链霉菌DNA对北里链霉菌原生质体种间转化

采用SDS-苯酚法提取生米卡链霉菌DNA,同时以SDS处理生米卡链霉菌原生质体得到游离DNA。将提取DNA及游离DNA转化北里链霉菌原生质体,得到10^(-2)的转化率。转化子经发酵得柱晶白霉素,其产量比亲本高5.2倍,同时发现组份亦有所变化,A_5组份从9.1％提高到36.7％。

生米卡链霉菌麦迪霉素抗性基因的克隆

应用碱性裂解法提取质粒载体pIJ61和pIJ702,并通过氯化铯—溴化乙锭密度梯度离心纯化,得到了较好的结果。对TK64、TK24、TK23和JI1326四个受体菌作麦迪霉素抗性基因克隆,结果只有TK24对麦迪霉素敏感。 用Bam HI酶切质粒pIJ702,并通过碱性磷酸酶去除磷酸根。生米卡链霉菌的"total"DNA用MboI部分酶切,得到1～8kb大小的DNA片段,1μgBam H1酶切pIJ702DNA和5μgMbo1部分酶切的染色体DNA片段通过T4-DNA连接酶连接,转化变铅青链霉菌TK24原生质体,在R_2YE平板上再生,经过硫链丝菌素和麦迪霉素筛选,得到8个抗性转化子,进一步复证发现pIJ702-5的抗性最强,pIJ702-7的抗性最弱,并且它们在基本培养基上产生的色素也不同。 提取抗性转化子重组质粒,通过再转化实验进一步证实在杂合质粒上确实含有麦迪霉素的抗性基因。将重组质粒转化麦迪霉素产生菌—生米卡链霉菌63的原生质体,经过再生、筛选、得到9个转化子。对转化子进行发酵实验,发现它们的发酵效价与原始菌株相比,有明显的变化。

基因组重排选育麦迪霉素高产菌株

目的以生米卡链霉菌(Streptomyces mycarofaciens)突变株为研究对象,选育麦迪霉素高产菌株。探索并验证基因组重排技术在菌种选育中的重要作用。方法通过2轮多亲株灭活原生质体融合技术实现基因组重排。将来自不同育种方法的5株麦迪霉素高产菌株B64-5、01-GM-1、H-101、H-106和H-108作为第一轮亲本,在质量浓度为3 g.L-1溶菌酶3、2℃水浴60 min条件下制备原生质体,分别采用紫外线照射148 s和52℃加热60 min灭活原生质体,然后采用质量分数35%PEG 4000、37℃保温2 min诱导原生质体融合。融合子经过初筛和复筛,获得产量进一步提高的重组子作为亲本进行第二轮的多亲株灭活原生质体融合实验。用生物学方法测定麦迪霉素效价,用HPLC方法测定麦迪霉素A1含量。结果与结论经过2轮基因组重排实验成功选育出3株高产且遗传稳定的麦迪霉素生产菌株。其中1株菌株GSZ2-32发酵前补加前体X-1后摇瓶产量比原始出发菌株Streptomyces mycarofaciens var.464提高1.1倍,麦迪霉素A1(MDMA1)质量分数含量保持在80%以上。