PKCα抑制生肌素转位及nAChR基因表达

烟碱样乙酰胆碱受体 (nAChR)的表达调控受神经电活动影响 ,电刺激引起肌细胞膜去极化可抑制nAChR的表达 .以往的研究表明 ,Ca2 +和PKC以及生肌素在其中发挥着重要的作用 .然而 ,目前尚不清楚究竟是哪种PKC亚型参与此过程 ,PKC激活对特异转录因子生肌素浆核转位有何影响 ?为探讨PKC在去极化 nAChR转录偶联中的作用 ,构建了含nAChRγ亚基启动子的绿色荧光蛋白 (GFP)表达载体pEGFP γ ,将其分别与 4种cPKC(PKCα、PKCβⅠ、PKCβⅡ、PKCγ)真核表达载体共转染C2C12肌细胞 .结果发现PKCβⅠ、PKCβⅡ对nAChRγ启动子驱动的GFP报告基因表达没有影响 (P >0 .0 5 ) ,PKCγ对报告基因表达有抑制作用 (P <0 .0 5 ) ,PKCα则有明显抑制作用 (P <0 .0 1) .采用 4种cPKC真核表达载体与GFP 生肌素融合蛋白表达载体 (pGFP myog)共转染C2C12肌细胞 ,观察了不同亚型PKC表达对生肌素浆至核转位的影响 ,发现只有强制性表达外源性PKCα可明显抑制生肌素向核中转位 ,而PKCβⅠ、PKCβⅡ及PKCγ对生肌素浆核转位没有明显抑制作用 .结果提示 ,PKCα通过抑制生肌素转位是阻遏nAChR基因表达机制之一 .

肌肉LIM蛋白增强生肌素对AChRγ启动子的反式激活作用

采用RT PCR技术克隆了大鼠肌肉LIM蛋白 (MLP) 6 40bp的全长cDNA序列 .以此cDNA为探针进行的Northern印迹表明 ,MLP于C2C12细胞在分化的第 3d至第 5d表达 .将MLPcDNA亚克隆至pcDNA3,构建真核表达质粒pcDNA3 MLP ,同时构建AChRγ启动子序列 (96 0bp)调控的荧光素酶报告基因真核表达质粒pGL3 γ .C2C12细胞转染及荧光素酶活性分析表明 ,复合转染pcD NA3 MLP和pGL3 γ的分化肌细胞表达的荧光素酶活性约为对照的 4倍 ;而在 3T3或未分化肌细胞复合转染pcDNA3 MLP和pGL3 γ均未检出报告基因表达 ,说明MLP可促进生肌素对AChRγ亚基基因启动子的反式激活作用 .

鸡胚不同发育时期MyoD,生肌素及乙酰胆碱受体基因的表达

目的：探讨胚胎发育过程中鸡肢体骨骼肌生肌因子与乙酰胆碱受体基因的时相表达及相互关系。方法：采用Northern印迹杂交检测不同发育阶段鸡胚和雏鸡肢体骨骼肌组织MyoD、生肌素、AChRα亚基、α肌动蛋白和原癌基因fos等在转录水平的表达。结果：各种因子及结构蛋白在鸡肢体骨骼肌发育过程中呈现各自独特的表达模式。结论：在鸡不同发育时期，生肌因子MyoD、生肌素，α肌动蛋白在肢体骨骼肌表达时相与躯干肌表达时相不完全相同；生肌因子与AChRα亚基的表达同受神经植人影响，发育早期AChR表达不依赖生肌素，可能受MyoD家族其它成员或另类因子的调节。

鸡骨骼肌发育过程生肌素的表达

ＭｙｏＤ家族生肌因子ＭｙｏＤ、生肌素（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）、ｍｙｆ－５和ｍｙｆ－６／ｈｅｒｃｕｌｉｎ对脊椎动物肌细胞分化和骨骼肌系统的发育成熟具有重要意义，其中生肌素的作用尤为突出，是肌细胞终末分化的关键因素。采用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹技术检测鸡胚骨骼肌发育过程中生肌素在转录水平的表达动力学，发现在胚胎发育第９ｄ已有鸡肢体骨骼肌生肌素ｍＲＮＡ表达，第１３ｄ达到高峰，第１５ｄ开始下降，第１８ｄ至出生后两周几无可检测的ｍＲＮＡ；而生肌素蛋白则在胚胎发育第１３ｄ方可被检测到，第１５～１８ｄ达到高峰，至出生后两周仍维持在一定水平，表明生肌素的表达存在翻译和翻译后水平的调控。利用鸡生肌素基因上游－２２３／＋４０调控片段为探针对发育不同时期的鸡肌肉组织细胞核抽提物进行Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析。发现一种约３５ｋＤ的核内蛋白与探针有较强结合，结合活性第９ｄ时出现，至第１８ｄ达到峰值，出生后两周时降至难检测水平；另外有一种约１１ｋＤ的核内蛋白的ＤＮＡ结合活性恰好在转录活性下降的第１５～１８ｄ发生，按此情况两种核因子可能对生肌素的转录激活分别起正负调控作用。

MLP增强生肌素对nAChRγ亚基基因启动子的结合活性

构建表达GAL4 MLP融合蛋白的真核表达质粒pBind MLP .哺乳动物细胞双杂交试验表明 ,MLP与生肌素E12复合物存在细胞内的相互作用 .构建表达GST融合蛋白GST MLP和GST E12的原核表达质粒pGEX 2TK MLP以及pGEX 4T 2 E12 .在E .coliBL2 1中诱导表达GST MLP、GST 生肌素和GST E12 ,并用亲和层析法纯化了这 3种GST融合蛋白 .这 3种GST融合蛋白进行的凝胶阻滞试验表明 ,MLP可以增强生肌素 E12复合物对AChRγ亚基基因启动子的结合活性 .研究初步阐明了MLP增强nAChRγ亚基基因启动子在分化C2C12细胞中的转录活性的分子机制 .

生肌素引起组蛋白H3和H4高度乙酰化及染色质溶解性增加

为研究生肌素在染色质重建过程中的作用 ,采用生肌素真核表达载体转染C2C12肌细胞 ,细胞核经微球菌核酸酶消化后 ,提取DNA进行SDS PAGE分析 .生肌素转染的细胞 ,其核小体 (染色质 )在Mg2 + 溶液中的溶解性明显增加 ,提示染色质组蛋白乙酰化程度提高 .组蛋白经TAU SDS(2 D)双相凝胶电泳分析 ,发现在转染生肌素真核表达载体 2 4h后 ,组蛋白H4的乙酰化修饰程度最高 .采用抗乙酰化组蛋白H3和H4抗体进行的Western印迹分析进一步证明了乙酰化的发生 .上述变化与染色质的活跃程度相关 .RT PCR结果显示 ,生肌素的靶基因烟碱样乙酰胆碱受体 (nAChR)α亚基和肌酸激酶 (MCK)基因在转染后表达水平提高 .结果提示 ,强制性表达外源性生肌素可引起肌细胞核染色质重建 。

膜去极化激活的PKC抑制依赖生肌素的AChRγ基因启动子活性

烟碱样乙酰胆碱受体（Acetylcholine receptor,AChR）是由4种亚基组成的五聚体,其表达受神经电活动控制。胚胎期神经植入前,AChR弥散分布于肌细胞表面;突触发生后,突触外AChR表达受抑制,而集中于突触后膜表达。出生后去神经或用特异的Na^+通道阻断剂阻断电活动可引起骨骼肌组织突触外AChR mRNA明显升高。电刺激去神经的肌肉又可使突触外AChR基因表达关闭。因此,有关膜去极化与AChR基因转录激活的偶联机制研究已成为当前愈发感兴趣的课题。Klarsfeld等利用特异的阻断剂证明,电活动抑制AChR的生物合成涉及Ca^（2+）和PKC的作用。huang等发现,Ca^（2+）通过去极化的膜由L型钙离子通道进入胞浆,可引起AChR基因快速失活;膜去极化可引起核内PKC活性升高,进而导致AChR基因表达所必需的1个因子磷酸化而失活。

猪肌生成抑制素单克隆抗体的制备及鉴定

用纯化的重组GST-MSTN蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备鼠抗猪肌生成抑制素单克隆抗体。以纯化的MSTNC端成熟蛋白为检测抗原,采用ELISA的方法检测免疫小鼠血清抗体效价、杂交瘤细胞培养上清效价、纯化腹水效价、免疫球蛋白的类型和亚类,抗体相加指数。用Western blot检测抗体的特异性。结果表明:3D3、1G8和10H1 3株单克隆抗体细胞培养上清效价分别为1∶400,1∶800,1∶800,纯化腹水效价分别为1∶16 000,1∶32 000,1∶32 000。Western blot分析显示,3株单抗均能与重组MSTN蛋白特异结合。免疫球蛋白亚类鉴定显示杂交瘤细胞所分泌的抗体中3D3属于IgM亚类,1G8和10H1属于IgG2a亚类。抗体相加试验结果表明3D3、1G8与10H1有不同的抗原识别位点。

TMEM16A的表达下调对骨骼肌细胞分化的影响

TMEM16A(Transmembrane Protein 16A)是一种钙离子(Ca^2+)激活的氯离子通道(Calcium-activated Chloride Channels,CaCCs),在机体内广泛表达,具有重要的生理功能.迄今为止,TMEM16A在骨骼肌发育中的作用及机制尚无报道.本研究利用TMEM16A特异性抑制剂T16A inh-A01首次探讨了其表达下调对骨骼肌细胞分化的影响.研究发现,T16A inh-A01处理显著抑制C2C12和原代成肌细胞的肌分化.进一步研究发现,T16A inh-A01明显抑制肌分化过程中生肌素Myogenin的表达.研究结果提示,TMEM16A的钙激活氯通道活性可能参与了骨骼肌细胞的分化过程,具体的作用机制有待进一步研究.