3种佐剂对猪口蹄疫-伪狂犬二联基因缺失灭活疫苗的免疫效果评价

为了评价ISA 201、ISA 206和SW 3种佐剂对猪口蹄疫-伪狂犬二联基因缺失灭活疫苗的免疫增强效果,试验采用PCR方法鉴别口蹄疫O/rV-1株+A/rV-2株和伪狂犬RPVS1601-1株是否存在3B基因和gE基因缺失;将口蹄疫O/rV-1株+A/rV-2株和伪狂犬RPVS1601-1株抗原灭活并制成水相,分别与3种佐剂混合制成相应的灭活疫苗,使各抗原最终含量为口蹄疫O/rV-1株和A/rV-2株146S 10μg/头份,伪狂犬RPVS1601-1株1×10^(9)TCLD50/头份。将70只昆明小鼠随机分成ISA 201佐剂组(20只)、ISA 206佐剂组(20只)、SW佐剂组(20只)和PBS对照组(10只),肌肉注射制备的疫苗,首次免疫后2周进行二次免疫,首次免疫后第0,1,2,3,4,5,6周时进行断尾采血,收集血清,用ELISA方法检测白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、γ干扰素(IFN-γ)含量和口蹄疫(O/rV-1型、A/rV-2型)抗体及伪狂犬抗体水平;并在首免2,4,6周时每组随机各取3只小鼠进行眼眶采血,用流式细胞仪检测CD4+和CD8+细胞百分比。结果表明:第3周时,ISA 201佐剂组的小鼠血清IL-2含量最高,显著高于ISA 206佐剂组和SW佐剂组(P<0.05);ISA 201佐剂组IFN-γ含量最高,三个佐剂组之间差异显著(P<0.05)。另外,所有佐剂组的IL-4含量在第2周开始显著高于PBS对照组(P<0.05)。第1~6周,ISA 201佐剂组抗体含量显著高于ISA 206佐剂组和SW佐剂组(P<0.05)。三个佐剂组CD4+/CD8+比值均显著高于PBS对照组(P<0.05),且ISA 201佐剂组的比值显著高于ISA 206佐剂组和SW佐剂组(P<0.05)。说明三种佐剂均能不同程度地提升猪口蹄疫-伪狂犬二联基因缺失灭活疫苗的免疫效果,其中ISA 201佐剂的提升效果最好。

基于悬浮细胞制备的鸡新城疫-H9亚型禽流感二联灭活疫苗(La Sota株+BX13株)安全性和免疫产生期研究

为探讨悬浮细胞制备的鸡新城疫-H9亚型禽流感二联灭活疫苗(La Sota株+BX13株)(以下简称二联灭活疫苗)的安全性和免疫产生期,试验用新城疫病毒(NDV)La Sota株和H9亚型禽流感病毒(AIV)BX13株分别接种BHK-21和MDCK悬浮细胞,收获抗原液,制备二联灭活疫苗;采用1 mL/只的剂量接种21日龄SPF鸡进行二联灭活疫苗的安全性试验;以0.02、0.05、0.1、0.3、0.5 mL/只的剂量接种21日龄SPF鸡,免疫后7、14、21 d采血测定NDV HI和AIVHI抗体,并于免疫后21日龄攻毒进行免疫保护试验和免疫产生期试验。结果显示:二联灭活疫苗对SPF鸡安全,鸡只无不良反应,疫苗吸收良好;各剂量组免疫后抗体水平均逐渐升高,免疫后21 d NDV HI效价为6.1~8.5 log2,AIV HI效价为7.5~11.2 log2;免疫后21 d,0.02 mL/只剂量组对两种毒株的攻毒保护率均为9/10,其余剂量组均为10/10保护。研究表明,二联灭活疫苗对SPF鸡安全,以0.1 mL/只的剂量免疫SPF鸡21 d可获得对NDV和H9 AIV的有效抵抗。

小反刍兽疫和山羊痘二联灭活疫苗的制备及其免疫原性

为了研制小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)和山羊痘(Goat pox,GTP)二联油剂灭活疫苗,以Vero细胞增殖小反刍兽疫病毒Nigeria75/1 Clone 9株和山羊痘病毒CVCC AV41株,通过细胞病变观察、间接免疫荧光试验和荧光定量PCR确定接种方式、接毒剂量和收毒时间对病毒增殖的影响。采用细胞病变观察、SDS-PAGE和Western-blot比较甲醛、二乙烯亚胺和β-丙内酯灭活病毒的效果。随后在灭活的病毒悬液中加入等体积的油佐剂进行乳化,制备PPRV-GTPV二联油剂灭活疫苗,并参照《中国兽药典》检测疫苗理化性状。为评价疫苗的免疫原性,将24只2月龄临床健康的雷州山羊随机分为3组(每组8只),分别肌肉注射生理盐水、PPRV-GTPV二联灭活疫苗、商品化PPRV-GTPV弱毒疫苗。免疫后14 d和28 d分别检测试验山羊血清PPRV和GTPV中和抗体。结果表明,PPRV和GTPV以100 TCID50/mL的剂量共感染Vero细胞84 h后的病毒滴度较高。用终浓度为0.025%的β-丙内酯4℃处理24 h,能有效灭活PPRV和GTPV;制备的灭活疫苗符合《中国兽药典》相关要求。PPRV和GTPV二联灭活疫苗免疫14 d后,山羊血清PPRV和GTPV中和抗体水平与商品化弱毒疫苗相仿;免疫28 d后,山羊血清PPRV中和抗体显著高于商品化弱毒疫苗,GTPV抗体呈上升趋势,但显著低于商品化弱毒疫苗。试验山羊均未见明显不良反应。综上说明,PPRV-GTPV二联灭活疫苗安全、有效,有望在小反刍兽疫和山羊痘的防制中发挥重要作用。

猪链球菌病二联灭活疫苗的研制

以马链球菌兽疫亚种 (Stretococcusequisubsp zooepidemicus)ATCC35 2 4 6株和猪链球菌 2型 (S suistype 2 )HA980 1株作为生产菌株 ,制备氢氧化铝胶二联灭活疫苗。经过无菌及安全检验合格 ,肌肉接种仔猪 ,每头 2mL。免疫15d后 ,对HA980 1和ATCC35 2 4 6的保护率分别为 10 0 % (2 6 / 2 6 )和 92 3% (2 4 / 2 6 )。用二联灭活苗免疫后 4周内仔猪体内抗体水平持续上升 ,从第 5周开始逐渐下降 ;再次免疫后 ,抗体水平迅速回升 ,12 0d后仍维持较高水平。攻毒保护试验和抗体消长规律的测定显示 ,制备的猪链球菌病二联灭活苗具有良好的免疫保护作用。

鸡传染性鼻炎(三价)和新城疫二联灭活疫苗的研究

利用Page A型、B型、C型副鸡禽杆菌和新城疫病毒La Sota株,研制鸡传染性鼻炎（三价）和新城疫二联油乳剂灭活疫苗。用3个批次疫苗进行单剂量（0.5mL/次）3次接种和大剂量（2.0mL）单次接种的安全性试验、SPF鸡的免疫效力试验、商品鸡的免疫持续期试验和疫苗的保存期试验。结果表明,3批疫苗对试验鸡安全无副作用;免疫接种SPF鸡只30d后对A、B、C型副鸡禽杆菌攻毒的保护率≥80%,用20μL/只疫苗免疫接种SPF鸡21d后新城疫的平均HI抗体〉24;商品鸡42日龄首免,110日龄二免,二免后9个月对A、B、C型副鸡禽杆菌攻毒的保护率≥70%,对新城疫病毒强毒100%保护;用4℃-8℃保存12个月和15个月的3批疫苗进行了SPF鸡的近期免疫效力试验,结果对A、B、C型副鸡禽杆菌攻毒的保护率≥70%,用20μL/只疫苗免疫SPF鸡,免疫接种后21d新城疫病毒的平均HI抗体〉2^4,对新城疫病毒强毒的攻毒保护率〉70%。说明研制的疫苗安全有效。

仔猪大肠杆菌病、C型产气荚膜梭菌病二联灭活疫苗的研制与应用

为了研制仔猪大肠杆菌病、C型产气荚膜梭菌病二联灭活疫苗,将大肠埃希菌C83549(K88)、C83644(K99)、C83710(987P)菌株和C型产气荚膜梭菌C59-2菌株分别接种适宜培养基,提取大肠埃希菌纤毛和C型产气荚膜梭菌外毒素,灭活和脱毒后加入冻干保护剂,冷冻干燥制成冻干灭活疫苗。该疫苗性状为类白色海绵状疏松团块,无菌检验合格,疫苗对仔猪和怀孕母猪安全,怀孕母猪免疫该疫苗后所产仔猪对大肠埃希菌和C型产气荚膜梭菌的攻毒保护率均在80%以上。临床应用结果表明,该疫苗能明显提高免疫母猪的窝平仔猪成活数。

国家一类新兽药兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗

兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，由江苏省农科院兽医研究所和南京天邦生物科技有限公司研制申报，经农业部兽用生物制品规程委员会审查通过，2005年11月16日被批准为国家一类新兽药，并颁发新兽药注册证书【证号：（2005）新兽药证字36号】。

CAV基因工程亚单位苗与IBDV二联灭活疫苗的研究

IBDV为自行分离的 VVIBDV COB-C1组织毒 ,毒价为 CEL D50 1 0 5.6 / 0 .2 m L ,CAV为 VP1和 VP2基因克隆进家蚕杆状病毒转基因载体质粒中 ,后经重组 ,筛选后获得的重组VP1和 VP2基因产物。IBDV经甲醛灭活后与CAV按适当比例混合。 1∶ 4与白油佐剂研制成油包水型乳化剂二联疫苗 ,经安全试验、免疫保护试验证明该二联灭活疫苗安全有效 ,免疫种鸡群后可使其后代产生 IBDV和 CAV抗体 。

鸭疫里氏杆菌和大肠杆菌二联灭活疫苗研究

将鸭疫里氏杆菌(RA)通过加有血清的改良肉汤培养,得菌数在520亿～2000亿/mL的菌液;鸭大肠杆菌(E.coli)通过普通肉汤培养,得菌数在1000亿～5000亿/mL的菌液,将两菌液甲醛灭活后以2.5∶1的比例混合,再与灭菌的油乳剂以2∶5的比例强力搅拌,制成二联油乳剂灭活疫苗,经无菌检验,安全检验合格后,做免疫保护试验,免疫6日龄雏鸭(0.5mL/只),于18天后攻毒(RA:0.2mL/只;E.coli:0.1mL/只),保护率分别为75%和50%;6日龄一免,14日龄二免(均0.5mL/只),于二免后11天攻毒,保护率分别为100%和80%。

猪链球菌病二联灭活疫苗生产菌株的筛选及培养条件的优化

1997年以来上海地区猪链球菌病的主要致病菌群为马链球菌兽疫亚种和猪链球菌2型,通过动物试验,从10株马链球菌兽疫亚种和猪链球菌2型分离株中筛选出毒力强、免疫原性好的ATCC35246和HA9801株,作为制备疫苗用的生产菌株。对3种不同培养基、血清浓度、葡萄糖浓度、静置和振荡培养、培养基预热等对细菌生长的影响进行了比较。结果表明,用含有2%犊牛血清、0.2%葡萄糖的改良马丁肉汤培养基较为合适;温度对细菌生长的影响很大,培养基接种前预热可以提高细菌产量;振荡培养对细菌生长的影响不大。

鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联油乳剂灭活疫苗最小免疫剂量试验

将ND AI(H9亚型)二联苗分别以1.0、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02mL6个不同剂量免疫5周龄SPF鸡,免疫后3周采血测NDV及AIV的HI抗体,并用H9亚型AIV及NDVF48株攻击。结果表明,这6个免疫组鸡的NDVHI抗体几何平均效价分别为210、28.8、28.5、27.0、26.1、25.7;AIVHI抗体水平分别为29.3、28.4、27.7、25.7、25.1、22.8;对照组鸡的NDV及AIVHI抗体均为零。攻毒试验证实,以0.1～1.0mL剂量免疫鸡获得了100%的抵抗NDV及AIV强毒攻击的保护力;0.02mL和0.05mL的免疫剂量也可使其对NDV与AIV的保护率达到90%～100%。

鳜鱼传染性脾肾坏死病和弹状病毒病二联灭活疫苗毒种及种子批的研究

【目的】建立鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和弹状病毒(SCRV)二联灭活疫苗毒种库及种子批。【方法】以ISKNV-QY0910株和SCRV-GM1503株为原始毒种,扩繁10代(F1~F10)后检测各代病毒对鳜鱼脑组织细胞系(CPB)的致病性及其滴度,并检测其对鳜鱼的毒力。PCR扩增ISKNV的主衣壳蛋白(MCP)基因、RT-PCR法扩增SCRV G蛋白基因序列,检测ISKNV和SCRV毒种的特异性。对F1、F5和F10代ISKNV、SCRV毒种进行细菌、霉菌、支原体及鳜鱼蛙病毒(RANA)和神经坏死病毒(NNV)检测,检验毒种的纯粹性。分别将F1、F5和F10代ISKNV、SCRV病毒液用甲醛灭活后制备灭活疫苗,免疫鳜鱼21 d后攻毒,连续观察14 d,待鱼体稳定后统计死亡率并计算免疫保护率(RPS)。将ISKNV和SCRV毒种湿毒保存于-80℃冰箱,每6个月取3支检测病毒滴度,以确定毒种的保存期。【结果】各代次毒株感染CPB细胞后产生的CPE形态及病变速度基本相同,SCRV滴度为10^(8.58)~10^(8.875) TCID_(50)/mL,ISKNV滴度为10^(7.38)~10^(7.625) TCID_(50)/mL。F1、F5和F10代ISKNV按10^(4) TCID_(50)/mL、SCRV按10^(6.5) TCID_(50)/mL对鳜鱼攻毒(每尾0.1 mL),致死率均超过90%。ISKNV和SCRV各代次毒种可分别扩增出1300 bp的MCP基因和1500 bp的G基因,特异性良好。ISKNV、SCRV毒种无细菌、霉菌、支原体及鳜鱼蛙病毒和神经坏死病毒污染。各代次病毒灭活疫苗对鳜鱼安全有效,免疫保护率ISKNV可达92%以上,SCRV可达84%以上;湿毒-80℃保存,保存期为36个月。【结论】10代以内ISKNV和SCRV的生物学特性稳定,可用于鳜鱼ISKNV和SCRV二联灭活疫苗的制备与检验。

ND-IB二联灭活疫苗不同免疫方法对IB部分免疫效果影响的试验

鸡传染性支气管炎（IB）是由传染性支气管炎病毒（IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触传染性病毒性疾病。鸡传染性支气管炎病毒属于冠状病毒科冠状病毒属,主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统等。鸡传染性支气管炎病毒作为鸡呼吸道疾病综合征的一种原发性病原,极易造成呼吸道疾病的继发感染,使疫情变得更加复杂,病死率升高,给养殖业造成严重的经济损失,不但会引起鸡只死亡,

不同新城疫、禽流感二联灭活疫苗免疫效果探讨

在家禽传染病中，新城疫和禽流感仍是制约养鸡经济效益的2种主要传染病。目前，免疫预防仍是防控鸡新城疫（ND）和H9N2亚型禽流感（AI）的有效措施。为有效防控新城疫和H9N2亚型禽流感，瑞普生物和河南农业大学禽病研究所通力合作，成功研制了鸡新城疫（LaSota株）、禽流感H9亚型（HP株）二联灭活疫苗。

鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗三种佐剂乳化效果比较

新城疫（ND）和禽流感（AI）是危害养禽业最为严重的两种传染病,广泛分布于世界各国。这其中,ND与H9亚型AI混合感染发病率最高,在临床上最常见,给我国的养禽业造成了严重的经济损失。国内外普遍使用疫苗（有活苗和灭活苗两种）预防这该疾病,单苗的使用较为普遍,但单苗存在使用不便,两次免疫造成养殖成本上升。

间接ELISA检测猪链球菌病二联灭活疫苗抗体动态变化

为了评价猪链球菌病二联灭活苗的免疫效果,建立了检测该疫苗抗体的间接ELISA方法。以HRP-SPA(酶标葡萄球菌蛋白A)作为第二抗体,疫苗菌株超声波破碎抗原为包被抗原。试验证明所建立的间接ELISA特异性好,比琼扩试验敏感200倍。用此方法检测了氢氧化铝胶、蜂胶、矿物油三种佐剂疫苗的抗体消长情况,铝胶苗抗体产生的时间比较早,抗体水平比较高,4～5周达到高峰,随后开始下降,二免后抗体水平迅速回升,120d时仍保持较高的效价(1∶1000);蜂胶苗和油佐剂苗抗体上升比较舒缓,持续时间长,7周后还能维持一定的抗体水平(1∶400)。