生长分化因子-5及碱性成纤维细胞生长因子诱导家兔椎间盘髓核细胞成骨作用的研究

目的建立家兔椎间盘髓核细胞的体外培养模型,研究重组人生长分化因子-5(recombinant human growth differentiation factor-5,rhGDF-5)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对髓核细胞成骨潜能的激发作用。方法将诱导剂rhGDF-5和bFGF分别及联合加入体外培养的髓核细胞中,观察髓核细胞的成骨表型表达和细胞学特性的变化。结果 rhGDF-5和bFGF均能促进钙盐沉积形成钙结节。rhGDF-5抑制髓核细胞增殖同时增加骨钙素表达;bFGF促进髓核细胞增殖及Ⅰ型胶原表达,但对骨钙素表达无显著影响。联合使用rhGDF-5和bFGF对髓核细胞成骨潜能(促进髓核细胞增殖、Ⅰ型胶原及骨钙素表达和钙盐沉积)的激发作用均优于单独使用其中任一细胞因子。结论 rhGDF-5诱导髓核细胞向成骨细胞分化,bFGF加强该诱导作用,联合使用rhGDF-5和bFGF能充分激发髓核细胞的成骨潜能。

人生长分化因子-5完整成熟肽基因的克隆

目的 :克隆人生长分化因子 5 (hGDF 5 )完整成熟肽基因。方法 :根据Genbank中hGDF 5的序列化学合成两条引物 ,从人胎儿软骨组织提取总RNA ,通过反转录聚合酶链式反应 (RT PCR )得到hGDF 5完整成熟肽基因。将所得基因片段插入克隆载体 pMD18 T并转化大肠杆菌DH5α ,提取重组质粒 ,酶切鉴定并测序。结果 :DNA琼脂糖凝胶电泳显示 :PCR产物为一长约 3 80bp的带 ,阳性克隆质粒经双酶切可切出约 3 80bp的片段。全自动DNA测序表明与Genbank中的序列完全相符。 结论 :通过反转录聚合酶链式反应从人胎儿软骨组织中成功克隆出人GDF 5完整成熟肽基因 ,基因序列完全正确。

生长分化因子-5基因突变与骨发育异常

生长分化因子5(Growth and differentiation factor 5,GDF-5)是人体软骨发生和骨骼发育过程中发挥重要功能作用的一种调节因子,其基因改变可引起诸多肢体畸形,如Hunter-Thompson肢端发育不良、A2或C型短指/趾症、Grebe型软骨发育不良、腓骨发育不全/复合性短指、多发性骨性联合综合征、近端指/趾关节粘连和骨关节炎,因此近年来受到了广泛关注。此外,其在组织损伤修复、神经系统保护等方面的广阔应用前景越来越被专家学者们所重视。本文将就GDF5在肢体骨骼发育中的作用、GDF5突变引起的相关疾病、GDF5在组织工程学上的应用现状等方面进行综述,并对GDF5未来的研究与应用前景进行了探讨。

转化生长因子β1联合生长分化因子-5体外诱导骨髓间质干细胞向类髓核细胞分化的实验研究

目的探讨转化生长因子β1联合生长分化因子-5体外诱导骨髓间质干细胞向类髓核细胞分化的可能性。方法取SD大鼠骨髓间质干细胞,流式细胞仪检测两种干细胞CD105、CD90、CD44、CD29、CD45、CD34、CD24的表达。将增殖至第三代的BMSCs分为对照、TGF-β1、GDF-5、TGF-β1+GDF-5四组,分别以含不同细胞因子诱导液培养14d后,采用RT-PCR检测各组细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX-9基因的表达。结果两种干细胞CD105、CD90、CD44、CD29表达阳性;CD45、CD34、CD24表达阴性。向类髓核细胞诱导培养14d后,TGF-β1、GDF-5、TGF-β1与GDF-5三组的Collagen typeⅡ、Aggrecan、SOX-9基因表达水平较对照组均有明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。联合诱导组经过诱导后的Collagen typeⅡ、Aggrecan、SOX-9基因表达水平明显高于TGF-β1组及GDF-5组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 GDF-5与TGF-β1都具有诱导BMSCs向类髓核细胞分化的能力,且二者之间具有协同作用,联合应用可以更好的诱导BMSCs向类髓核细胞分化。

生长分化因子-5与骨相关疾病关系的研究进展

生长分化因子-5(GDF-5),在人体正常的生长发育中对骨、软骨、神经的发育过程起到了重要的调节作用, GDF-5表达异常已被证明与多种疾病密切相关,因此近些年受到了广泛关注。文章就GDF-5与骨关节炎、椎间盘退行性变、类风湿性关节炎及先天性髋关节脱位等骨相关疾病关系的研究进展进行综述,为疾病的机制研究和早期诊断提供新思路。

生长分化因子-5对间充质干细胞向肌腱细胞分化及迁移潜能影响的相关研究

目的:研究生长分化因子-5(GDF-5)对间充质干细胞向肌腱细胞分化及迁移潜能的影响。方法:用GDF-5对骨髓间充质干细胞(MSCs)进行14 d诱导分化,取样对细胞外基质合成及向肌腱细胞分化相关基因表达进行测定分析;通过体外三维细胞迁移模型,评价GDF-5对间充质干细胞迁移能力的作用及影响。结果:20、100、500 ng/mL GDF-5诱导4 d后的细胞数均高于0 ng/mL GDF-5诱导(P<0.05),且随着GDF-5浓度增高增殖细胞数呈现增加的趋势。100 ng/mL GDF-5诱导4、12 d的细胞数均高于0 ng/mL GDF-5诱导(P<0.05),随着培养时间的延长,差异更加明显。100 ng/mL GDF-5诱导分化骨髓干细胞12 d后,Tenascin-C与Ⅰ型胶原蛋白的基因表达量均高于0 ng/mL GDF-5诱导(P<0.05)。100 ng/mL GDF-5诱导的细胞迁移能力大于0 ng/mL GDF-5诱导(P<0.05)。结论:GDF-5可以促进间充质干细胞向肌腱细胞分化,并诱导活化间充质干细胞的迁移,该机制可能在肌腱损伤的修复重建中具有重要意义。将GDF-5与间充质干细胞进行联合治疗可为肌腱损伤的修复提供新的治疗方法。

从生长分化因子-5调控关节软骨形成观察加味当归四逆汤防治膝骨关节炎临床研究

目的:通过观察治疗前后膝骨关节炎患者生长分化因子-5(GDF-5)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)及临床症状计分变化,探讨加味当归四逆汤防治膝骨关节炎(KOA)的可能机制及临床效用。方法:采用随机、对照设计,选择符合诊断标准、纳入标准及排除标准的KOA患者62例,按就诊顺序1︰1随机分为两组,每组31例。治疗组予加味当归四逆汤,对照组予仙灵骨葆胶囊,连续4周。详细记录治疗前、治疗后2周及4周临床症状计分变化,应用Real-time PCR技术检测治疗前后GDF-5及VEGF表达变化。结果:治疗组临床治愈10例,显效7例,有效12例,无效2例,总有效率为93.55%;对照组临床治愈6例,显效5例,有效8例,无效12例,总有效率为61.29%,治疗组总有效率明显高于对照组,P<0.05。治疗前,两组患者临床症状计分对比,无显著性差异。治疗后2、4周,治疗组临床症状计分明显低于对照组,P<0.05。治疗后,治疗组在治疗后2周关节疼痛明显缓解,晨僵改善,关节功能部分恢复,治疗后4周,关节疼痛显著缓解,晨僵及关节活动消失。治疗前,两组患者GDF-5、VEGF表达对比无显著性差异;治疗后,两组患者GDF-5、VEGF表达上升,且治疗组上升更显著(P<0.05)。结论:加味当归四逆汤可能通过上调GDF-5及VEGF表达,发挥缓解KOA的效用,值得推广应用。

生长分化因子-5影响肢芽细胞分化的机制

目的研究生长分化因子-5(growthdifferentiatifoanctor-,5GDF-5)对肢芽细胞分化的影响机制及在骨形成过程中的作用机制。方法取妊娠第12d胎鼠肢芽,行肢芽细胞微团培养,以不同浓度(0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、120ng/ml)重组鼠GDF-5,干预培养中的肢芽细胞。于细胞培养第1d、3d,用扫描电镜观察不同浓度GDF-5对肢芽细胞生长与分化的影响。于细胞培养第3d,采用免疫组织化学和实时定量PCR等方法观察GDF-5对肢芽细胞核结合转录因子(Cbfa1)与Ⅹ型胶原蛋白表达的影响。结果在细胞培养第1d,扫描电镜观察结果显示,GDF-5可使肢芽细胞连接更为紧密,高浓度GDF-5组有成熟软骨基质和软骨结节形成,低浓度组也有软骨结节形成,该效应与GDF-5浓度呈正相关。在细胞培养第3d,免疫组织化学检测结果显示,Ⅹ型胶原蛋白表达以120ng/ml浓度组最为广泛和强烈,0ng/ml浓度组表达最弱,其表达趋势接近于Cbfa1的表达,表明GDF-5有促进肢芽细胞向成熟软骨方向分化的作用。实时定量PCR结果显示,GDF-5在mRNA水平同样促进Cbfa1表达,其促进作用呈剂量依赖效应。结论GDF-5通过上调Cbfa1和Ⅹ型胶原蛋白表达的途径促进肢芽细胞向软骨分化和促进骨形成。

生长分化因子-5与骨骼发育

生长分化因子属于骨形态发生蛋白信号分子高度保守的亚家族,对骨骼的发育具有至关重要的作用。近年报道表明:生长分化因子-5(growth/differentiation factor-5,GDF-5)的羧端区域与GDF-6和-7高度同源。GDF-5在治疗肌腱或韧带修复,椎间盘退变修复,软骨修复,骨折愈合等方面具有潜在应用价值。

生长分化因子-5诱导小鼠骨髓基质干细胞向软骨分化过程中对缝隙连接蛋白43表达的影响

目的探讨生长分化因子-5(GDF-5)在小鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)向软骨分化过程中对缝隙连接蛋白43(Cx43)表达的影响。方法体外培养小鼠BMSCs,贴壁细胞传代,取第3代细胞,加入地塞米松、VitC、胰岛素和GDF-5诱导培养,72 h后免疫细胞化学和阿尔辛蓝染色分别检测软骨细胞特异性Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达；在诱导24、48和72 h后进行如下检测：MTT法测定GDF-5对小鼠BMSCs增殖的影响；RT-PCR、Western blotting和免疫细胞化学法检测GDF-5对Cx43蛋白表达的影响。结果MTT结果显示不同时间GDF-5对小鼠BMSCs的增殖无影响；RT-PCR、Western blotting和免疫细胞化学结果表明诱导后不同时间均有Cx43 mRNA和蛋白的表达；诱导72 h免疫细胞化学显示有Ⅱ型胶原蛋白的表达,阿尔辛蓝染色阳性,有蛋白多糖基质的分泌。结论GDF-5可以通过上调缝隙连接蛋白Cx43的表达来促进小鼠BM- SCs向软骨方向的分化。

不同浓度生长分化因子-5对内侧副韧带成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

目的观察生长分化因子-5（GDF-5）对内侧副韧带（MCL）成纤维细胞增殖能力及胶原合成的影响。方法体外培养10周龄SD大鼠MCL成纤维细胞，分别加入不同浓度GDF-5，分为4组：0ng／mL组、10ng／mL组、50ng／mL组、100ng／mL组，用CCK-8法测定细胞增殖能力，羟脯氨酸测试盒测定细胞总胶原含量，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测I与Ⅲ型胶原mRNA的表达。结果浓度为10、50、100ng／mL的GDF-5均能增强MCL成纤维细胞的增殖能力，以100ng／mL的GDF－5作用最显著，组间比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。MCL成纤维细胞中加入GDF－5后，羟脯氨酸量增加，I型胶原mRNA表达增加，组间比较差异均有统计学意义（P〈0．05），但Ⅲ型胶原mRNA表达组间比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论GDF-5可以促进MCL成纤维细胞增殖及胶原合成进而促进韧带损伤愈合。

生长分化因子-5(GDF-5)促进人退行性变髓核细胞外基质表达情况的研究（英文）

目的：研究腺病毒介导的GDF-5对人退行性变椎间盘髓核细胞生长和细胞外基质表达的影响，探索椎间盘退行性变基因治疗的新途径。创新点：首次验证了GDF．5对人退行变的髓核细胞的生长和细胞外基质的分泌均具有明显的促进作用，为椎间盘退行性变疾病早期基因治疗提供了新的途径。方法：利用腺病毒介导的GDF．5转染人退变的髓核细胞，设空白对照组、阴性对照组（绿色荧光蛋白（GFP）组）和实验组（GDF-5组）三个组，3、7、14和21天四个时问点。在预定的时间点，通过蛋白质免疫印迹（Westernblotting）、番红-O染色、免疫组化染色、酶联免疫法定量检测（ELISA）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和细胞外基质的定量分析等手段，验证GDF-5对退变髓核细胞外基质表达的影响，同时对GDF．5对髓核细胞生长情况的促进作用进行了表征。结论：Ad—GDF-5能成功转染人退变的髓核细胞（图1），能有效地促进人退变髓核细胞细胞外基质Aggreean和Ⅱ型胶原（CollagenⅡ）分泌（图4-7），RT-PCR的结果表明Aggrecan和CollagenII基因表达也得到了明显的增强（图8）。同时GDF-5对人退变的髓核细胞的生长也有一定的促进作用（图9）。因此，Ad-GDF-5是椎间盘退行性变早期基因治疗的新途径。

GDF-5诱导成纤维细胞分化为软骨样细胞

目的原代分离培养人真皮成纤维细胞(hDFs),应用生长分化因子-5(GDF-5)进行诱导培养,观察细胞的形态,检测软骨细胞相关指标,评价其分化为软骨样细胞的能力。方法取成人除皱术后的皮肤组织,Ⅰ型胶原酶消化法分离培养hDFs,观察细胞形态,MTT法检测细胞增殖活性,免疫细胞化学染色检测Ⅰ型胶原的表达。用100ng/ml GDF-5的成软骨诱导液培养,观察细胞形态变化,检测Ⅱ型胶原蛋白表达及分泌GAG的能力。结果 hDFs呈长梭形,P10以后仍保持较强的增殖潜能,Ⅰ型胶原表达阳性。诱导后的hDFs逐渐成为圆形、多角形,并聚集生长形成软骨样结节;诱导第21 d的细胞Ⅱ型胶原蛋白表达阳性,GAG被甲苯胺蓝染成蓝色。结论 hDFs经100ng/ml的GDF-5诱导培养可分化为软骨样细胞。

GDF-5在小鼠肢体骨骼发育中的表达及对肢芽细胞影响的研究

目的 :初步观察并探讨生长分化因子 5 (GDF 5 )在小鼠肢体发育过程中的表达及对肢芽细胞软骨分化的影响。方法 :RT PCR法检测小鼠肢体发育过程中GDF 5表达的变化情况 ;MTT法测定不同浓度GDF 5对体外微团培养肢芽细胞增殖率的影响 ;Alcian染色在倒置相差显微镜下观察不同浓度GDF 5对肢芽细胞软骨分化的影响 ,探讨GDF 5影响骨骼系统发育的机理。结果 :RT PCR结果提示GDF 5在胚胎发育的第 12、 13d高表达 ,骨骼系统基本形成之后在孕 14、 15d表达渐下降稳定于一较低水平 ;不同浓度GDF 5对肢芽细胞增殖率影响不同 ,5 0ng/ml浓度组促肢芽细胞增殖作用最强 ;Alcian染色结果显示GDF 5促进肢芽细胞软骨分化的作用呈剂量依赖效应 ,以12 0ng/ml组软骨分化最快 ,软骨结节体积最大 ,10 0ng/ml组软骨结节的数量最多。结论 :GDF 5在肢体发育的不同阶段表达水平不同 ,在骨骼系统形成早期及关节系统形成阶段表达最强 ,主要通过影响肢芽细胞增殖及软骨分化而发挥作用。

重组小鼠pcDNA3.1(+)/GDF-5真核表达质粒的构建及其意义

根据基因库中小鼠生长分化因子-5(GDF-5)序列设计并合成引物,提取孕14 d小鼠胚胎肢芽组织总RNA,行RT-PCR扩增,将扩增产物GDF-5基因片断插入至pcDNA 3.1(+)载体并转化大肠杆菌DH 5α,提取重组质粒,酶切鉴定及测序。结果:DNA琼脂糖凝胶电泳和双酶切均显示出一长约1 603 bp的带;测序结果与基因库中的序列完全相同。认为重组小鼠pcDNA 3.1(+)/GDF-5真核表达质粒构建成功,为进一步研究其在软骨发育中的作用奠定了基础。

应用AdEasy-1腺病毒载体系统构建人GDF-5基因重组腺病毒

目的应用AdEasy-1腺病毒载体系统构建人生长分化因子-5(GDF-5)基因重组腺病毒载体,并在HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒。方法将PCR获取的GDF-5基因插入到质粒pMD19-T中,基因测序鉴定后将目的基因克隆至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,HindⅢ酶切鉴定。重组质粒经PmeⅠ酶切使之线性化并去磷酸化处理,电转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠埃希菌BJ5183,使其在细菌内发生同源重组,卡那霉素筛选,HindⅢ酶切鉴定阳性克隆,扩增重组腺病毒质粒,并转染HEK293细胞,包装成重组腺病毒Ad-GDF-5,分别采用Western blot、TCID50法对Ad-GDF-5进行蛋白鉴定和滴度测定。结果经PCR扩增得到的GDF-5大小约为1.7kb,基因测序结果证实该基因与GENBANK中人GDF-5基因序列相同。pShuttle-CMV-GDF-5、pShuttle-CMV-GDF-5-AdEasy-1经HindⅢ酶切后均得到大小约为1.7kb的片段,与GDF-5大小相符。Western blot证实Ad-GDF-5感染HEK293细胞后大量表达成熟GDF-5蛋白。研究结果表明成功地构建了携带人GDF-5基因的重组腺病毒载体,并制备出5.6×109 PFU/mL的重组腺病毒。结论利用AdEasy-1腺病毒载体系统成功构建了携带人GDF-5基因的重组腺病毒载体,并制备出高滴度值的重组腺病毒Ad-GDF-5,为进一步研究GDF-5的生物学功能及其相关疾病的基因治疗奠定了基础。

GDF-5对大鼠肌腱细胞及腱鞘滑膜细胞增殖及凋亡的影响

目的观察生长分化因子-5(GDF-5)对体外培养的大鼠肌腱细胞及腱鞘滑膜细胞增殖的影响,为进一步研究在体内局部添加GDF-5以促进损伤肌腱愈合及改善外源性愈合所致粘连打下基础。方法MTT法测定不同浓度的GDF-5在体外对肌腱及腱鞘滑膜细胞增殖率的影响;流式细胞仪测定不同浓度的GDF-5在体外对肌腱及腱鞘滑膜细胞凋亡率的影响。结果GDF-5可以明显促进肌腱细胞的增殖,而对腱鞘滑膜细胞的增殖率的作用较弱。对两种细胞的凋亡无明显影响。结论添加一定浓度的GDF-5后肌腱细胞增殖率较腱鞘滑膜细胞提高更为明显,而凋亡并未发生改变。

体外诱导大鼠脂肪源间充质干细胞成肌腱潜能的研究

目的体外诱导脂肪源间充质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,AT-MSCs)成肌腱细胞,为临床肌腱损伤的修复提供理论基础。方法从SD大鼠腹腔脂肪组织中分离出脂肪源间充质干细胞,经生长分化因子-5(growth differentiation factor 5,GDF-5)诱导,使其向肌腱细胞分化。应用形态观察和RT-PCR等方法,从形态和分子水平上对诱导分化的细胞进行鉴定。结果从SD大鼠腹腔脂肪组织中分离出的AT-MSCs呈散在分布,排列不规则,以星形和多角形细胞为主,能稳定增殖传代。经5、10 ng/mL GDF-5诱导8 d后,大部分细胞呈梭形。RT-PCR结果显示经GDF-5诱导的细胞,Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达明显高于未经诱导的对照组;GDF-5诱导的细胞Bcl-2/Bax均高于对照组。结论从脂肪组织中可以获得具有多向分化能力的AT-MSCs,并能在体外稳定传代。经GDF-5诱导后,AT-MSCs有向肌腱细胞分化的倾向。GDF-5在一定时间内对细胞凋亡有抑制作用,有利于AT-MSCs向肌腱细胞的分化。AT-MSCs有可能替代骨髓间充质干细胞作为组织工程学的种子细胞,用于肌腱损伤的修复。

GDF-5体外转染BMSCs移植修复兔退变椎间盘的实验研究

目的通过骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外生长分化因子-5(GDF-5)基因转染修饰,然后移植入退变的椎间盘中,观察修复椎间盘退变的效果。方法脂质体介导的pcDNA3.1(+)/GDF-5重组质粒转染兔BMSCs,G418筛选稳定表达株;实验分为转染细胞组、BMSCs组、退变组,2个月后RT-PCR观察椎间盘髓核细胞GDF-5基因表达稳定性,间苯三酚法检测髓核蛋白多糖含量,流式细胞仪检测细胞凋亡率来观察修复效果。结果 RT-PCR结果显示BMSCs转染GDF-5基因48h后以及移植手术后2个月时GDF-5基因表达稳定。转染细胞组和BMSCs组髓核蛋白多糖含量明显高于退变组(P<0.01),转染细胞组高于BMSCs组(P=0.05)。退变组髓核细胞凋亡率比其他两组显著增高(P<0.01),转染细胞组与BMSCs组之间没有差异(P=0.09)。结论移植BMSCs或者GDF-5基因转染的BMSCs对退变椎间盘有修复作用,后者的修复效果更好。

GDF-5基因活化基质体内转染修复兔退变椎间盘的实验研究

目的通过GDF5基因活化基质体内转染兔退变椎间盘,观察其修复效果。方法脂质体介导的pcDNA3.1(+)/GDF-5重组质粒混入Ⅰ型胶原支架,置入兔退变椎间盘;实验分为GAM组,普通支架组,脂质体对照组,2个月后RT-PCR和Western blot观察椎间盘髓核细胞GDF-5基因和蛋白表达的稳定性,间苯三酚法检测髓核蛋白多糖含量,流式细胞仪检测细胞凋亡率来观察修复效果。结果 RT-PCR结果显示术后2个月GDF-5基因稳定表达。GAM组蛋白多糖含量高于另外两组(<0.05),空白支架组和对照组之间没有差异(=0.601)。GAM组髓核细胞凋亡率明显低于另外两组(<0.01),空白支架组和对照组之间没有差异(=0.902)。结论利用GAM可以有效的进行GDF-5基因体内转染并表达,从而修复退变椎间盘。