双膦酸盐修饰生长分化因子5促进MC3T3-E1细胞的成骨分化

背景:生长分化因子5作为骨形态发生蛋白的一员在软骨及骨组织修复领域表现出良好的应用潜力,增强生长分化因子5与骨组织的亲和力是提高蛋白使用效率的关键,因而开发具有骨靶向性的生长分化因子5蛋白具有重要意义。目的:利用双膦酸盐修饰生长分化因子5并探讨改性后蛋白对小鼠成骨前体细胞生长分化的影响。方法:采用化学交联法将生长分化因子5与帕米膦酸钠偶联,得到偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5,采用傅里叶变换红外光谱、圆二色谱对其基团及结构进行表征,利用ELISA试剂盒测定生长分化因子5与磷酸钙的结合量以及生长分化因子5的体外释放量,用于表征其体外骨靶向性。将生长分化因子5(对照组)、偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5(实验组)分别与成骨前体细胞MC3T3-E1共培养,以单独培养的细胞为空白对照,评价复合物对细胞增殖及分化等的影响。结果与结论:①红外光谱及圆二色谱结果表明,实验成功制备了双膦酸盐/生长分化因子5复合物且蛋白二级结构无显著变化;体外磷酸钙吸附结果表明,偶联帕米膦酸钠后,生长分化因子5与磷酸钙的吸附率增加了约1倍;在半胱氨酸存在条件下,偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5的蛋白可释放出来;②CCK-8实验结果显示,实验组培养4,7 d的吸光度值高于对照组、空白对照组(P<0.0001);培养7 d后,实验组碱性磷酸酶表达明显高于对照组、空白对照组(P<0.0001);培养13 d后,实验组钙结节含量明显高于对照组、空白对照组(P<0.0001);qRT-PCR结果检测结果显示,培养7 d后,实验组碱性磷酸酶、骨钙素及Runx2的mRNA表达高于对照组、空白对照组(P<0.01,P<0.001,P<0.0001);③结果表明,双膦酸盐修饰有利于增强生长分化因子5与磷酸钙的结合能力,同时有利于增强其生物活性。

生长分化因子5与代谢性疾病

生长分化因子5(growth/differentiation factor-5,GDF-5)属于转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)家族,在骨、软骨、心脏、大脑、肾脏、骨骼肌和肌腱、肝脏以及脂肪等多个器官组织中表达。GDF-5与其受体BMPR-I/BMPR-II结合,激活Smad1/5/8、PI3K/Akt、p38-MAPK等信号,发挥促进细胞增殖分化、减少氧化应激损伤、细胞凋亡和组织纤维化等生物学功能。目前针对GDF-5的研究多聚焦在骨、软骨与肌腱的生长和修复等方面,而在其他器官中的生物学作用鲜有报道。因此,本文通过梳理和总结近年来GDF-5与代谢性疾病的研究进展,为GDF-5在改善代谢性疾病防治提供新的见解和理论依据。

生长分化因子5诱导兔骨髓间充质干细胞的软骨分化

背景:生长分化因子5属于转化生长因子超家族成员之一,也是关节发育的最早标志之一,对软骨修复具有重要作用。目的:探讨生长分化因子5诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的作用机制。方法:分离培养兔骨髓间充质干细胞,CCK-8法检测不同质量浓度生长分化因子5对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响,RT-PCR检测不同质量浓度生长分化因子5诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化相关基因的表达;为进一步探讨生长分化因子5诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化的作用机制,加入Wnt/β-catenin信号通路抑制剂XAV-939和激活剂Laduviglusib诱导培养14 d,RT-PCR和Western blot检测软骨相关基因和Wnt/β-catenin信号通路中相关蛋白的表达。结果与结论:①CCK-8结果表明生长分化因子5对骨髓间充质干细胞增殖没有明显影响;②生长分化因子5促进了软骨相关基因Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、Sox9的表达,其中以50 ng/mL组软骨相关基因上调明显;③加入Wnt/β-catenin信号通路激活剂Laduviglusib之后,Sox9、β-catenin和Ⅱ型胶原表达上调(P<0.05),加入Wnt/β-catenin信号通路抑制剂XAV939之后,Sox9、β-catenin和Ⅱ型胶原表达下调(P<0.05);④综上,生长分化因子5诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。

生长分化因子5诱导间充质干细胞多向分化的作用与问题

背景:生长分化因子5属于转化生长因子β超家族成员和骨形态发生蛋白家族成员之一,在关节软骨损伤修复、骨再生、改善椎间盘退行性变、肌腱愈合和神经发育等方面发挥重要作用。目的:综述生长分化因子5诱导软骨细胞、髓核样细胞、肌腱细胞分化以及诱导骨形成和神经发育方面的研究进展。方法:在中国知网、万方数据库,以“生长分化因子5,关节软骨,骨,髓核样细胞,肌腱,神经再生”为检索词;在PubMed数据库以“growth differentiation factor 5,articular cartilage,bone,nucleus pulposus cells,tendon,nerve regeneration”为检索词进行检索。根据纳入与排除标准,排除与主题内容不相关的文献,纳入与生长分化因子5相关的69篇文献。结果与结论:①生长分化因子5可诱导间充质干细胞成软骨和成骨分化,但是生长分化因子5诱导成软骨或成骨分化的浓度分界仍然不清楚;②生长分化因子5可诱导间充质干细胞向髓核细胞分化,可能对治疗椎间盘退行性变有一定作用;③生长分化因子5能够诱导间充质干细胞向肌腱细胞分化,对肌腱损伤修复及预防术后肌腱粘连发挥重要作用;④生长分化因子5可诱导神经发育,促进神经再生。

生长分化因子5在骨关节炎发生发展中的作用

背景:生长分化因子5属于转化生长因子β和骨形态发生蛋白家族的成员,在关节形成过程中及骨骼和关节软骨发育中发挥重要作用,作为组织工程的细胞因子,对促进骨软骨修复具有巨大潜力。目的:探讨生长分化因子5在骨关节炎中的作用以及所存在的一些问题,以期望生长分化因子5在后续有更多的研究,为骨关节炎的治疗提供理论基础。方法:在中国知网、万方数据库,以“生长分化因子5,关节软骨,细胞迁移,细胞迁移,软骨下骨,炎症,骨关节炎,类风湿性关节炎”为检索词,以及在Pub Med数据库以“growth differentiation factor 5,articular cartilage,cell migration,cell proliferation,subchondral bone,inflammation,osteoarthritis,rheumatoid arthritis”为检索词,检索生长分化因子5与骨关节炎相关作用及机制的文章。结果与结论:(1)生长分化因子5促进间充质干细胞向软骨细胞分化,表达Ⅱ型胶原和蛋白聚糖,维持软骨细胞的特性。(2)生长分化因子5促进软骨细胞肥大分化,但是也有研究表明,生长分化因子5诱导后软骨细胞肥大标志物的表达是降低的,表明其对软骨的修复是利大于弊。(3)生长分化因子5可促进成骨的表达,增加软骨下骨矿化密度,通过软骨下骨的修复来间接促进软骨的修复。(4)炎症因子是促进骨关节炎发生发展的因素之一,生长分化因子5可抑制炎症因子的表达,从而达到保护骨关节炎的目的。生长分化因子5作为一种“多功能”的诱导因子,对软骨、软骨下骨及炎症均有一定作用,但是其作用机制仍然不清楚,探明其相关作用机制,在未来有希望成为一种保护骨关节炎的药物。

生长分化因子5诱导脂肪干细胞向软骨细胞的转化

背景:研究表明,生长分化因子5通过不同的调控机制在软骨发育中起到非常重要的作用。目的:观察生长分化因子5对脂肪干细胞分化的调控作用。方法:取第4代日本大耳白兔脂肪干细胞,分别以含0(空白对照组),10,50,100,150,200μg/L生长分化因子5的培养液培养,观察细胞形态变化,筛选出最佳生长分化因子5质量浓度。取最佳质量浓度生长分化因子5诱导培养1,2,3周的细胞爬片,分别进行免疫组织化学、甲苯胺蓝及免疫荧光染色。结果与结论:1最佳质量浓度:当生长分化因子5质量浓度为10,50μg/L时,细胞形态变化不明显;在200μg/L时,细胞呈现凋亡表现;在100,150μg/L质量浓度下,可见少量细胞由梭形变得不规则,部分细胞在7-10 d变成圆形或椭圆形,其中以100μg/L生长分化因子5诱导效果最好;2免疫组织化学染色:100μg/L生长分化因子5诱导后,转染细胞的Ⅱ型胶原化学染色显示细胞核蓝染,呈强阳性;3甲苯胺蓝染色:100μg/L生长分化因子5诱导后,转染细胞的细胞甲苯胺蓝染色阳性,胞浆异染;4免疫荧光染色:100μg/L生长分化因子5诱导组的蛋白聚糖绿色荧光表达逐渐增强,以诱导3周最为强烈;5结果表明:长分化因子5可促进脂肪干细胞向软骨细胞转化。

生长分化因子5单核苷酸多态性与大骨节病的相关性

目的探讨生长分化因子5(GDF5)基因3个单核苷酸多态性(SNP)位点多态性与大骨节病的关系。方法用限制性核酸内切酶酶切方法对103例大骨节病患者和91例健康人的GDF5基因上的3个SNP位点进行基因分型,计算相应人群中3个位点的基因型频率,比较各组间基因型频率的差异。结果单倍型重构分析显示单倍型AT、TGC和TAT在大骨节病患者和健康人群之间存在差异,但3个位点单位点关联分析未显示与大骨节病具有相关性。结论单倍型TGC与大骨节病具有相关性。

椎间盘内注射生长分化因子5及成骨蛋白1对椎间盘退变影响的研究进展

目的介绍生长分化因子5(growth differentiation factor5,GDF-5)、成骨蛋白1(osteogenic protein1,OP-1)在椎间盘退变中的研究进展及应用前景。方法广泛查阅国内外近年相关文献,并行综合分析。结果生长因子是治疗椎间盘退变潜力最大的一类蛋白质。体外研究表明,外源性GDF-5显著增加髓核和纤维环细胞的脱氧核糖核酸酶和蛋白聚糖的含量,GDF-5(200ng/mL)、OP-1明显刺激蛋白聚糖和胶原合成。体内研究表明,GDF-5(100μg)、OP-1(100μg混入10μL5%乳糖中)椎间盘内注射能促进椎间隙高度的恢复,增加MRI评分,组织学分级有统计学意义。结论重组人GDF-5、OP-1能有效刺激椎间盘细胞的新陈代谢、增加ECM合成,因此椎间盘内单一注射重组人GDF-5、OP-1对退变椎间盘具有可修复能力。单一外源性生长因子直接注射对延缓椎间盘退变显示出美好前景。

生长分化因子5诱导脂肪干细胞向成软骨细胞方向分化的实验研究

目的通过质粒转染探讨生长分化因子5(GDF-5)诱导大鼠脂肪干细胞向成软骨细胞方向分化的影响。方法选取雄性SD大鼠采用酶消化-密度梯度离心法提取脂肪干细胞行体外培养,并通过流式细胞术鉴定脂肪干细胞。体外培养的脂肪干细胞分3组,即转染组、空质粒组和对照组。转染组采用Lipofectamine^(TM)2000进行脂质体pcDNA3.1(+)/GDF-5重组质粒瞬间转染;空质粒组采用空质粒pcDNA3.1(+);对照组只加入等量脂质体。转染后观察各组细胞形态。同时,通过免疫组织化学、免疫荧光检测培养2周后Ⅱ型胶原表达水平,通过甲苯胺蓝染色检测2周后蛋白聚糖表达水平。结果转染2周后,空质粒组、对照组细胞形态未见明显变化,转染组长梭形的细胞明显向成软骨的多角形方向变化。Ⅱ型胶原经免疫组织化学染色,转染组可见棕黄色染色,空质粒组、对照组无明显染色;免疫荧光结果显示,转染组细胞呈亮绿色,空质粒组、对照组均未见明显染性着色。蛋白聚糖经甲苯胺蓝染色后转染组细胞呈蓝染,空质粒组、对照组均未见明显染性着色。结论pcDNA3.1(+)/GDF-5转染脂肪干细胞能显著增加Ⅱ型胶原、蛋白聚糖的表达,促进脂肪干细胞向成软骨细胞方向分化。

生长分化因子5对大鼠骨髓间质干细胞生长分化的影响

目的研究生长分化因子5(growth and differentiation 5,GDF5)对大鼠骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)生长分化的影响。方法分离和培养大鼠BMSCs,培养液添加GDF5(添加浓度分别为0、10、100ng/mL),用细胞计数、MTT比色检测细胞增殖变化,用甲苯胺蓝、阿辛蓝染色和RT-PCR检测细胞蛋白多糖(PG)和Ⅱ型胶原合成。结果在低糖DMEM中,GDF5组细胞数量显著增多,可以促进BMSCs生长。在内含地塞米松、胰岛素等的DMEM/F12成软骨诱导液中,阿辛蓝浓度OD值在GDF5组均随时间增加而增高,Ⅱ型胶原合成增多可以诱导BMSCs向软骨细胞分化。结论 GDF5在低糖DMEM中可促进BMSCs的增殖;在成软骨诱导体系中,可使单层培养的BMSCs聚集诱导其向软骨细胞分化,并形成软骨小结。

生长分化因子5对血管内皮细胞增殖和运动的影响

目的:探讨生长分化因子5(GDF5)对心肌梗死后血管修复的作用,阐明其修复的机制。方法:体外培养血管内皮细胞,分别以不同浓度(10、50及100μg·L-1)的GDF5作用于细胞,同时设正常对照组,CCK8法和立体培养法检测血管内皮细胞的增殖抑制率和细胞迁移。结果:CCK8实验法,GDF5对血管内皮细胞的增殖有抑制作用,随着GDF5剂量的增加,抑制率也相应地增加达2倍以上,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。立体培养法检测,GDF5对血管内皮细胞的运动有明显促进作用,随着GDF5剂量的增加,细胞运动明显增快,不同浓度GDF5组与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:GDF5对血管内皮细胞增殖起到抑制作用,对血管内皮细胞的迁移起到促进作用。

稳定过表达生长分化因子5基因大鼠脂肪干细胞系的建立

目的:探讨慢病毒介导的稳定过表达生长分化因子5(GDF-5)基因大鼠脂肪干细胞(ASCs)的构建条件和方法。方法:取大鼠腹股沟脂肪垫组织,采用Ⅰ型胶原酶消化贴壁法分离培养大鼠ASCs。倒置相差显微镜观察细胞形态,CCK-8法测定细胞生长曲线,流式细胞仪鉴定细胞表型。制备带GDF-5/GFP融合基因的慢病毒载体系统,探索不同感染复数(MOI=1、5、10、20、40、60、80、100)的转染效率,选择最佳MOI,采用流式细胞仪检测转染效率。对转染细胞行流式细胞筛选,测定筛选后转染细胞的阳性率。筛选出的细胞行细胞爬片,DAPI染色,形态学上进一步验证细胞阳性率;并采用CCK-8法检测转染后细胞活力。结果:成功培养大鼠ASCs,流式细胞免疫表型鉴定:间充质干细胞表面抗原(CD90、CD29、CD44、CD105)表达阳性,造血细胞表面抗原(CD45、CD34)和骨髓干细胞表面抗原(CD106)表达阴性。成功构建GDF-5过表达慢病毒载体系统,慢病毒转染大鼠ASCs最佳MOI为40,转染率为65%。采用GFP荧光流式细胞筛选技术筛选后阳性率可提高至96%。CCK-8法显示,转染后细胞活力、生长曲线与未转染细胞无明显差异。结论:胶原酶消化法可成功培养大鼠ASCs,流式细胞筛选技术可显著提高转染细胞阳性率,且对细胞系活力无显著影响。

生长分化因子5真核表达质粒转染小鼠骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化

背景:生长分化因子5是软骨与骨组织形成、发育的重要调解因子,在诱导软骨形成,促进骨、软骨、肌健韧带损伤修复方面发挥重要作用。目的:小鼠骨髓基质干细胞体外转染真核表达质粒pcDNA3.1(+)/生长分化因子5,检测与软骨形成分化相关的细胞外基质及蛋白多糖的表达。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/12在武汉协和医院中心实验室完成。材料:雄性昆明种小鼠20只,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。生长分化因子5真核表达质粒pcDNA3.1(+)/生长分化因子5为自备。方法:全骨髓贴壁法体外分离培养小鼠骨髓基质干细胞,取传至第3代细胞接种到6孔板,在细胞生长到90%融合时开始转染。设立3组:转染组采用LipofectamineTM2000进行脂质体介导pcDNA3.1(+)/生长分化因子5重组质粒瞬时转染;空质粒组转染空质粒pcDNA3.1(+);空白对照组只加入等量脂质体,其余步骤相同。主要观察指标:转染后72h通过RT-PCR及免疫细胞化学检测生长分化因子5基因与蛋白的表达鉴定转染是否成功,同法检测软骨基质Ⅱ型胶原的表达,转染后14d阿尔辛蓝染色检测蛋白聚糖的表达。结果:转染组有一大小为219bp的特异性扩增条带,骨髓基质干细胞胞浆内呈棕色阳性染色;而空质粒组、空白对照组均未发生生长分化因子5基因转录,无特异性扩增条带,且细胞胞浆未见明显染色。转染组可检测到Ⅱ型胶原基因的表达,基因大小225bp,Ⅱ型胶原细胞胞浆中可见棕黄色染色;空质粒组、空白对照组均未检测到Ⅱ型胶原基因的表达,SP染色均无明显染色。阿尔辛蓝染色后转染组细胞呈蓝染,空质粒组、空白对照组均未见明显异染性着色。结论:pcDNA3.1(+)/生长分化因子5转染骨髓基质干细胞能显著增加Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达,促进骨髓基质干细胞向软骨细胞方向分化。

生长分化因子5诱导脂肪干细胞复合Ⅰ型胶原支架成软骨细胞的分化

背景:前期实验中发现生长分化因子5可以诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化,但在复合Ⅰ型胶原支架的体外培养条件下其向软骨细胞分化的能力尚未见研究报道。目的:探讨生长分化因子5诱导脂肪干细胞复合Ⅰ型胶原支架向软骨细胞分化的能力。方法:从兔脂肪组织中分离培养脂肪干细胞,使用倒置相差显微镜观察细胞形态,使用免疫荧光对其表型进行鉴定。在复合Ⅰ型胶原支架条件下,加入外源性生长分化因子5对脂肪干细胞向软骨细胞进行诱导,在诱导14 d时,采用苏木精-伊红染色和扫描电镜对诱导的细胞进行形态学观察。在诱导7,14和21 d时,采用反转录PCR方法检测诱导的细胞的Ⅱ型胶原和蛋白多糖m RNA表达情况。结果与结论:原代脂肪干细胞贴壁生长,呈梭形、多角形分布,细胞表面抗原CD44、CD49d阳性,CD106阴性。生长分化因子5诱导的脂肪干细胞与Ⅰ型胶原支架黏附良好,增殖能力旺盛,细胞表面存在着大量的细胞外基质分泌,Ⅱ型胶原和蛋白聚糖m RNA表达水平明显增加。说明生长分化因子5能够成功诱导复合Ⅰ型胶原支架的脂肪干细胞成软骨细胞分化。

生长分化因子5转染对大鼠骨髓间充质干细胞增殖分化的影响

目的:探讨生长分化因子5(GDF5)基因转染对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖分化的影响。方法:采用密度梯度离心法分离培养大鼠BMSCs,pc DNA3.1(+)/h GDF5重组质粒转染大鼠BMSCs后,利用免疫荧光法、聚合酶链式反应(PCR)法检测GDF5蛋白及mRNA的表达,利用3H-TdR检测细胞DNA合成,采用流式细胞仪检测细胞生长周期比例;利用甲苯胺蓝染色、阿辛蓝染色及PCR法检测Ⅱ型胶原的表达。结果:pc DNA3.1(+)/h GDF5重组质粒转染大鼠BMSCs后可以稳定表达,转染pc DNA3.1(+)/h GDF5重组质粒的BMSCs cpm值明显高于未转染BMSCs组(P<0.05);转染pc DNA3.1(+)/h GDF5重组质粒的BMSCs的G1期和G2期细胞的比例下降,S期细胞的比例上升;转染pc DNA3.1(+)/h GDF5重组质粒的BMSCs的Ⅱ型胶原的表达水平增高。结论:pc DNA3.1(+)/h GDF5重组质粒可以成功转染大鼠BMSCs,促进BMSCs增殖并诱导其向软骨细胞分化。

生长分化因子5基因原核表达质粒构建和表达及其体内成软骨的诱导活性

背景:生长分化因子5在软骨、四肢和关节的发育、形成中起着重要作用,是目前最常应用的研究早期关节发育的标志分子。克隆人生长分化因子5基因可为软骨、关节缺损的修复奠定研究基础。目的:利用基因工程技术在大肠杆菌中表达人生长分化因子5成熟肽,探讨重组蛋白的体内诱导活性。设计、时间及地点:基因水平观察实验,于2006-01/06在南方医科大学分析测试中心完成。材料:人流产胚胎膝关节区软骨组织取自解放军广州军区总医院妇产科,标本获取征得家属同意。10只KM小鼠购自南方医科大学实验动物中心,雌雄各半,体质量18～22g,6～8周龄。方法:通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从人胚胎软骨组织克隆生长分化因子5完整成熟肽基因,将所得基因片段插入pET22b(+)载体构建重组原核表达载体pET22b(+)-GDF5,重组质粒转化大肠杆菌BL-21进行IPTG诱导表达。凝胶介质镍离子螯合法纯化目的蛋白,植入小鼠后肢股部肌袋内常规苏木精-伊红染色进行生物学活性鉴定。主要观察指标:琼脂糖凝胶电泳观察目的基因表达条带,测序观察目的基因序列,SDS-PAGE电泳观察目的蛋白表达条带,组织学观察生长分化因子5诱导活性。结果:RT-PCR产物长约350bp,阳性克隆质粒经双酶切可切出约350bp的片段,测序表明与Genbank中的序列完全一致。SDS-PAGE电泳显示重组子转化菌在相对分子质量14100位置处出现特异外源蛋白表达带,和成熟肽相对分子质量13600接近。纯化后体内植入实验组织切片显示,大量的间充质干细胞聚集和增生,并分化成为成软骨细胞,分泌软骨基质并埋入其中变为软骨细胞。结论:通过RT-PCR法从人胚胎软骨组织中成功克隆出人生长分化因子5完整成熟肽基因,可在大肠杆菌中得到高效表达,经纯化后在动物体内具有成软骨诱导活性。

人重组pcDNA6.2/生长分化因子5质粒的构建及鉴定

背景:生长分化因子5是一种刺激肌腱、韧带塑型,增强愈合反应有效的生长因子,在活性组织工程肌腱构建中有重要作用。目的:构建人重组pcDNA6.2/生长分化因子5质粒,为转染基质干细胞向肌腱诱导分化实验奠定基础。设计、时间及地点:细胞基因工程体外实验,于2007-08/12在哈尔滨医科大学遗传学教研室和分子生物学教研室完成。材料:根据Genbank(NM000557)中人生长分化因子5的序列化学合成一对引物,从人胎儿软骨组织提取总RNA。方法:通过反转录-聚合酶链反应得到人生长分化因子5完整成熟肽基因。将所得基因片段插入克隆载体pcDNA6.2并转化入JM109菌株,提取重组质粒,PCR鉴定、酶切鉴定并测序。主要观察指标:反转录-聚合酶链反应检测结果,PCR及SalⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定结果,重组质粒测序与Genbank中序列比较结果。结果:电泳显示,反转录-聚合酶链反应产物为一长约380bp的带,阳性克隆质粒经PCR电泳及双酶切均出现约380bp的片段。测序表明与Genbank中的序列完全相符。结论:成功构建出人重组pcDNA6.2/生长分化因子5质粒,为组织工程化肌腱过程中种子细胞的制备提供转染质粒。

生长分化因子5基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)/hGDF5的构建、鉴定及其活性检测

目的构建生长分化因子5(growth/differentiation factor 5,GDF5)基因的真核表达质粒pc DNA3.1(+)/h GDF5,并对其进行鉴定和活性检测。方法根据Genbank中人GDF5序列设计并合成引物,以p CA350-h GDF5质粒为模板进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增获得GDF5基因,并与pc DNA3.1(+)质粒连接构建真核表达质粒pc DNA3.1(+)/h GDF5。pc DNA3.1(+)/h GDF5经限制性内切酶消化、PCR扩增进行鉴定。将pc DNA3.1(+)/h GDF5分别转染MC615细胞及293细胞,利用PCR、Western blotting及免疫荧光法检测GDF5 m RNA及蛋白的表达。结果真核表达质粒pc DNA3.1(+)/h GDF5经限制性内切酶酶切、PCR扩增表明构建成功,PCR、Western blotting及免疫荧光实验结果显示真核表达质粒pc DNA3.1(+)/h GDF5能在MC615细胞及293细胞中稳定表达。结论成功构建了真核表达质粒pc DNA3.1(+)/h GDF5,为进一步研究GDF5的功能奠定了基础。

生长分化因子5与发育性髋关节脱位的相关性研究

目的探究生长分化因子5(GDF5)与发育性髋关节脱位(DDH)的相关性。方法选取新疆医科大学第一附属医院自2017年10月~2019年10月收治的DDH患儿48例作为观察组,另选择同期体检的健康儿42例作为对照组,两组小儿均使用TaqMan探针法进行单核苷酸基因多态性(SNP)位点分型,探讨SNP位点与DDH发病的相关性,另外按照DDH的严重程度进行分组,分别为先天性髋关节发育不良组(n=19)、先天性髋关节半脱位组(n=14)、完全性髋关节脱位组(n=15),探讨不同分类下DDH与SNP位点的相关性。结果观察组基因型频率TT、TC及CC与对照组比较,差异有统计学意义(P <0.05)。观察组等位基因型频率T、C与对照组比较,差异无统计学意义(P> 0.05)。观察组不同分类患儿的TT、TC及CC基因型频率比较,差异有统计学意义(P <0.05)。观察组不同分类患儿T、C等位基因型频率比较差异无统计学意义(P> 0.05)。完全性髋关节脱位组的T等位基因型频率是对照组的1.42倍,先天性髋关节半脱位组T等位基因型频率是对照组的1.36倍,完全性髋关节脱位组的T等位基因型频率是先天性髋关节半脱位组1.65倍(P <0.05)。结论 GDF5在DDH的发生发展中具有重要的作用,存在明显的相关性。

生长分化因子5诱导大鼠软骨前体细胞向成软骨方向分化

背景:生长分化因子5和软骨前体细胞都在肢体纵向发育中发挥重要作用。目前尚无生长分化因子5对软骨前体细胞影响的文献报道。目的:实验创新性构思重组生长分化因子5干预软骨前体细胞,希望得到生长分化因子5诱导软骨前体细胞向软骨细胞分化的证据。设计、时间及地点:细胞形态学体外实验,于2007-11/2008-03在华中科技大学同济医学院附属同济医院矫形外科研究室完成。材料:纯系清洁级新生24h内的SD大鼠12只,用于制备软骨前体细胞。生长分化因子5为PeproTech公司产品。方法:免疫磁珠分离纯化软骨前体细胞。取第3代细胞,分别用含0,10,50和100μg/L的完全软骨形成培养基干预,诱导14d。对照组采用低糖DMEM培养基。主要观察指标:光镜观察细胞形态和生长增殖,四甲基偶氮唑盐检测细胞增殖活性,阿利新蓝染色蛋白聚糖,应用免疫组织化学和反转录-聚合酶链反应检测Ⅱ型胶原的表达。结果:分离纯化的软骨前体细胞贴壁牢固,生长旺盛,折光度好,光镜下呈多角形或梭形。软骨前体细胞的增殖在48h内呈剂量依赖性增高,100μg/L生长分化因子5组细胞的增殖率显著高于其他组(P<0.05)。诱导14d后阿利新蓝染色阳性,细胞外基质中有明显的蛋白聚糖形成。在生长分化因子5干预软骨前体细胞第7天,Ⅱ型胶原mRNA和Ⅱ型胶原蛋白出现表达,并且14d持续表达。结论:生长分化因子5能够促进软骨前体细胞的增殖分化。