RNA干扰技术沉默生长因子结合蛋白2相耦联的接头蛋白1基因抑制血管生成

目的 探讨应用RNA干扰（RNAi）技术沉默生长因子结合蛋白2相耦联的接头蛋白1（Gab1）基因,使其在体外抑制血管生成.方法 观察人主动脉血管内皮细胞株（EA.hy926）的生长及形态;构建靶向Gab1的小干扰RNA（siRNA-Gab1）表达慢病毒转染EA.hy926细胞;通过Western blot和反转录-聚合酶连反应（RT-PCR）分别检测Gab1蛋白及Gab1 mRNA的表达水平,采用表面培养法构建体外血管生成三维培养模型,观察转染后EA.hy926细胞体外形成血管样结构的数目和长度.结果 与空白组及阴性对照组比较,siRNA-Gab1干扰组EA.hy926细胞形态变化明显,由长梭形逐渐变成星形或多角形;siRNA-Gab1干扰组Gab1蛋白及Gab1 mRNA（0.291 ±0.004）的表达水平明显降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;siRNA-Gab1干扰组三维培养模型中血管样结构的数量（15.600±2.608）个和长度（2.896 00 ±0.736 97） mm均明显减少;其差异有统计学意义（P＜0.05）.而阴性和空白对照组之间比较,细胞形态均呈梭形,Gab1蛋白及Gab1 mRNA（1.001±0.050、1.063 ±0.040）的表达水平、三维培养模型中血管样结构的数量（35.800±2.775）、（38.200±2.588）个和长度（6.3000±0.912 8）、（6.466±1.2529） mm差异均无统计学意义（P＞0.05）.结论 siRNA-Gab1能够抑制EA.hy926细胞中Gab1的mRNA及其蛋白的表达,从而在体外抑制血管生成.

儿童髓母细胞瘤组织中生长因子受体结合蛋白2的相关接头蛋白-1、胶质瘤相关肿瘤基因同源物-1表达的临床意义

目的探讨生长因子受体结合蛋白2的相关接头蛋白－1（Gab－1）、胶质瘤相关肿瘤基因同源物－1（Gli－1）在儿童髓母细胞瘤中的表达，分析其蛋白表达与肿瘤临床病理特点及预后的关系。 方法应用免疫组织化学Elivision法检测Gab－1、Gli－1在40例儿童髓母细胞瘤组织芯片中的表达，运用Chi－square检验或Fisher′s精确概率检验分析Gab－1、Gli－1蛋白表达与年龄、性别、肿瘤部位、病理分型的关系，结合随访资料进行Kaplan－Meier生存分析及Cox比例风险回归分析。 结果Gab－1及Gli－1蛋白在儿童髓母细胞瘤组织中的阳性率分别为35.0%和55.0%。髓母细胞瘤患儿肿瘤组织Gab－1阳性表达率在不同性别[男：30.4%（7/23例）比女：41.2%（7/17例）]、年龄[〈3岁：40.0%（6/15例）比≥3岁：32.0%（8/25例）]、肿瘤部位[小脑：25.0%（5/20例）比第四脑室：45.0%（9/20例）]及病理类型[经典型：33.3%（7/27例）比促纤维增生/结节型：50.0%（5/10例）比间变型/大细胞型：66.7%（2/3例）]之间差异均无统计学意义（χ2＝0.496、0.264、1.758、3.289，均P〉0.05）。不同年龄段[〈3岁：80.0%（12/15例）比≥3岁：40.0%（10/25例）]和不同病理分型[经典型：40.7%（11/27例）比促纤维增生/结节型：90.0%（9/10例）比间变型/大细胞型：66.7%（2/3例）]髓母细胞瘤患儿Gli－1阳性表达率差异均有统计学意义（χ2＝6.061、7.333，均P〈0.05）；不同性别[男：60.9%（14/23例）比女：47.1%（8/17例）]及肿瘤部位[小脑：55.0%（11/20例）比第四脑室：55.0%（11/20例）]髓母细胞瘤患儿之间Gli－1阳性表达率差异均无统计学意义（χ2＝0.753、0.000，均P〉0.05）。Kaplan－Meier生存分析提示患儿年龄、Gab－1、Gli－1蛋白表达均与儿童髓母细胞瘤的预后相关（均P〈0.05），Cox比例风险回归分析显示患儿年龄、病理分型和Gli－1阳性表达是儿童髓母细胞瘤的独立危险因素（均P〈0.05）。 结论Gab－1、Gli－1在儿童髓母细胞瘤中的表达与预后相关，阳性表达可作为肿瘤预后不良的指标。

人生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1基因重组慢病毒RNA干扰载体的构建及鉴定

目的 探讨构建人类生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1（Gab1）基因重组慢病毒RNA干扰载体的方法,研究其对人脐静脉血管内皮细胞株EA.hy926的沉默效率.方法 针对人类Gab1基因设计5个靶点的小干扰RNA （siRNA）序列,并分别合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I和Xho I限制性内切酶双酶切后的GV118载体连接,产生Gab1-RNA干扰（RNAi）转化子,聚合酶链反应（PCR）筛选阳性克隆并进行测序鉴定.将测序正确的Gab1-RNAi、pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染239T细胞,包装产生LV-Gab1-RNAi慢病毒并测定其滴度.将获得的慢病毒分别转染EA.hy926细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达,测定其转染效率;通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测转染后的EA.hy926细胞中Gab1 mRNA表达水平来验证慢病毒干扰载体的基因沉默效率.结果 经PCR分析和测序证实,成功构建LV-Gab1-RNAi慢病毒载体;病毒滴度为3×10^9 TU/ml;荧光显微镜下转染组细胞GFP荧光表达强烈,转染效率达70％以上;RT-PCR证实干扰组细胞Gab1 mRNA表达水平（0.088 ±0.003）较对照（0.947±0.087）组和空白组（0.999±0.067）显著降低（P＜0.01）.结论 成功构建人Gab1基因RNAi慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够的病毒滴度,能明显抑制Gab1基因在EA.hy926细胞株中的表达.