细胞生长因子联合诱导ES细胞向肾脏前体细胞分化的实验研究

目的:探讨细胞生长因子联合诱导胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)向肾脏前体细胞定向分化的实验技术,为应用胚胎干细胞进行肾脏再生提供实验基础。方法:小鼠ES细胞悬浮培养2d制备成拟胚体,RA、activin-A、Bmp7三种生长因子诱导培养5d设为A组,不加生长因子培养设为对照(B组),生长因子培养5天后继续以肾脏上皮细胞生长培养液培养7d设为C组,免疫荧光检测Pax2、Bry、WT1蛋白表达情况,流式细胞技术检测Pax2、Bry、CD24阳性细胞比例,realtimePCR检测Pax2、Bry、Osr1、Lim1、WT1、Six2、Sall1、AQP1、CD24、PDGFR基因表达情况。结果:免疫荧光染色结果显示A组细胞Pax2、Bry、WT1的表达明显高于B组;流式细胞技术检测显示A组Pax2、Bry、CD24阳性细胞比例较B组增加,C组表达Pax2、Bry的阳性细胞比例较A组明显升高;realtimePCR检测显示A组Pax2、Bry、Osr1、Lim1、WT1表达较B组明显增加(P<0.05或P<0.01),C组表达CD24基因较A组明显升高(P<0.05)。结论:胚胎干细胞在体外生长因子联合诱导条件下能够分化为早期肾脏前体细胞,并表达部分成熟肾脏细胞的标记物。

肝细胞生长因子促进人胚胎干细胞向神经前体细胞分化

目的:研究肝细胞生长因子(HGF)诱导人胚胎干细胞(hESCs)定向分化为神经前体细胞(NPs)的作用。方法:诱导拟胚体(EBs)生成,随机将EBs分为正常对照组、G5 supplement组、HGF组和HGF+G5 supple-ment组,悬浮培养诱导7d,转移至多聚赖氨酸/层黏连蛋白(20mg/L)包被的24孔培养板中继续培养7-10d。免疫荧光染色鉴定NPs和体外分化能力,流式细胞仪检测各组巢蛋白(nestin)阳性细胞的比例,RT-PCR检测音猥因子(Shh)对NPs的脑区标记基因表达的影响。结果:HGF+G5可诱导hESCs定向分化为NPs,HGF+G5组的nestin阳性的NPs比例(87.3%±3.9%)显著高于其它组(P<0.05),NPs具有分化成神经元、少突和星形胶质细胞的能力;HGF+G5诱导时间对于NPs的分化有影响,7d时nestin+细胞比例达到最大;Shh可使NPs表达腹侧化基因,后脑标记表达上调,而前脑标记表达下调。结论:含HGF和G5的无血清神经分化体系可有效诱导hESCs神经分化,是研究神经诱导的良好体系。

胚胎肝前体细胞与转化生长因子β1信号介导的肝星状细胞联合移植治疗急性肝损伤

背景:研究表明,移植的胚胎肝前体细胞在受体内大量增殖及长期存活困难,与转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)介导的肝星状细胞联合移植有望解决这一科学难题。目的:观察TGF-β1介导的小鼠肝星状细胞与小鼠胚胎肝前体细胞联合移植对急性肝损伤的治疗作用。方法:①建立慢病毒介导的稳定过表达TGF-β1基因的小鼠肝星状细胞株,通过细胞免疫荧光、qRT-PCR、western blotting法检测肝星状细胞转染目的基因情况;②体外培养小鼠胚胎肝前体细胞株mHPCs-E_(14.5)并以细胞免疫荧光染色法鉴定;③通过CCl4腹腔注射联合2/3肝切除构建急性肝损伤小鼠模型,然后进行mHPCs-E_(14.5)单独移植(mHPCs-E_(14.5)移植组),mHPCs-E_(14.5)与mHSCs-pHBLV-CMVIE-TGF-β1联合移植(过表达TGF-β1联合移植组),mHPCs-E_(14.5)与mHSCs-pHBLV-CMVIE-GFP联合移植(对照联合移植组);④在肝切除后14 d,共聚焦免疫荧光检测各组小鼠脾实质内ALB、CK19、a-SMA阳性表达,全自动生化分析仪检测小鼠血清谷丙转移酶、谷草转移酶活性。结果与结论:①成功建立稳定过表达TGF-β1基因的小鼠肝星状细胞株,与空载对照组相比,慢病毒mHSCs-pHBLV-CMVIE-TGF-β1组目的基因TGF-β1、α-SMA表达明显增高(P<0.01);②mHPCs-E_(14.5)细胞株大量表达AFP,微弱表达ALB和CK19,提示该细胞株为胚胎肝前体细胞;③mHPCs-E_(14.5)移植组脾实质内存在少量CK19阳性细胞和ALB阳性细胞;对照联合移植组脾实质内存在少量CK19阳性细胞、α-SMA阳性细胞及较多的ALB阳性细胞,而过表达TGF-β1联合移植组存在大量CK19阳性细胞、α-SMA阳性细胞,少量ALB阳性细胞;④细胞移植后血清谷丙转移酶及谷草转移酶有所下降,过表达TGF-β1联合移植组下降更明显(P<0.05); ⑤结果提示,移植的胚胎肝前体细胞在脾实质内定植并分化为肝细胞和胆管细胞,TGF-β1信号介导的肝星状细胞诱导胚胎肝前体细胞向胆管细胞分化而且能有效促进小鼠急性肝损伤的修复过程。

昆明小鼠3.5d囊胚分离培养胚胎干细胞并诱导分化为胰岛素前体细胞的实验

目的:自囊胚内细胞团分离培养患者自身的胚胎干细胞并将其诱导分化为目的细胞可用于特定疾病的治疗。实验采用昆明小鼠3.5d囊胚分离培养胚胎干细胞,并将其诱导分化为胰岛素前体细胞。方法:实验于2005-09/2006-11在哈尔滨医科大学组织学与胚胎学教研室完成。①选取妊娠3.5d昆明雌性小鼠123只,至13.5d时取11只用于胚胎成纤维细胞饲养层制备。剩余112只妊娠3.5d小鼠冲胚后,挑取扩展充分、囊胚内细胞团明显的囊胚采用胰酶+乙二胺四乙酸机械法分离培养胚胎干细胞,进行碱性磷酸酶染色和Oct-4免疫荧光染色鉴定。②在细菌培养皿的盖上用不含人重组白血病抑制因子的胚胎干细胞培养液制备液滴,选取生长旺盛、形态典型的胚胎干细胞集落,采用胰酶+乙二胺四乙酸机械法悬浮培养4d,形成拟胚体,行巢蛋白免疫荧光染色。③将胚胎干细胞诱导分化为胰岛素前体细胞,首先需要L-多聚赖氨酸和纤维粘连蛋白包被培养皿,然后用ITSFn筛选液(含5mg/L胰岛素、50mg/L转铁蛋白、30nmol/L亚硒酸钠、5mg/L纤维粘连蛋白的DMEM/F12培养液)筛选巢蛋白阳性细胞6d,碱性成纤维细胞生长因子扩增及初步诱导6d,再以烟碱诱导功能成熟的胰岛素前体细胞27d。应用DTZ染色、Insulin免疫荧光染色对诱导的细胞进行鉴定。结果:①胚胎干细胞的分离培养:将扩展充分的囊胚放置在饲养层上4d后,可见囊胚内细胞团自透明带中孵出,呈柱状生长,中央颜色深于周边,并将周边的饲养层细胞推开。胚胎干细胞传代后呈典型的克隆样生长,相差显微镜下折光性强。②胚胎干细胞碱性磷酸酶染色和Oct-4免疫荧光染色结果:两种染色均呈阳性表达。③拟胚体的形成及向巢蛋白阳性细胞的诱导:胚胎干细胞悬浮培养4d可形成拟胚体,经ITSFn筛选6d后可见90%巢蛋白阳性细胞。④巢蛋白阳性细胞向胰岛素前体细胞的分化:烟碱诱导6d后,上皮样细胞增多,细胞逐渐密集形成类胰岛样组织。诱导10dDTZ染色可见集落的边缘细胞被染成腥红色。诱导27dInsulin免疫荧光染色可见染色阳性细胞团簇。结论:采用昆明小鼠3.5d囊胚成功分离培养胚胎干细胞,并可以将胚胎干细胞诱导分化为胰岛素前体细胞。

小鼠胚胎干细胞诱导的神经前体细胞纹状体移植对PD大鼠的治疗作用

目的 观察来源于小鼠胚胎干细胞的神经前体细胞移植PD大鼠纹状体后的存活、分化以及细胞移植对PD大鼠的治疗作用。 方法 采用无血清方法将小鼠胚胎干细胞定向诱导为神经前体细胞 ,免疫组化技术观察移植细胞的存活、分化。 结果 胚胎体在N2选择性培养基选择生长 5d后 ,85 %以上的小鼠胚胎干细胞分化为nestin阳性的神经前体细胞。移植到PD大鼠纹状体后大部分神经前体细胞存活良好 ,移植细胞分别保持为未分化的nestin阳性的神经前体细胞和TH阳性的神经元。移植后 3周 ,PD大鼠的旋转次数明显减少。 结论 胚胎干细胞来源的神经前体细胞移植PD大鼠纹状体后能分化为TH阳性的神经细胞 ,对PD有治疗作用。

体外局部微环境下小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞的定向诱导分化

背景：周围微环境能够调节胚胎干细胞在体外的诱导分化情况,可能与多种信号通路及细胞因子作用有关。目的：观察局部微环境对体外培养的小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞定向诱导分化的影响。设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2005-10/2006-04在上海第二医科大学发育生物学研究中心实验室完成。材料：清洁级孕13.5d的C57BL/6昆明鼠6只,由中科院上海实验动物中心提供。携带LacZ标记基因的小鼠胚胎干细胞株S8由上海市发育生物学研究中心提供。方法：取孕鼠胚胎,采用组织块消化法制备小鼠胚胎成纤维细胞,经丝裂霉素C处理得到滋养层细胞。将携带LacZ标记基因的小鼠胚胎干细胞株S8解冻复苏,加入含白血病抑制因子的高糖DMEM培养基体外扩增培养,将细胞克隆吹打成单细胞悬液,加到滋养层细胞上,在37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。胚胎干细胞传代后,再加入含全反式维甲酸的高糖DMEM培养基,以单纯加入高糖DMEM培养基作为空白对照,调整细胞浓度为3×108L-1,吹打法悬浮培养48h,收集悬浮液,反复离心去上清,移入铺有明胶的培养皿中,培养9d。主要观察指标：诱导前后细胞形态及生长状态变化,RT-PCR检测诱导后细胞向神经前体细胞的分化情况。结果：胚胎干细胞在含有白血病抑制因子的高糖DMEM培养基中能够保持未分化状态,克隆生长良好;换用含全反式维甲酸的高糖DMEM培养基悬浮培养后,4.0-5.0h聚集成团,形成圆球状的类胚体。加入全反式维甲酸的诱导组内胚层细胞呈多边形且数量较多,对照组内胚层细胞呈长梭形且数量少。诱导后细胞表达神经干细胞特异性标志巢蛋白,神经细胞特异性标志微管相关蛋白2呈弱表达,不表达神经胶质细胞特异性标志胶质纤维酸性蛋白。结论：体外培养的小鼠胚胎干细胞可保持未分化状态,具有不断增殖的能力,经白血病抑制因子与全反式维甲酸两步诱导后可分化为神经前体细胞。

纤维连接蛋白在小鼠胚胎干细胞诱导为神经前体细胞中的作用(英文)

目的:观察采用ITSF和N2无血清培养方法诱导小鼠胚胎干细胞为神经前体细胞的作用及纤维连接蛋白对神经诱导的影响。方法:小鼠胚胎干细胞的培养和N2无血清条件培养基诱导为神经前体细胞,细菌培养皿法或悬滴法制备胚体,小鼠胚胎干细胞采用NBT/BCIP染色,神经前体细胞的nestin免疫组化染色采用ABC法。结果:细菌培养皿法或悬滴法培养胚体、ITSF或N2无血清培养基均能将小鼠胚胎干细胞诱导为神经前体细胞。纤维连接蛋白预处理培养表面,对胚体的贴壁情况影响不大,但能使无血清培养后存活的神经前体细胞明显增多。结论:小鼠胚胎干细胞在ITSF和N2培养基均能分化为神经前体细胞,在N2培养基中加入纤维连接蛋白能使存活的神经前体细胞数量增多。

两种人胚胎干细胞体外诱导CD34^+造血前体细胞方法的比较

目的对比小鼠骨髓基质细胞系OP9共培养和二维单层诱导方法体外诱导人胚胎干细胞(hESCs)产生CD34+造血前体细胞的效率,为后续研究提供参考。方法采用hESCs与OP9共培养方法或用二维单层诱导方法诱导hESCs产生CD34+造血前体细胞,通过流式细胞仪检测分化效率,比较两种方法的效果。结果通过hESCs/OP9共培养方法,hESCs在分化第9日出现CD34+细胞,比例达(19.7±7.9)%;通过二维单层诱导方法,hESCs在分化第6日即出现CD34+细胞,比例仅为(5.8±1.8)%,两种方法分化效率比较差异具统计学意义(P<0.05)。结论 hESCs/OP9共培养方法和二维单层诱导方法均可将hESCs诱导为造血前体细胞,相对于二维单层诱导方法,hESCs/OP9共培养方法尽管需要更长的时间,但其分化效率更高,更有利于后续研究。

无血清培养条件下诱导胚胎干细胞向多巴胺能神经元定向分化的实验研究

目的 寻求无血清、无饲养层细胞存在的情况下 ,胚胎干细胞向多巴胺能神经元定向诱导分化的最佳条件。 方法 采用阶段诱导的方法 ,在不同阶段加入不同的生长因子 ,对新近分离的胚胎干细胞进行分化培养。首先向无血清培养液中分别加入bFGF和LIF ,实现由胚胎干细胞向神经前体细胞的定向分化 ,通过巢蛋白(nestin)免疫细胞化学染色对神经前体细胞进行鉴定 ;在此基础上 ,撤除bFGF和LIF ,加入B2 7无血清培养基、IL 1后继续培养 ,实现由神经前体细胞向多巴胺能神经元的定向诱导分化 ;通过酪氨酸羟化酶 (TH)免疫细胞化学染色对多巴胺能神经元进行鉴定。 结果 有 85 %的细胞团呈nestin免疫阳性着色 ,多巴胺能神经元的分化比率为13% ,较多巴胺能神经元的自然分化比率 (4 % )有明显提高。 结论 在无血清、无饲养细胞的情况下 ,我们采用阶段诱导的方法 ,在不同的阶段加入不同的生长因子 ,可有效诱导多巴胺能神经元的分化 ,使胚胎干细胞的诱导分化过程更易于操作。

小鼠孤雌胚胎干细胞直接向神经细胞诱导分化的实验研究

目的探讨小鼠孤雌胚胎干细胞在体外不经过拟胚体(EB)阶段,直接诱导分化为神经细胞的可行性。方法采用阶段诱导的方法,首先由孤雌胚胎干细胞向神经前体细胞定向分化,通过巢蛋白(nestin)免疫荧光细胞化学染色对神经前体细胞进行鉴定。在此基础上,撤除丝裂原,加入5%胎牛血清,观察已分化的神经前体细胞能否进一步分化为神经细胞,并对分化出的细胞进行免疫荧光细胞化学鉴定。结果经选择培养基培养3 d后的孤雌干细胞绝大多数可诱导为神经前体细胞,nestin呈阳性。加入血清进一步诱导,可分化出β-Ⅲ-tubline阳性的神经细胞。结论小鼠孤雌胚胎干细胞在体外不经EB培养阶段,可直接诱导分化为神经细胞,并且前期可得到大量的神经前体细胞。

缺氧诱导因子-1α在脑缺血后对内源性神经干细胞作用的研究进展

目前脑缺血后促进内源性神经干细胞(neural stem cells,NSCs)再生的影响因素已成为神经病学研究的热点。近年来,有实验证明一些相关因子在脑梗死后缺血缺氧条件下被高度表达并参与了脑组织损伤的修复过程,如缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)。许多研究利用大鼠脑缺血模型进行免疫组化和蛋白印迹分析来评估内源性NSCs与HIF-1α早期表达的关系,结果表明在缺血造成的内环境中,HIF-1α的早期表达能够使内源性NSCs促进神经细胞的再生。而且脑梗死后,HIF-1α在缺血缺氧的环境中高度表达并发挥神经保护作用,为脑损伤的修复提供了有利的基础条件。

两种人胚胎干细胞系向神经元方向诱导分化的比较研究

目的:比较研究两种人胚胎干细胞系H8和H9在维持培养、向神经前体细胞和神经元方向分化的特性。方法:采用mTeSR1做为基本培养基,Matrigel做为基质胶,进行无滋养层的维持培养。采用白细胞抑制因子1(Smad-1)双抑制剂的神经前体细胞诱导,和含B27的Neurobasal联合脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的神经元诱导方案。采用免疫荧光化学染色检测胚胎干细胞标记蛋白(Nanog和OCT4)、神经前体细胞标记蛋白(Nestin、Sox2和Pax6)、神经元标记蛋白Tuj-1的表达。结果:在维持培养和神经诱导的早期:H8和H9细胞在胚胎干细胞标记蛋白表达及类胚体形成方面无显著差异。神经前体细胞阶段:诱导分化相同时间(诱导14 d),两种细胞系的玫瑰花环样结构形成,及巢蛋白(Nestin)、SRY转录因子2(Sox2)的表达均无显著差异;相对而言,更高比例的H9细胞表达神经前体细胞标记蛋白成对同源基因盒6(Pax6)。神经元阶段:诱导相同时间(诱导30 d),约89%的H9细胞表达神经元标记蛋白Tuj-1,而仅约34%的H8细胞表达Tuj-1。结论:H8、H9细胞的胚胎干细胞特性相似。与H8相比,H9细胞的神经元方向分化效率更高,更适合进行神经系统疾病机制及转化研究。

食蟹猴胚胎干细胞向间充质前体细胞诱导分化及鉴定

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可以诱导分化成脂肪、软骨、骨骼和骨骼肌细胞,并可作为骨骼、软骨或肌肉移植中的再生干细胞,广泛应用于细胞治疗和组织工程。胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)具有体外培养无限增殖和多向分化的特性,能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。该研究通过无血清条件下诱导食蟹猴ESCs形成类胚体(embryoid bodies,EBs),然后在血清条件下贴壁分化EBs成间充质前体细胞(mesenchymal precursor cells,MPCs),再经过长期体外培养,纯化和扩增MPCs。结果显示,纯化后的MPCs具有MSCs生物学特征,并能在体外诱导分化成脂肪细胞和骨细胞。将这些细胞皮下注射给SCID小鼠,并未发现形成肿瘤,提示食蟹猴ESCs来源的MPCs具有一定的安全性。

本期专题:干细胞与微环境

1体外局部微环境下小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞的定向诱导分化——见2009年1期75页。 2化学诱导剂5-氮杂胞苷及模拟生物微环境对骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞的影响——见2009年40期7931页。

胚胎干细胞体外诱导分化为成血管血液干细胞的研究进展

成血管血液干细胞的概念早在20世纪就已经有人提出来,如今它的存在已经在小鼠和人的胚胎干细胞分化形成的类胚体中得到证实.在胚胎正常发育过程中,原始成血管血液干细胞具有分化形成血管内皮细胞和造血细胞2个谱系的双向分化潜能,是它们共同的前体细胞;而体外诱导分化胚胎干细胞形成成血管血液干细胞的模型为研究血管内皮细胞及造血细胞发育、分化过程和调控以及之间的关系提供了有效的途径.就近年这方面的一些研究成果作一综述.