生长抑制因子1基因核定位序列绿荧光蛋白融合表达载体的构建及表达

目的构建p33ING1b核定位序列(nuclearlocatingsequence,NLS)绿荧光蛋白融合表达载体,将其转染到人胚肺纤维母细胞系MRC5,建立稳定表达该融合蛋白的细胞模型。方法应用逆转录PCR获得p33ING1b的NLS序列,然后将NLS序列插入绿荧光蛋白融合表达载体pEGFP C1的多克隆位点,构建pEGFP C1NLS绿荧光蛋白融合表达载体,再用此载体转染MRC5细胞系,观察活细胞绿荧光蛋白的亚细胞定位。结果成功构建了pEGFP C1NLS绿荧光蛋白融合表达载体,由该载体表达的绿荧光蛋白NLS肽段融合蛋白产生的绿色荧光信号全部定位于胞核部位,而空载体转染的细胞表达的绿色荧光蛋白,绿色荧光信号定位于细胞浆中。结论在活细胞内,生理情况下P33ING1b完全定位于细胞核,并且在其亚细胞定位的转运过程中,NLS肽段起着决定性作用。

肝细胞生长因子激活剂的抑制剂-1基因对宫颈癌细胞自噬及凋亡调控的影响

目的探讨肝细胞生长因子激活剂的抑制剂-1(hepatocyte growth factor activator inhibitor-1,HAI-1)基因对宫颈癌细胞自噬及凋亡调控的机制。方法对数生长期HeLa细胞分为转染组和对照组,转染组转染HAI-1质粒,对照组细胞正常培养。采用实时荧光定量PCR法检测2组细胞HAI-1 mRNA表达情况,采用AO染色和流式细胞术检测2组细胞自噬情况,采用ELISA检测2组细胞自噬相关因子LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ和Beclin-1蛋白水平,应用流式细胞仪检测2组细胞凋亡率,采用Western blot法检测细胞Bax和Bcl-2蛋白相对表达量。结果转染组细胞HAI-1 mRNA相对表达量(1.57±0.26)、AO细胞荧光强度(52.14±3.88)、LC3-Ⅱ蛋白[(3.42±0.85)μg/L]、Beclin-1蛋白[(14.69±1.96)μg/L]水平、细胞凋亡率[(86.75±6.42)%]、Bax蛋白相对表达量(1.24±0.13)和Bax/Bcl-2(7.75±0.83)高于对照组[0.48±0.09、5.47±0.32、(1.10±0.22)μg/L、(10.12±0.53)μg/L、(12.64±1.33)%、0.25±0.06、0.17±0.05](P<0.05),LC3-Ⅰ蛋白水平[(0.59±0.11)μg/L]、Bcl-2蛋白相对表达量(0.16±0.04)低于对照组[(3.26±0.82)μg/L、1.47±0.15](P<0.05)。结论HAI-1转染通过增加HeLa细胞中LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达,降低LC3-Ⅰ蛋白表达,提高Bax/Bcl-2来调节宫颈癌细胞的自噬和凋亡。