生长抑素基因疫苗pcS/SS构建及其在HeLa细胞中的表达

将 PCR扩增得到的 pc MV- S中的乙肝表面抗原 (HBs Ag) S基因亚克隆到 p UC18中 ,构建成 p U S质粒 ,再将化学合成的生长抑素 (somatostatin,SS)基因单链复性 ,融合到 S基因编码区的第 2 2 5个氨基酸位点之后 ,构建成 p US/SS质粒 ,然后将 S/ SS融合基因亚克隆到 pc DNA3.1(- )中 ,构建成 S/ SS融合表达质粒 pc S/ SS。采用脂质体包裹法将 pc S/ SS质粒转染 He L a细胞 ,用 SDS- PAGE和 EL ISA分析表明 ,S/ SS融合基因在转染后 72 h和 G4 18选择 2周后的细胞中均获得表达 ,融合蛋白具有 SS的反应原性。

生长抑素基因工程苗对绵羊外周血液某些代谢物浓度和激素水平的影响

选择4～5月龄体重相近的杂种雄性去势绵羊16只,随机分成试验组和对照组,对照组平均体重为21.25kg,试验组平均体重为21.54kg。试验组绵羊一次性皮内多点注射生长抑素基因苗(SS苗)1mL,对照组绵羊皮内多点注射生理盐水1mL。试验共持续63d。试验结束时对照组平均体重27.79kg,试验组平均体重29.71kg。注射SS苗和生理盐水当天(0d)、28d、51d、63d,早晨放牧前颈静脉采血制备血浆,分析代谢物及激素含量。结果显示,SS苗免疫对动物葡萄糖和非酯化脂肪酸(NEFA)和尿素氮浓度无明显影响;SS苗免疫后28d时,IGF-I、GH浓度分别比对照高10.81%和5.23%,在51d时高57.36%(P<0.01)和35.73%(P<0.05)。

生长抑素基因工程苗和半胱胺对放牧羔羊增重效果的影响

选择 4～ 5月龄体重相近的杂种羔羊 90只 ,随机分成对照、添加半胱胺 (CS87)和生长抑素 (SS)苗免疫共 3组 ,每组公母各半。CS87按每千克体重 80mg每周添加 1次 ,持续 6周 ;SS苗按 1mL/只一次性免疫 ,9周结束。结果显示 ,添加CS87组 0～ 2 1d增重提高 1 6 46 % (P <0 0 5) ,2 1～ 42d增重提高 1 5 95 % (P <0 0 5) ;SS苗免疫组在 2 1～ 42d提高 5 86 % (P >0 0 5) ,42～ 63d提高 1 7 5 % (P <0 0 5) ,母羊效果优于公羊。

生长抑素基因疫苗对肉用鸡生产性能、屠宰性能及肌肉品质的影响

将28日龄150只肉用鸡随机分为5个组,每组30只,A、B、C组口服生长抑素基因疫苗,剂量分别为8×109、4×109、1×109cfu.只-1,D组口服生理盐水,E组口服减毒沙门氏菌CS022,作为对照组,2周后加强免疫1次,分析以减毒沙门氏菌为载体的生长抑素基因疫苗对肉用鸡生长性能、屠宰性能及肌肉品质的影响。结果表明:以减毒沙门氏菌为载体的pcS/2SS基因疫苗口服免疫肉用鸡后,与对照D、E组相比,C组日增重分别提高10.7%和9.48%(P<0.05),A、B组日增重与对照组差异不显著。C组饲料转化率分别提高10.93%和15.41%(P<0.05)。C组屠宰率、半净膛率和全净膛率有所提高,胸肌率显著高于其余各组(P<0.05),而腹脂率较低,与D组相比,降低27.46%(P<0.05)。在肌肉品质方面,各组间差异不明显。由此可见,以减毒沙门氏菌为载体的pcS/2SS口服基因疫苗能促进肉鸡生长,改善肉鸡饲料转化率,提高肉鸡屠宰性能,其中以1×109cfu.只-1剂量效果较好。

生长抑素基因在大肠杆菌pThioHis表达系统中的克隆与表达

目的 在大肠杆菌表达系统中高效表达生长抑素 (SS)基因。方法 以天然SS的氨基酸和基因序列为标准 ,将大肠杆菌使用频率较低的密码子分别更换成了使用频率较高的密码子 ,在SS基因的两端加上了合适的酶切位点 ,头部 :KpnI和NcoI;尾部 :PstI(这一酶切位点可与NsiI的切口互补 )。克隆至pThioHisA质粒的KpnI/PstI酶切位点后 ,再克隆至pThioHisA质粒的KpnI/NsiI酶切位点 ,使SS基因分别位于多克隆位点的尾部和前部。结果 重组质粒经酶切鉴定和基因序列测定证明 ,基因完全正确 ,在大肠杆菌TOP10中均得到较好的表达 ,IPTG诱导后 4h表达量基本达到最高 (37℃ ) ;在A60 0 0 .4～ 1.5之间用IPTG诱导均可获得到较好的表达 ,但以 0 .6左右为最佳诱导时机 ;在LB、TB和 2YT培养基中表达量依次为 :TB >LB >2YT ;表达的SS融合蛋白基本为水溶性的 ,具有良好的SS抗原性和免疫原性。

生长抑素基因在猪胃组织中表达发育性变化及品种比较

选用生长速度快的瘦肉型猪大白猪和生长速度慢的肥胖型猪二花脸作为试验动物 ,用相对定量RT PCR方法 ,研究猪胃体部组织中生长抑素 (somatostatin ,SS)基因表达发育性变化并进行品种间比较。结果表明 ,(1)出生当天两品种猪胃体部组织中SSmRNA表达水平较高 ,但出生后第 3天均出现显著下降 (P <0 .0 5 ) ;(2 )从 3日龄到 30日龄胃体部组织中SSmRNA表达在二花脸猪和大白猪均表现为上升 ,二花脸猪在 90日龄时达到高峰 ,随后下降。而大白猪在 30日龄之后保持相对稳定 ;(3)二花脸猪胃体组织中SSmRNA表达从出生到 90日龄均显著高于大白猪 (P <0 .0 5 ) ,二花脸猪胃体组织中SS表达自 12 0日龄下调 ,12 0～ 180日龄期间大白猪和二花脸猪胃体部SSmRNA表达没有间差异 (P >0 .0 5 )。以上结果提示 ,猪胃体部组织中SS基因表达调控有特定的时序性 ,并且呈现显著的品种差异 ,这是否与胃结构和功能的发育有关 ,还有待进一步研究。

口服生长抑素基因疫苗对小鼠免疫影响的初步研究

目的研究口服生长抑素(SS)基因疫苗在体内表达HBsAg/SS融合蛋白情况。方法用SS基因疫苗免疫小鼠,姬姆萨染色观察细菌在体内分布;观察小鼠质量增长情况;应用免疫组化法显示小肠乙肝表面抗原(HBsAg)和SS阳性细胞的分布及数量变化。结果免疫后16h空肠细菌数量达到高峰,免疫后4d脾脏出现细菌;两试验组小鼠体质量较对照组均无显著变化;首次免疫后第3周两试验组小肠内出现HBsAg阳性细胞并维持至第7周;首次免疫后第5、7周两试验组小肠内SS阳性细胞数量比对照组极显著减少(P<0.01)。结论口服型SS基因疫苗免疫小鼠后可在小肠表达HBsAg/SS融合蛋白,同时SS阳性细胞数量减少,推测该基因疫苗刺激机体表达蛋白后能产生SS抗体。

生长抑素基因在动物育种中的应用

生长抑素基因或生长分化因子8(GDF-8),已被公认为是导致出现双肌表现型的因素,基因失活导致肌肉中一系列的突变,使其没有能力调节肌肉纤维的沉淀。这种表型在一些品种如比利时兰牛、皮埃蒙特牛中有很高的发生率。系统发育分析显示,在生长抑素基因家族中存在着对同义突变的正选择压力,在牛、绵羊、山羊上生长抑素基因发生分歧的时间和这些品种中正面选择压力出现的时间都是在近代。迄今为止,据报道,在生长抑素的编码区有9个突变引起了非同义改变,其中3个引起了错义突变,2个在外显子1上,1个在外显子2上。剩余的6个突变位于外显子2和3上,它们使终止密码过早地出现,正是这些突变导致出现双肌表型。而双肌牛品种的管理上存在着像分娩困难等问题,这些问题可以通过遗传控制、基因工程来克服。

口服生长抑素基因疫苗对小肠局部细胞免疫的影响

目的研究口服生长抑素(SS)基因疫苗对小肠局部细胞免疫的影响。方法应用SS基因疫苗通过两种方式(试验组Ⅰ和试验组Ⅱ)灌胃小鼠,首次免疫后第3、5和7周分别扑杀小鼠,应用HE染色、亲和免疫组化和甲苯胺蓝染色的方法分别显示小肠上皮内淋巴细胞(iIEL)、固有层CD4+T细胞和肥大细胞的分布及数量变化。结果两个试验组iIEL数量比对照组有极显著增加(P<0.01);首次免疫后小肠固有层CD4+阳性细胞数量增加,但不显著;首次免疫后第3周空肠中肥大细胞数量与对照组相比有极显著性增加(P<0.01)。结论本试验结果提示了SS基因疫苗能提高小鼠肠道细胞免疫功能。

生长抑素基因工程疫苗对提高育肥猪生长性能的试验

选用80～85日龄体重相近的PIC育肥猪60头,随机分为两组,其中试验组30头,对照组30头。试验组注射生长抑素(ss)基因工程疫苗,观察猪的生长情况。结果显示,试验组0～4周平均净增重与对照组相比差异不显著(P>0.05);4～8周平均净增重31.50kg,比对照组提高24.46%,差异极显著(P<0.01);试验全期试验组料重比为3.58,对照组为3.70,试验组较对照组饲料利用率提高3.24%。

CRISPR/Cas9体外酶切检测猪生长抑素基因定点修饰靶点活性的研究

本试验旨在通过CRISPR/Cas9体外酶切法检测猪生长抑素(SST)基因定点修饰靶点的活性。试验设计5个长20bp的单链导向RNA(sgRNA),即SST-sgRNA-g1、SST-sgRNA-g2、SST-sgRNA-g3、SST-sgRNA-g4和SST-sgRNA-g5。化学合成sgRNA寡核苷酸序列,将寡核苷酸序列连接到可同时表达Cas9和sgRNA的质粒中,挑选正确克隆的质粒作为模板进行体外转录形成SST-sgRNA。利用CRISPR/Cas9体外酶切含靶点的DNA片段,根据酶切条带的灰度换算成sgRNA活性。结果显示目的sgRNA寡核苷酸双链成功插入到质粒中且序列正确,以质粒为模板体外转录SST-sgRNA成功。靶位点经Cas9蛋白酶切后与标准sgRNA1和sgRNA2酶切活性作比较,确定靶点SST-sgRNA-g1、SST-sgRNA-g4和SST-sgRNA-g5活性较高,可为在细胞水平、胚胎水平做基因定点修饰提供依据。

13/17罗伯逊易位猪生长抑素基因的多态性研究

采用微量全血培养法制备染色体标本,对13/17罗伯逊易位猪的3种杂交组合的309头后代进行核型鉴定,结果样本中存在3种核型的猪：正常核型猪（2n=38）、易位杂合子猪（2n=37）和易位纯合子猪（2n=36）;利用PCR-SSCP技术检测发现生长抑素基因外显子1不存在多态性;其内含子的266~602 bp片段存在2个突变位点（T520C,G521T）,但仅检测到2种基因型：AA和AB。遗传多态性分析结果表明,不同杂交组合后代及不同核型的猪群中AA基因型频率（频率范围为0.58~0.77）和A等位基因频率（频率范围为0.79~0.90）均显著高于其AB基因型频率（0.23~0.42）和B等位基因频率（0.10~0.21）;易位杂合子猪的AB基因型频率（0.42）均高于正常猪（0.25）及易位纯合子猪（0.40）。经卡方检验,差异不显著（P〉0.05）,群体的基因型频率处于哈代-温伯格平衡状态。

生长抑素基因工程疫苗免疫牦牛绵羊试验

用生长抑素基因工程苗(SS)对自然放牧状态下的牦牛、绵羊作免疫增重试验,观察增重效果。试验表明,SS苗免疫牦牛、绵羊后日增重分别提高34%和43%,幼畜成活率分别提高10.1%和15.8%。

牛生长抑素基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 :在大肠杆菌中克隆表达牛生长抑素基因并初步纯化。方法 :根据牛生长抑素基因序列 ,按照大肠杆菌偏爱密码子设计合成 2个DNA片段 ,经退火、Klenow酶补平及连接反应 ,获得牛生长抑素基因片段 ;经PCR扩增、EcoRⅠ和BamHⅠ酶切 ,牛生长抑素基因被克隆在表达质粒 pALEX中。 结果 :将重组质粒转化BL2 1(DE3 ) ,经IPTG诱导获得表达。表达产物经超声破碎和GST Sepharose 4B亲和层析纯化获得重组蛋白。结论 :牛生长抑素基因得到了高水平表达并初步纯化 ,为表达产物的大量制备。

生长抑素基因工程苗对商品育肥猪肉质的影响

选用同一批次、日龄、体重相近的D×(Y×T)内三元育肥猪50头,随机分成2组,试验组35头,对照组15头。试验组在正试当天于耳后一次性肌肉注射生长抑素基因工程苗(激生1号)1ml,对照组不注射,试验结束后对2组的常规肉质指标进行测定。结果表明:用生长抑素基因工程苗免疫商品育肥猪后,其肉色不受影响、肌内脂肪呈理想分布、pH值正常。在失水率、熟肉率、滴水损失和嫩度指标中,试验组的失水率比对照组高0.03%;滴水损失试验组比对照组高2.32%。经T检验,差异不显著(P>0.05)。试验组和对照组的剪切力值分别为3.06±0.42kg和3.44±0.30kg,对照组比试验组高0.38kg。经T检验,差异不显著(P>0.05)。

生长抑素基因工程活载体疫苗对肉兔生长性能的影响

选择30日龄左右体重相近、健康的新西兰肉兔36只,分为2组(试验组和对照组),每组18只肉兔(公母相等)。试验组注射激生1号(按产品标准剂量),对照组注射等量生理盐水。连续饲养35d。试验结果表明:激生1号可以使新西兰肉兔增重提高23.74%,采食量提高9.36%,发病率和料肉比明显降低。

生长抑素基因工程亚单位苗——(激生3号苗)

本成果是由南京南农高科技股份 有限公司独立研制成功的,来源于本项研究主持人之一——南京农业大学杜念兴教授,于七五、八五期间主持农业部生物技术重点项目——生长抑素基因工程疫苗研究。为了克服利用“