人生长激素释放激素受体剪接变异体1型对人肝癌细胞HepG2增殖的影响

目的:探讨人生长激素释放激素受体剪接变异体1型(GHRHR SV1)对肝癌细胞系HepG2增殖的影响,阐明GHRHR SV1对人肿瘤细胞的促增殖作用。方法:将GHRHR SV1真核表达载体导入HepG2细胞建立HepG2-SV1细胞系。设计对照组(野生型HepG2)、空载质粒组(HepG2-pCDNA 3.0细胞系)和干扰组(HepG2-SV1细胞系)。采用PCR和Western blotting法鉴定HepG2-SV1细胞系,CCK-8法检测各组细胞的增殖率,克隆形成实验检测各组细胞的单克隆形成率,细胞划痕实验检测细胞的迁移率。结果:PCR与Western blotting法检测,构建的HepG2-SV1细胞系能稳定表达GHRHR SV1;CCK-8法检测,干扰组HepG2-SV1细胞系的增殖率高于空载质粒组HepG2-pcDNA3.0细胞系(P<0.05);克隆形成实验,干扰组HepG2-SV1细胞系的单克隆形成率约为空载质粒组HepG2-pcDNA3.0细胞系的3.5倍(P<0.05);细胞划痕实验,所构建的干扰组HepG2-SV1细胞系的迁移率高于空载质粒组HepG2-pcDNA3.0细胞系(P<0.05)。结论:GHRHR SV1能促进HepG2细胞的增殖。

生长激素释放激素受体剪接变异体1在子宫内膜异位症中的表达

目的:研究生长激素释放激素受体剪接变体1(SV1),一种生长激素释放激素(GHRH)受体的变体在子宫内膜异位症的表达模式。方法:在位和异位子宫内膜组织、腹膜B细胞采自有或没有子宫内膜异位症的妇女,正常卵巢组织采自没有子宫内膜异位症的妇女。分离异位子宫内膜基质干细胞(ESC)并加入GHRH培养,GHRH和SV1在样品组织的基因表达由RT-PCR检测,BrdU的摄入由特定的分析系统检测。结果:54份子宫内膜异位组织中有34份(63.0%)表达SV1 mRNA,显著高于在位内膜组织(4.3%)和正常卵巢组织(0.0%)。GHRH mRNA在异位子宫内膜组织的表达为22.2%(12/54),在位内膜组织中为25.9%,而在正常卵巢组织中为100.0%(14/14)和腹膜B细胞为81.3%(13/16)。GHRH能刺激表达SV1的ESC增加BrdU摄入。结论:GHRH和SV1在异位内膜表达谱不同于在位内膜,GHRH激活SV1并刺激细胞的增殖。

生长激素释放激素拮抗剂对人异位子宫内膜抑制增殖作用与cAMP信号通路相关

目的研究生长激素释放激素拮抗剂对异位子宫内膜细胞增殖的作用及与cAMP信号通路的关系。方法异位子宫内膜组织采自子宫内膜异位症的妇女,分离异位子宫内膜基质细胞(ESC)。并加入GHRH拮抗剂JV-1-36培养。GHRH,GHRH受体(GHRH-R)和GHRH-R剪接变异体(SV)1 mRNA由反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测,细胞增殖通过细胞对BrdU的摄入来检测,放免法检测细胞内cAMP水平。结果 GHRH-R mRNA表达于ESC,而不表达于正常子宫内膜组织;SV1mRNA表达于正常子宫内膜及ESC。GHRH拮抗剂JV-1-36能降低异位子宫内膜基质细胞cAMP,减少细胞BrdU摄入。结论GHRH拮抗剂JV-1-36能抑制异位子宫内膜基质细胞增殖,其机制可能与cAMP信号通路有关。

GHRHR-SV1抗体的制备及其蛋白在黑色素瘤细胞中的表达

目的:制备生长激素释放激素受体剪接变异体1(GHRHR-SV1)抗体,并检测GHRHR-SV1蛋白在黑色素瘤细胞中的表达情况,为后续的肿瘤机制研究奠定基础。方法:设计GHRHR-SV1基因序列,将其插入质粒pET-32a(+)中,构建pET-GHRHR-SV1重组载体,经PCR及测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,分别加入0、0.5、1.0、1.5和2.0mmol·L^(-1)异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG);诱导1、2、4和6h,并在37℃、30℃和25℃不同温度下进行诱导;观察目的蛋白表达的最佳IPTG浓度、时间和温度。亲和层析纯化重组蛋白,将纯化后的蛋白免疫家兔,制备兔多克隆抗体,ELISA法检测该抗体效价,Western blotting法检测GHRHR-SV1蛋白在黑色素瘤细胞系B16-F10中的表达情况。结果:重组载体pET-GHRHR-SV1构建成功。在IPTG浓度为2.0mmol·L^(-1)时目的蛋白的表达量最高;IPTG诱导蛋白表达2h时,蛋白表达量最大;当温度为25℃时,蛋白的表达量最大。诱导表达的蛋白相对分子质量约为24 000,纯化后纯度为80%,GHRHR-SV1抗体效价为1∶1 600 000,B16-F10细胞中有GHRHR-SV1蛋白表达。结论:成功制备pETGHRHR-SV1重组载体。GHRHR-SV1蛋白在IPTG浓度为2.0mmol·L^(-1)、诱导时间为2h和温度为25℃的条件下表达最佳。成功制备了高效价的GHRHR-SV1抗体。黑色素瘤细胞系中有GHRHR-SV1蛋白表达。