茶树生长素抑制蛋白基因CsARP1的克隆与表达分析

从茶树休眠芽抑制消减杂交文库中分离得到生长素抑制蛋白基因的3'-片段,以休眠芽为材料,利用RACE技术克隆了其cDNA全长,并利用荧光定量PCR研究了该基因在不同休眠阶段芽的相对表达量。结果从茶树休眠芽中获得一个全长为711bp的生长素抑制蛋白基因CsARP1(GenBank登录号为HQ225758)。该基因开放阅读框为357bp,编码118个氨基酸,推测的蛋白质分子量为12.82KD,等电点约为9.57。多序列比对结果显示,该基因编码的氨基酸序列与其他植物的ARP蛋白序列相似性达到70%以上,具有生长素抑制基因家族的保守结构域。荧光定量PCR结果表明,CsARP1基因在休眠阶段表达量较高,而在解除休眠(萌发)后表达量较低,说明CsARP1基因可能与茶树芽休眠有关。

花生生长素抑制蛋白基因AhARP的表达分析

种子休眠性是花生重要的农艺性状。为了挖掘控制花生种子休眠的重要基因,以花育52号为试材,通过转录组测序获得生长素抑制蛋白基因的全长,该基因全长为918bp,开放阅读框为363bp,编码121个氨基酸,推导出的蛋白质分子量为13.44 k Da,理论等电点p I=9.64。序列比对表明,该序列与花生生长素抑制蛋白基因Ah ARP一致,确认该c DNA序列为编码花生生长素抑制蛋白基因的全长c DNA序列。荧光定量PCR结果表明,Ah ARP基因在种子休眠阶段表达量较高,种子休眠解除后表达量降低;乙烯利释放吸涨种子休眠过程中,Ah ARP基因受到明显诱导;说明Ah ARP基因可能与花生种子休眠有关。Ah ARP基因的序列、结构、性质以及功能的初步分析,为进一步研究该基因在花生种子休眠中的功能机制奠定了基础。

大鼠自体移植静脉中转化生长因子β1和基质金属蛋白酶1及其抑制剂的基因表达

目的观察转化生长因子β1和基质金属蛋白酶1及其抑制剂在大鼠自体移植静脉中的动态表达,探讨它们与移植静脉内膜增生之间的关系。方法建立大鼠自体静脉移植模型,随机分成3、7、14和28天组。行苏木素—伊红及Verhoffe染色,计算机图像分析系统测量不同时间点的内膜和血管壁厚度。采用Western印迹和逆转录—聚合酶链反应测定转化生长因子β1、基质金属蛋白酶1及基质金属蛋白酶组织抑制剂1的蛋白及mRNA表达。结果术后7天内膜明显增厚,与对照组比较有统计学意义(P<0.05),术后14天内膜增生达到高峰。转化生长因子β1蛋白表达在术后第3天开始增加,第7天达到高峰,第28天回到基线水平。3天和7天组基质金属蛋白酶1的蛋白水平与对照组比较没有明显差别,14和28天组比对照组明显减少。基质金属蛋白酶组织抑制剂1的蛋白表达在第14和28天明显增加。三者mRNA水平的变化趋势与蛋白表达结果相似。结论转化生长因子β1通过破坏基质金属蛋白酶1与基质金属蛋白酶组织抑制剂1之间的平衡,从而使细胞外基质过量堆积,是内膜增生和血管狭窄形成的机制之一。

生长素结合蛋白ABP1基因在棉纤维伸长中的功能

以‘湘杂棉14’为材料,采用RT–PCR方法克隆了棉花ABP1基因全长cDNA序列。序列全长792 bp,与GenBank中陆地棉ABP1基因序列的同源性为99%。半定量分析表明,该基因在棉花叶、花及纤维中都有表达,其中叶中的表达量最高,花和纤维中的表达量稍低。ABP1基因在纤维快速伸长期表达水平较高,纤维发育的其他时期的表达水平较低。将ABP1基因cDNA构建成棉花ABP1过表达载体,并以NPT II作为选择标记,经农杆菌介导转化棉花,获得了6株Kan抗性植株,其中3株ABP1表达水平提高。ABP1过表达植株生长发育正常,但纤维长度变化不显著,说明ABP1棉纤维细胞中提高表达水平对其细胞伸长没有显著作用。

遗传性卵巢癌中乳腺癌抑制蛋白1/2和错配修复蛋白MutS同源物2基因突变的意义研究

目的研究遗传性卵巢癌中乳腺癌抑制蛋白1/2(BRCA1/2)和错配修复蛋白MutS同源物2(MSH2)基因突变意义。方法选取2019年6月至2023年6月于新余市人民医院就诊的13例家族遗传性卵巢癌患者及家系中5名Ⅰ代健康亲属、20名Ⅱ/Ⅲ代健康亲属作为研究对象。采集所有研究对象空腹静脉血5 ml,分离提取DNA行聚合酶链式反应扩增后直接测序比对,研究遗传性卵巢癌家族中有意义的错义突变基因。结果13例家族遗传性卵巢癌患者临床分期以Ⅲ期、组织分级以低-中分化、有淋巴结肿转移为主。13例患者基因测序显示,BRCA1基因发现突变6处中,无意义突变3处,新发现突变3处。新发现3处突变中3780A>G、5069A>G造成氨基酸变化,3326A>T突变造成Arg突变成终止密码子,共同存在突变为3326A>T。BRCA2基因测序检测出突变6处,无意义突变5处,其中共同存在突变为1342A>C。MSH2基因测序发现无意义突变2处。健康家系中,携带BRCA1基因3326A>T突变3例(12.00%),携带BRCA2基因1342A>C突变12例(48.00%),其余女性测序结果正常。结论BRCA1基因杂合突变3326A>T和BRCA2基因杂合突变1342A>C是遗传性卵巢癌家族发病的致病基因,可为临床早发现、早诊断、早治疗提供指导。

人转化生长因子β3、结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶抑制剂1基因重组慢病毒多表达质粒的构建及活性检测

背景:前期试验显示单个病毒载体介导的多基因共表达系统能够显著提高椎间盘退变转基因疗效。目的:构建人转化生长因子β3、结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶抑制剂1基因重组慢病毒多表达质粒。方法:应用全基因合成技术,以"自剪切多肽2A"串联目的基因,并克隆到慢病毒表达质粒构建重组慢病毒质粒Lenti-TGF-β3-P2A-CTGF-T2A-TIMP1。转染293细胞后,应用RT-PCR和Western-Blot技术分别检测转染后不同时间点目的基因mRNA和蛋白质表达水平。结果与结论:RT-PCR和Western-blot技术检测结果显示重组质粒成功表达了3种目的基因,并于转染后48h左右达到峰值,"2A"结构下游基因蛋白质表达量约为上游基因的80%。说明成功构建了携带人转化生长因子β3、结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶抑制剂1基因的慢病毒多表达质粒。

抑制lncRNA TUG1下调核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白1炎症小体在延缓阿尔茨海默病进展的作用

目的探讨敲低长链非编码RNA(lncRNA)牛磺酸上调基因1(TUG1)抑制核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白1(NLRP1)炎症小体在缓解阿尔茨海默病进展中的作用。方法选取9~10周龄遗传背景为C57/BL6的野生型小鼠(WT组,10只)或淀粉样前体蛋白(APP)/早老素1(PS1)转基因小鼠(30只)。APP/PS1转基因小鼠随机分为模型(model)组,模型+敲低lncRNA TUG1组[model+lncRNA TUG1短发夹RNA(shRNA)组]和model+shRNA非靶标(NT)组,每组10只。分别采集12周龄第1天(3月龄)和32周龄第1天(8月龄)小鼠外周血和脑皮质组织,并分离皮质中的原代小胶质细胞和原代星形胶质细胞,每个时间点每组5只小鼠。Real-time PCR分别测定3月龄和8月龄上述4个分组小鼠脑皮质组织和原代小胶质细胞中lncRNA TUG1和巨噬细胞移动抑制因子(MIF)mRNA的水平,以及原代星形胶质细胞中补体蛋白C1r和C1s mRNA的水平。ELISA法测定其外周血浆中MIF含量。对3月龄和8月龄小鼠脑皮质原代小胶质细胞和原代星形胶质细胞共培养。CCK-8法测定上述2种细胞的增殖能力。Western blotting分别测定3月龄和8月龄上述4个分组小鼠脑皮质组织中MIF、白细胞介素1β前体(pro-IL-1β)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、Caspase-1(p20)、Caspase-1(full)、NLRP1及NLRP3蛋白的表达水平。采用免疫荧光染色法测定8月龄各分组小鼠脑皮质组织中β淀粉样蛋白(Aβ)表达。结果3月龄和8月龄时,与WT组小鼠相比,model组小鼠脑皮质组织和原代小胶质细胞中lncRNA TUG1和MIF相对表达水平显著上调,原代小胶质细胞和原代星形胶质细胞增殖能力增强(P<0.05)。与model组相比,model+lncRNA TUG1 shRNA组小鼠脑皮质组织和原代小胶质细胞中lncRNA TUG1和MIF的相对表达水平显著降低,原代小胶质细胞和原代星形胶质细胞增殖能力降低(P<0.05)。与WT组相比,model组小鼠外周血浆中MIF含量显著升高;小鼠脑皮质组织中pro-IL-1β、ASC、Caspase-1(p20)、Caspase-1(full)、NLRP1以及NLRP3的蛋白表达水平显著升高;Aβ免疫荧光强度明显增强(P<0.05)。与model组相比,model+lncRNA TUG1 shRNA组小鼠外周血浆中MIF含量显著降低;小鼠脑皮质组织中pro-IL-1β、ASC、Caspase-1(p20)、Caspase-1(full)和NLRP1的蛋白表达水平显著降低,Aβ免疫荧光强度明显降低(P<0.05),而NLRP3蛋白质的表达水平无明显变化(P>0.05)。与model组相比,model+shRNA NT组小鼠上述所有检测指标差异均无显著性(P>0.05)。结论APP/PS1转基因小鼠脑皮质组织和原代小胶质细胞中lncRNA TUG1和MIF因子表达上调与脑皮质内NLRP1炎症小体激活成正相关,敲低lncRNA TUG1可缓解阿尔茨海默病的进展。

肿瘤转移抑制基因KiSS-1和基质金属蛋白酶-9在肝细胞癌门静脉癌栓中的表达

背景与目的:肿瘤转移抑制基因KiSS-1与恶性肿瘤的转移具有一定关系,但它与肝细胞癌的转移特别是与门静脉癌栓形成的关系罕有报道。本实验探讨KiSS-1基因在门静脉癌栓形成中的作用及机制。方法:应用RT-PCR法和免疫组化方法检测50例肝细胞癌组织及11例门静脉癌栓组织中KiSS-1基因和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表达。结果:门静脉癌栓组、伴癌栓肝细胞癌组、不伴癌栓肝细胞癌组中KiSS-1基因的mRNA阳性率分别为18.2%(2/11)、16.1%(5/31)、63.2%(12/19),蛋白阳性率分别为0%(0/11)、12.9%(4/31)、47.4%(9/19),癌栓组和伴癌栓肝细胞癌组的KiSSmRNA和蛋白阳性率均明显低于不伴癌栓肝细胞癌组(P<0.05),而癌栓组与伴癌栓肝细胞癌组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。各组中MMP-9mRNA的阳性率分别为72.7%(8/11)、77.4%(24/31)、31.6%(6/19),MMP-9蛋白的阳性率分别为81.8%(9/11)、83.9%(26/31)、42.1%(8/19),癌栓组与伴癌栓肝细胞癌组的MMP-9mRNA和蛋白阳性率之间差异均无统计学意义(P>0.05),但均明显高于不伴癌栓的肝细胞癌组(P<0.05)。KiSS-1基因与MMP-9的mRNA和蛋白阳性率均呈负相关(r值分别为-0.362、-0.473,P值均<0.05)。结论:KiSS-1基因、MMP-9与门静脉癌栓的形成密切相关,KiSS-1基因可能通过抑制MMP-9表达而抑制门静脉癌栓的形成。

协同抑制番茄ACO1对果实成熟及病程相关蛋白基因表达的影响

目的探讨协同抑制番茄ACO1基因对果实成熟和病程相关蛋白基因表达、内源乙烯生物合成及果实耐贮性的影响。方法采用PCR或RT-PCR方法克隆了番茄ACC氧化酶1、ACC氧化酶3、EBF1、PR1、PR5以及NP24基因片段,并以此制备探针,以协同抑制ACO1的转基因番茄和野生型番茄为研究对象,进行Northern杂交,同时测定了伤害叶片和果实的乙烯释放量,并进行了果实贮藏试验等。结果Northern杂交结果表明,番茄ACO1基因表达被抑制后,与果实成熟相关基因LeACO3和LeEBF1,以及病程相关蛋白基因LePR1、LePR5和LeNP24的表达量急剧降低。乙烯释放量测定试验和果实贮藏试验结果表明,协同抑制LeACO1番茄完整和受伤叶片以及完整果实内源乙烯释放量相对于野生型番茄大大减少,成熟果实贮藏时间延长。结论协同抑制番茄ACO1基因表达的同时,与果实成熟相关基因和病程相关蛋白基因的表达也不同程度地受到抑制,而且其内源乙烯生物合成减少,果实耐贮性增强。

槲皮素抑制小鼠血吸虫病肝组织即早基因和基质金属蛋白酶组织抑制因子1的表达

分别运用槲皮素及吡喹酮治疗小鼠日本血吸虫肝纤维化。槲皮素治疗后小鼠肝纤维化程度减轻,肝组织中即早基因c-fos与c-jun及基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)和Ⅰ、Ⅲ型胶原含量均明显低于感染对照组;与吡喹酮组相比,c-junmRNA、Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显降低,而c-fosmRNA、TIMP1含量无显著改变,提示其远期抗血吸虫肝纤维化效果优于吡喹酮。

蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因转染对小鼠黑色素瘤B16F1细胞基因表达谱的影响

背景与目的:本实验室已证明蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(snake venom cystatin,sv-cystatin)具有抗肿瘤侵袭转移作用,为了进一步阐明其分子机制,本研究利用高通量的基因芯片技术探讨sv-cystatin基因转染对小鼠黑色素瘤细胞(B16F1)基因表达谱的影响。方法:分别将pcDNA3.1/sv-cystatin及空载体pcDNA3.1转染B16F1细胞,建立稳定转染的B16F1/sv-cystatin及B16F1/pcDNA3.1细胞株,提取总mRNA,应用高通量的基因芯片技术检测差异表达基因,半定量RT-PCR法分别验证5个上调和5个下调的差异表达基因。结果:B16F1细胞经转染sv-cystatin后,共检测了1218个基因,其中有45个差异表达基因,21个基因表达上调(Ratio>3),24个基因表达下调(Ratio<0.5),这些基因的功能涉及细胞粘附迁移、细胞免疫调节、增殖分化与凋亡、基因转录和细胞内信号转导等方面。10个差异表达基因的RT-PCR验证结果与基因芯片分析结果相符。结论:Sv-cystatin不仅具有抑制细胞外基质的作用,而且还具有细胞免疫调节、增殖分化与凋亡、基因转录和细胞内信号转导等多种生物学功能。

抗纤复方药物血清对HSC-LI90细胞Ⅰ型、Ⅳ型前胶原和基质金属蛋白酶及其组织抑制因子-1基因表达的影响

目的 :探讨抗纤复方药物血清对肝星形细胞 (HSC)LI90细胞 (HSC LI90 )Ⅰ型、Ⅳ型前胶原和基质金属蛋白酶 (MMPs)及其组织抑制因子 (TIMP 1)基因表达的影响。方法 :以 0 5、2 0、4 0 g/kg等不同剂量抗纤复方灌胃大鼠 ,制备药物血清 ,作用于HSC LI90细胞 4 8h ,应用Northern印迹杂交的方法 ,检测Ⅰ型、Ⅳ型前胶原、基质金属蛋白酶 2 (MMP 2 )及膜型基质金属蛋白酶 (MT1 MMP)及其组织抑制因子(TIMP 1)基因的表达 ,并用酶图法检测基质金属蛋白酶 2的活性。结果 :(1)抗纤复方不同浓度药物血清能抑制HSC LI90细胞Ⅰ型、Ⅳ型前胶原及其组织抑制因子TIMP 1的基因表达 (P <0 0 5或P <0 0 1) ;(2 )能增加膜型基质金属蛋白酶基因表达 (P <0 0 1) ;(3)对基质金属蛋白酶 2基因表达及活性无影响 (P >0 0 5 )。结论 :(1)抗纤复方具有抗肝纤维化作用 ;(2 )抗纤复方抑制HSC LI90细胞TIMP 1基因表达水平 ,促进胶原降解 ,可能是抗肝纤维化的作用机制之一。

转移抑制基因1和基质金属蛋白酶-9在鼻咽癌中表达的相关性及临床意义

目的检测鼻咽癌组织中转移抑制基因1(MTSS1)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达,并探讨两者的相关性及其临床意义。方法采用免疫组化法检测60例鼻咽癌和26例慢性鼻咽炎组织中MTSS1和MMP-9蛋白的表达,并分析两蛋白的表达与鼻咽癌临床特征的关系及二者的相关性。结果鼻咽癌中MTSS1的阳性表达率为66.7%(40/60),低于慢性鼻咽炎中的92.3%(24/26),两组比较,差异有统计学意义(P<0.05);鼻咽癌中MMP-9的阳性表达率为71.7%(43/60),高于慢性鼻咽炎中的34.6%(9/26),两组比较,差异显著(P<0.01);鼻咽癌中MTSS1和MMP-9的表达均与淋巴结转移相关(P<0.05);鼻咽癌中MTSS1与MMP-9的表达呈负相关(r=-0.288,P<0.05)。结论 MTSS1的低表达和MMP-9的高表达在鼻咽癌的发生及转移方面可起重要作用,联合检测两蛋白的表达对鼻咽癌的早期诊断及转移判断具有一定的临床指导意义。

α1-抗胰蛋白酶和组织因子途径抑制物基因多态性的交互作用及其与大肠癌侵袭和转移的关系

目的:探讨α1-抗胰蛋白酶(α1-antitypsin,α1-AT)基因第5外显子和组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor,TFPI)基因T287C多态性的交互作用及其与大肠癌侵袭和转移的关系。方法:选择河南省新乡医学院第一附属医院2011年7月至2015年7月期间收治的经病理学确诊的大肠癌TNMⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期患者各180例,以180例TNM 0期患者作为对照组,用PCR-RFLP技术检测各组患者外周血白细胞两基因的多态性,以Hardy-Weinberg平衡检验分析样本的群体代表性,以Khoury和Wagener模型分析两基因多态性的交互作用。ELISA法检测患者血清α1-AT和TFPI蛋白表达,细胞划痕试验和Transwell侵袭试验分别检测α1-AT和TFPI对人结肠癌SW480细胞迁移和侵袭能力的影响,Western blotting检测SW480细胞胰蛋白酶、组织因子(tissue factor,TF)和蛋白酶激活受体-2(protease-actieated receptor 2,PAR-2)表达水平。结果:α1-AT(MZ)、α1-AT(ZZ)、TFPI(TC)和TFPI(CC)基因型者大肠癌侵袭与转移的风险均显著增加,且在α1-AT(MZ)和TFPI(TC)之间、α1-AT(MZ)和TFPI(CC)之间、α1-AT(ZZ)和TFPI(TC)及α1-AT(ZZ)和TFPI(CC)之间均存在正向交互作用(均γ>1)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期患者血清α1-AT(或TFPI)表达明显低于0期组,且Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期患者之间血清α1-AT(或TFPI)表达也有明显差异(P<0.01)。同一组携带突变基因型个体的血清α1-AT(或TFPI)表达明显低于携带野生型个体(P<0.01)。体外细胞培养实验显示,α1-AT可明显抑制SW480细胞胰蛋白酶的表达,而TFPI则明显抑制TF表达,而两者均可明显降低细胞PAR-2的表达及细胞迁移和侵袭能力。结论:α1-AT(MZ)、α1-AT(ZZ)、TFPI(TC)和TFPI(CC)基因型均是大肠癌侵袭与转移的高危因素,基因多态性的交互作用增加了大肠癌侵袭与转移的风险。

PIM-1基因沉默对前列腺癌细胞生长抑制作用的研究

目的:探讨RNA干扰(RNAi)沉默PIM-1基因表达对前列腺癌细胞体外生长的影响。方法:将RNAi重组质粒(PPIM1-shRNA-3)经脂质体介导转染前列腺癌PC-3细胞,用G418筛选稳定转染、PIM-1基因沉默的PC-3细胞。用空质粒载体(pRNAT-U6.1/Neo)稳定转染的PC-3细胞和正常培养的PC-3细胞作为对照,进行体外研究。利用细胞计数法分别检测3组PC-3细胞的增殖能力。利用流式细胞技术分别检测3组PC-3细胞的细胞周期及凋亡情况。结果:与两对照组PC-3细胞相比,PIM-1基因沉默组的PC-3细胞在培养48、72和96h的细胞计数显著减少(P<0.01),细胞周期中G1期细胞的比例显著升高,而S期细胞的比例显著降低(P<0.01),发生早期凋亡的细胞比例明显升高(P<0.01)。结论:PIM-1基因沉默可以使得PC-3细胞的细胞周期进程受阻,抑制细胞增殖,并诱发细胞凋亡。PIM-1可以作为前列腺癌基因治疗的有效靶点,具有潜在的临床应用价值。

纤维蛋白溶解酶原激活物抑制物-1基因多态性与抑郁发作及冠心病的关系

目的探讨纤维蛋白溶解酶原激活物抑制-1(PAI-1)基因4G/5G多态性与抑郁发作和冠心病的相关性。方法选取抑郁发作患者42例、冠心病患者65例和健康个体132例,分别组成抑郁发作组、冠心病组和健康对照组,应用等位基因特异性PCR的方法了解各组PAI-1基因4G/5G多态性情况。结果抑郁发作组和冠心病组的4G/4G基因型频率和4G等位基因频率均高于健康对照组(P<0.05),抑郁发作组与冠心病组PAI-1基因-675位点的4G/4G基因型频率和4G等位基因频率均差异无统计学意义(P>0.05)。结论 PAI-1基因4G/4G基因型和4G基因可能与抑郁发作与冠心病都有关,推测与两者伴发有一定联系。

基质金属蛋白酶组织抑制剂1基因重组腺病毒载体的构建

目的为探讨基因治疗逆转或延缓椎间盘退变的可行性,构建及制备人基质金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP1)cDNA重组腺病毒载体。方法以含TIMP1 cDNA序列的质粒为模板,通过PCR方法扩增TIMP1cDNA片段,将TIMP1 cDNA全长定向克隆到Ad5MaxTM腺病毒系统的穿梭质粒pDC316上,构建pDC316-TIMP1穿梭质粒;使用Ad5MaxTM腺病毒包装系统,脂质体介导的穿梭质粒及骨架质粒pBHGlox-E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组构建含TIMP1 cDNA的重组腺病毒Ad5-TIMP1,通过PCR方法鉴定重组腺病毒Ad5-TIMP1的正确性。通过阴离子柱层析方法纯化重组腺病毒Ad5-TIMP1并测定重组腺病毒感染滴度。结果经PCR及酶切方法证实pDC316-TIMP1穿梭质粒中存在630 bp大小左右的插入片段,与目的基因TIMP1的cDNA大小一致;经PCR鉴定证实TIMP1 cDNA重组腺病毒载体Ad5-TIMP1构建成功,病毒感染性滴度为1×1010IU/mL。结论成功构建TIMP1 cDNA重组腺病毒载体,为应用基因治疗方法逆转或延缓椎间盘退变的研究奠定实验基础。

苎麻生长素结合蛋白BnABP1与GFP融合在烟草中的表达

运用已克隆的苎麻生长素结合蛋白BnABP1基因cDNA及植物表达载体pCAMBIA1300 GFP,构建了35S启动子控制的苎麻BnABP1基因编码区段与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合表达重组体(pCAMBIA1300 GFP BnABP1)。通过根癌农杆菌介导法将其转化烟草WS38,经抗性筛选和PCR检测获得了转基因烟草。对转基因烟草细胞进行荧光显微镜观察,发现在细胞质膜和内膜系统上都有较强烈的荧光信号,进一步证明苎麻生长素结合蛋白ABP1已结合在细胞的膜系统上。

应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选丙型肝炎病毒NS3蛋白反式激活基因1的反式调节基因

目的:筛选与克隆丙型肝炎病毒(HCV)NS3反式激活基因1 的反式激活基因,了解其可能存在的调节功能线索. 方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioin- formatics),技术筛选并克隆NS3TP1反式激活的新型靶基因. 以NS3TP1表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3TP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa I酶切后, 将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA 消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果:成功构建人NS3TP1反式激活基因差异表达的cDNA 消减文库.文库扩增后得到68个阳性克隆,进行菌落PCR 分析,均得到200-1000 bp插入片段.随机挑选其中36个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得23种编码基因,其中3个为未知功能的新基因. 结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因, 推测了NS3TP1可能存在的调控机制的线索.

转移抑制基因nm23-H_1蛋白表达与结直肠癌的关系

目的:研究转移抑制基因ｎｍ２３－Ｈ１蛋白表达与结直肠癌生物学行为的关系,探讨ｎｍ２３－Ｈ１基因表达在结直肠癌发牛发展中的作用。方法:采用免疫组化技术,对４６例结直肠癌组织中ｎｍ２３－Ｈ１基因的表达状态进行定位观察。结果:结直肠癌ｎｍ２３－Ｈ１基因蛋白阳性表达率为４３．５%;ｎｍ２３－Ｈ１基因的表达与结直肠癌的分化程度及肿块大小无显著性差异(Ｐ＞０．０５),但与结直肠癌的淋巴结转移、临床分期以及侵犯深度有相关差异(Ｐ＜０．０５);随着转移的发生、侵犯深度的增加以及疾病向晚期发展,ｎｍ２３－Ｈ１基因的阳性表达率逐渐下降,直至完全失活。结论:作为肿瘤转移抑制基因,ｎｍ２３－Ｈ１基因在调控癌细胞增殖、抑制癌细胞转移方面起着重要的作用;ｎｍ２３－Ｈ１蛋白可作为临床判断结直肠癌侵袭转移、临床分期和患者预后的指标之一。