人生长终止特异性同源盒基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的生长终止特异性同源盒(growth arrest-specific homeobox,Gax)基因表达产物是核转录因子,主要存在于心血管系统中,对胚胎发育、细胞生长、分化和迁移等起基因调控作用,其表达异常与多种疾病相关。为深入研究Gax基因在临床疾病中的作用,文中构建表达了人Gax基因的重组腺病毒载体。方法根据pEGFP-N1-Gax质粒的多克隆位点,用NheⅠ和HindⅢ双酶切获得人Gax基因片段,连接至穿梭质粒pDC18-mCMV上,构建穿梭质粒pDC318-mCMV-Gax,然后与骨架质粒pPE3共转染293包装细胞,同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-Gax,反复感染293细胞扩增病毒后,氯化铯梯度离心纯化病毒,并测定病毒滴度。结果穿梭质粒pDC318-mCMV-Gax经双酶切和测序证实构建成功;PCR鉴定人Gax基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度为4.5×1010pfu/ml。结论该研究成功构建了重组腺病毒载体Ad5-Gax,为进一步在体内外研究Gax基因参与多种疾病的发生发展提供了材料。

生长终止特异性同源盒基因稳定转染兔血管平滑肌细胞的研究

生长终止特异性同源盒基因（Gax）是一种转录因子，属同源盒基因超家族一员，在细胞生长、分化、迁移等方面具有重要作用。我们将Gax稳定转染到兔血管平滑肌细胞（VSMCs）中，观察其对VSMCs增殖和迁移的作用。

胎儿生长受限孕妇血清与胎盘Gas6、Endoglin、PLAC-1表达水平及其临床意义

目的分析胎儿生长受限(FGR)孕妇血清及胎盘中生长阻滞特异性蛋白6(Gas6)、Endoglin、胎盘特异性蛋白1(PLAC-1)表达水平,并探讨其临床意义。方法选取2022年5月至2024年9月确山县人民医院收治的81例FGR孕妇为FGR组,按照1∶1配对原则,另选取同期81例无FGR孕妇为对照组。比较两组孕妇的基线资料和胎盘相关指标(Gas6 mRNA、Endoglin mRNA、PLAC-1 mRNA、胎盘厚度、胎盘质量),采用Pearson法分析胎盘各指标表达与胎盘厚度、胎盘质量、新生儿体质量的相关性,比较两组孕妇不同孕期的血清各指标水平,采用Pearson法分析孕妇血清与胎盘各指标表达的相关性,采用受试者工作特征曲线(ROC)分析血清各指标对FGR的预测价值。结果FGR组孕妇的新生儿体质量、PLAC-1 mRNA、胎盘厚度、胎盘质量[(2.13±0.32)kg、0.50±0.11、(1.90±0.66)cm、(0.38±0.10)kg]明显低于对照组[(3.23±0.29)kg、1.00±0.06、(2.51±0.57)cm、(0.59±0.08)kg],胎盘Gas6 mRNA、Endoglin mRNA(1.42±0.24、1.38±0.16)明显高于对照组(1.04±0.05、1.06±0.07),差异均有统计学意义(P<0.05);胎盘Gas6 mRNA、Endoglin mRNA与胎盘厚度、胎盘质量、新生儿体质量呈负相关(P<0.05),PLAC-1 mRNA与胎盘厚度、胎盘质量、新生儿体质量呈正相关(P<0.05);FGR组孕妇孕早、中、晚期的血清Gas6、Endoglin明显高于对照组,PLAC-1明显低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);孕早、中、晚期血清Gas6、Endoglin、PLAC-1表达与对应指标胎盘中表达量均呈正相关(P<0.05);经ROC分析结果显示,孕早、中、晚期血清Gas6、Endoglin、PLAC-1联合预测FGR的曲线下面积(AUC)分别为0.890、0.913、0.936,均优于单一指标,且血清各指标联合预测FGR的AUC随着孕期的推进依次增大,至孕晚期联合预测AUC为0.936,为最大。结论FGR孕妇血清及胎盘组织中Gas6、Endoglin、PLAC-1表达异常,且血清各指标联合检测对FGR具有一定预测价值,可作为临床早期评估FGR的辅助指标。

胎盘和蜕膜组织中生长阻滞特异性蛋白6和D-二聚体指标与子痫前期发病的关系

目的探讨胎盘和蜕膜组织中生长阻滞特异性蛋白6 (GAS6)和D-二聚体指标与子痫前期发病的关系。方法选取2014年3月-2018年12月中国人民解放军第一七四医院产科收治的子痫前期孕妇患者108例为研究对象纳入本研究,观察组患者按子痫发病程度分为重度组(59例)和轻度组(49例),并选取同期在本院进行分娩的健康孕妇50例为对照组。两组均采用剖宫产手术进行分娩,对两组受试者的胎盘和蜕膜组织中GAS6和D-二聚体指标进行检测对比,并对两组受试者血清中的游离脂肪酸(FFA)、三酰甘油(TG)、白蛋白(ALB)、血小板计数(PLT)及血清尿素氮(BUN)等指标水平进行检测对比。以Pearson检验对GAS6和D-二聚体与各项指标间的相关性进行分析探讨。结果观察组GAS6、D-二聚体、FFA、TG及BUN水平高于对照组,ALB、PLT水平低于对照组,组间比较差异有统计学意义(P<0. 05)。观察组内重度子痫前期患者GAS6、D-二聚体、FFA、TG及BUN水平高于轻度组,ALB、PLT水平低于轻度组,组间比较差异有统计学意义(P<0. 05)。经Pearson相关性检验,GAS6、D-二聚体与FFA、TG及BUN呈正相关性,与ALB、PLT呈负相关性。结论子痫前期患者胎盘和蜕膜组织中GAS6和D-二聚体水平呈现高表达现象,与子痫前期的发病和病情进展有一定的相关性,通过对子痫前期患者的GAS6和D-二聚体水平的检测,可以为该病的诊断、病情评估提供参考。

生长阻滞特异性蛋白6表达与胎儿生长受限的相关性分析

目的探讨胎盘及外周血中生长阻滞特异性蛋白6(Gas6)的表达与胎儿生长受限(FGR)的相关性。方法选取2020年6月至2021年6月该院产科收治的50例FGR孕妇作为试验组,同期选取50例新生儿出生体重正常的孕妇作为对照组。收取两组孕妇分娩前外周血及产后胎盘组织。首先通过HE染色观察两组胎盘组织内部的病理学差异,酶联免疫吸附试验检测两组孕妇血清Gas6的表达水平;然后采用免疫组织化学(IHC)法检测两组胎盘组织中Gas6蛋白的表达情况;最后结合qPCR技术检测两组胎盘组织中Gas6 mRNA的表达。结果试验组孕妇胎盘组织内部细胞溶解,血管水肿破裂,绒毛间质纤维化及纤维蛋白样坏死,滋养层细胞肿胀,排列混乱。试验组孕妇外周血Gas6表达[(12.55±2.34)pg/mL],明显高于对照组[(9.60±2.52)pg/mL],差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,试验组胎盘组织Gas6相对表达强度和阳性表达率均明显增加。试验组胎盘组织中Gas6 mRNA的表达水平(1.41±0.23)明显高于对照组(1.03±0.04),差异有统计学意义(P<0.05)。结论通过检测孕妇Gas6可初步预测FGR的发生。

子痫前期产妇胎盘组织中生长阻滞特异性蛋白6、富集AT序列的特异性结合蛋白1的含量及其与氧化应激、炎性反应的相关性

目的探讨子痫前期产妇胎盘组织中生长阻滞特异性蛋白6 (Gas6)、富集AT序列的特异性结合蛋白1(SATB1)的含量及其与氧化应激、炎性反应的相关性,为临床诊治提供参考依据。方法收集2014年7月-2017年2月在武功县人民医院进行分娩的子痫前期产妇90例作为子痫前期组,同期在武功县人民医院进行分娩的健康产妇50例作为正常对照组。留取两组产妇的胎盘标本组织,采用Western-blot法检测其中Gas6、SATB1 mRNA的表达量;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测胎盘标本组织碾磨液中氧化应激、炎性反应指标的含量。结果子痫前期组产妇胎盘组织标本中Gas6 mRNA表达量高于正常对照组产妇,SATB1 mRNA表达量低于正常对照组产妇,差异有统计学意义(均P<0. 05);子痫前期组产妇胎盘组织碾磨液中氧化指标脂质过氧化氢(LHP)、活性氧(ROS)的含量高于正常对照组产妇,抗氧化指标谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)的含量低于正常对照组产妇,差异有统计学意义(均P<0. 05);子痫前期组产妇胎盘组织碾磨液中炎症指标高迁移率族蛋白(HMGB1)、C反应蛋白(CRP)、白介素-6 (IL-6)的含量高于正常对照组产妇,差异有统计学意义(均P<0. 05)。结论子痫前期产妇胎盘组织中Gas6、SATB1 mRNA表达量存在异常,可客观反映机体氧化应激、炎性反应程度。

去泛素化酶USP29调控CBX6蛋白质稳定性

多梳家族(polycomb group,PcG)是一类控制细胞命运和胚胎发育的转录抑制因子,主要以转录抑制复合物(polycomb repressive complex,PRC)的形式发挥功能。染色体盒蛋白质同源物6(chromobox protein homolog 6,CBX6)是PRC1的核心蛋白质亚基之一,在基因表达调控、细胞更新分化、肿瘤发生发展和干细胞干性维持等方面发挥重要的作用。本研究发现,CBX6通过泛素-蛋白酶体依赖性途径降解,接着利用包含92个去泛素化酶(deubiquitinating enzyme,DUB)基因表达文库进行筛选,发现泛素特异性蛋白酶29(ubiquitin-specific protease,USP29)能够明显地稳定CBX6的蛋白质水平并延长其半衰期(P<0.05);免疫沉淀结果发现,CBX6通过其C-端结构域与USP29发生相互作用;进一步研究发现,USP29通过去泛素化CBX6调控CBX6蛋白质稳定性,且这个过程依赖于USP29本身去泛素化酶活性。细胞增殖结果还发现,USP29能抑制MCF7细胞的增殖(P<0.0001)。综上所述,本研究通过筛选发现,USP29能够通过去泛素化CBX6来稳定CBX6蛋白质水平,且USP29能够抑制MCF7细胞增殖进程。

肌钙蛋白T与心肌损害

急性心肌梗塞的传统诊断检验方法有许多弊病,表现为左束支传导阻滞和非特异的ST段-T波异常,肌酸激酶的假阳性率高达15％,同功酶也不是一种心脏病特异性因子,并在心肌梗塞期间其浓度可短暂增加,因而限制它的诊断价值。心肌肌钙蛋白T是心肌严重缺血时释放进入血循环的唯一一种心肌抗原。Katus等研制一胂免疫试剂盒来测定心肌肌钙蛋白T,一般血清浓度通常很低,而在心肌梗塞时可明显增加。肌钙蛋白T与心肌损伤的传统血清学标记相比。

LncRNA GAS5通过miR-21调控脊髓损伤后神经细胞凋亡的机制研究

目的 明确长链非编码RNA生长阻滞特异性转录因子5(LncRNA GAS5)与微小RNA-21(miR-21)的关系,阐明LncRNA GAS5调控miR-21参与脊髓损伤后神经细胞凋亡的机制。方法 建立脊髓损伤大鼠和氧糖剥夺复氧(OGD/R)处理的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC-12)模型;沉默和过表达GAS5,构建下调shGAS5表达的慢病毒,通过生物信息学分析预测LncRNA GAS5与miR-21存在结合位点等。通过双荧光素酶报告基因实验等探究GAS5与miR-21的结合位点;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测miR-21、GAS5、同源性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog,PTEN)基因、半胱天冬氨酸蛋白酶3(Caspase 3)、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2相关X基因(Bax)、Bcl-2和蛋白激酶B(AKT)的RNA表达水平;Western blot检测Cleaved caspase 3、Bax、Bcl-2、AKT和磷酸化AKT(p-AKT)的蛋白表达水平;TUNEL技术检测神经细胞凋亡程度。结果 大鼠脊髓损伤后脊髓中miR-21、Bcl-2及pAKT表达水平降低(P<0.05),GAS5、PTEN、Bax及Cleaved caspase-3表达均升高(P<0.05)。PC-12体外培养与OGD/R损伤后出现与大鼠脊髓损伤模型类似结果,且于OGD/R处理后2 h最显著。GAS5可通过碱基互补配对方式结合miR-21,进而调控下游PTEN信号通路。下调GAS5或过表达miR-21可抑制PC-12细胞凋亡(P<0.05)。结论 GAS5通过结合miR-21,上调PTEN并抑制AKT磷酸化,进而促进脊髓损伤诱导的神经细胞凋亡。

miR-130a对大鼠脑基底动脉平滑肌细胞活力和凋亡的影响

目的:探讨微小RNA(miR)-130a对大鼠脑基底动脉平滑肌细胞(basilar arterial smooth muscle cells,BASMCs)生物学行为的影响及可能的作用机制。方法:采用real-time PCR法检测大鼠BASMCs在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作用下miR-130a的表达水平。转染miR-130a inhibitor下调BASMCs中miR-130a的表达,采用CCK-8法和流式细胞术检测BASMCs活力、细胞周期及凋亡情况;Western blot检测细胞周期及凋亡相关调控因子细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、p21、p-Rb、Bcl-2和cleaved caspase-3/caspase-3的蛋白水平。Real-time PCR及Western blot检测检测生长阻滞特异性同源盒蛋白(Gax)的表达情况。结果:AngⅡ可促进BASMCs中miR-130a的表达,而抑制Gax的表达。miR-130a inhibitor可部分抑制AngⅡ增加BASMCs细胞活力的效应,并上调Gax的表达。此外,下调miR-130a后细胞早期凋亡率显著增加(P<0.05);同时细胞中cyclin D1、CDK2、Bcl-2和p-Rb的蛋白水平均显著降低,p21及cleaved caspase-3的蛋白水平显著升高(P<0.05)。结论:沉默miR-130a可上调BASMCs中Gax的表达,进而影响细胞周期及凋亡相关因子的表达,从而抑制细胞活力,并促进其凋亡,提示miR-130a可作为高血压脑血管重构的一个潜在诊疗靶点。

腺病毒介导Gax基因对血清刺激后兔血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的:通过腺病毒介导人生长终止特异性同源异形盒基因(Gax)转染体外兔血管平滑肌细胞(VSMCs),观察人Gax基因过表达对血清刺激后兔VSMCs增殖和凋亡的影响,为Gax基因成为理想的静脉桥再狭窄基因治疗的候选基因提供实验基础。方法:Ad5-hGax重组腺病毒载体转染兔VSMCs后,采用Western blot检测不同时间细胞中hGax蛋白的表达;MTT法检测Ad5-hGax对血清刺激后兔VSMCs的体外增殖抑制情况;转染72 h后流式细胞术检测Ad5-hGax诱导血清刺激后VSMCs的凋亡率。结果:转染后1 d、3 d、5 d,Ad5-hGax组细胞中的hGax蛋白均有明显表达;MTT法检测显示hGax基因过表达能明显抑制血清刺激后兔VSMCs的增殖;流式细胞术检测显示转染72 h后,hGax过表达能显著诱导血清刺激后兔VSMCs的凋亡。结论:hGax基因过表达能有效抑制血清刺激后VSMCs的增殖,并促进其凋亡,为腺病毒介导Gax基因治疗静脉桥再狭窄提供重要的实验基础。

Gax在肺动脉高压大鼠肺动脉中的表达变化

目的:使用低氧及野百合碱(monocrotaline,MCT)诱导的两种肺动脉高压(pulmonary arterialhypertension,PAH)大鼠模型,观察生长终止特异性同源盒(growth arrest-specific homeobox,Gax)在肺动脉的表达变化。方法:Sprague Dawley大鼠随机分为四组:低氧模型组(n=16)、低氧对照组(n=16)、MCT模型组(n=16)及MCT对照组(n=16)。采用插管法测定大鼠的右心室压力及肺动脉压力。右心室质量除以左心室和室间隔质量,计算右心肥厚指数。采用定量RT-PCR法测定肺动脉主干及肺组织Gax mRNA表达;采用Western免疫印迹法测定肺动脉主干Gax蛋白表达;免疫组织化学染色观测Gax在肺内的分布及表达变化。结果:低氧模型组及MCT模型组大鼠的右心压力、肺动脉压力及右心肥厚指数均显著高于相应对照组(P<0.01),两种模型大鼠的肺动脉血管均出现明显重构。与对照组比较,Gax mRNA在两种模型组大鼠的肺组织表达降低(P<0.05),而在肺动脉主干表达升高(P<0.05)。Gax蛋白在肺内主要表达在微小动脉。与对照组比较,两种模型组大鼠的肺动脉主干和肺微小动脉Gax蛋白表达均升高(P<0.05),而肺组织Gax蛋白表达下降(P<0.05)。结论:Gax主要表达在肺微小动脉,在PAH发生时表达上调。

血浆GAS5联合免疫学指标在系统性红斑狼疮患者诊断中的应用价值

目的探讨血浆生长特异性阻滞因子5(GAS5)联合免疫学指标[血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、补体C3、C4]在系统性红斑狼疮患者诊断中的应用价值。方法选取本院2020年1月至2023年1月收治的100例系统性红斑狼疮患者作为观察组,将患者分为缓解期组42例和活动期组58例。另选取同期健康体检志愿者100例作为对照组。比较对照组与观察组、缓解期组与活动期组血浆GAS5、血清IgA、IgM、C3、C4水平;Pearson相关系数分析血浆GAS5、血清IgA、IgM、C3、C4水平与患者病情严重程度的相关性;ROC曲线分析血浆GAS5、血清IgA、IgM、C3、C4水平单独及五者联合检测诊断系统性红斑狼疮的价值。结果观察组血浆GAS5、血清C3、C4低于对照组,血清IgA、IgM高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);缓解期组血浆GAS5、血清C3、C4高于活动期组,血清IgA、IgM低于活动期组,差异有统计学意义(P<0.05);血浆GAS5、血清C3、C4与患者病情严重程度呈负相关,血清IgA、IgM与患者病情严重程度呈正相关,差异有统计学意义(r=-0.432、-0.412、-0.358、0.621、0.583,P<0.05);血浆GAS5、血清IgA、IgM、C3、C4联合检测诊断系统性红斑狼疮的AUC值高于单项检测,差异有统计学意义(Z_(GAS5~联合检测)=4.152、Z_(IgA~联合检测)=7.128、Z_(IgM~联合检测)=7.477、Z_(C3~联合检测)=6.019、Z_(C4~联合检测)=5.685,P<0.05)。结论血浆GAS5联合免疫学指标是鉴别诊断系统性红斑狼疮的有效方式,可判断疾病病情进展。

Gas6在胎盘或蜕膜组织中的表达及其与子痫的相关性

目的探讨胎盘或蜕膜组织中生长阻滞特异性蛋白6(Gas6)的表达水平及其与子痫前期的相关性。方法选取2012年6月至2015年4月本院妇产科收治的42例重度子痫前期剖宫产分娩孕妇作为子痫组,42例同期正常晚期妊娠剖宫产孕妇作为对照组,采用免疫组化法分别检测两组受检者胎盘、蜕膜组织中的Gas6蛋白表达水平,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测胎盘组织Gas6 m RNA的表达,并分析Gas6 m RNA与重度子痫前期患者相关指标的关系。结果子痫组患者的收缩压、舒张压和血肌酐(Scr)分别为(163.2±16.4)mm Hg、(101.4±9.5)mm Hg、(60.4±13.2)μmol/L,均明显高于对照组的(119.5±8.3)mm Hg、(71.6±8.3)mm Hg和(41.0±11.9)μmol/L,差异均有统计学意义(P<0.05);子痫组患者的白蛋白(30.4±3.9)g/L、血小板(167.3±54.1)×109/L水平显著的低于对照组的白蛋白(35.1±4.2)g/L、血小板(256.0±83.7)×109/L,差异有统计学意义(P<0.05);子痫组患者胎盘、蜕膜组织中Gas6蛋白的表达强度均显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);子痫组患者胎盘组织中Gas6 m RNA的表达水平(0.61±0.23)显著高于对照组的(0.34±0.18),差异有统计学意义(P<0.05);子痫组患者胎盘组织中Gas6 m RNA的表达水平与患者的收缩压、舒张压、Scr呈显著的正相关(r=0.417、0.382、0.405,P<0.05);子痫组患者胎盘组织中Gas6 m RNA的表达水平与白蛋白、血小板水平呈显著的负相关(r=-0.326、-0.314,P<0.05)。结论子痫前期患者胎盘或蜕膜组织中Gas6高表达,并且与子痫发病有关。

医学遗传学

9804286 HBsAG 结合蛋白 endonexinⅡ的种族特异性/Bruin W//J Hepatol.-1996,24(3).-265～270 3029804287 视黄酸效应元素作为同源异形盒 b-1基因表达的阳性和阴性调节基因//Nutr Rev.-1996,542(Part 1),-61～63