基于代谢组学技术的田黄方配伍机制分析

【目的】观察田黄方不同组方对血脂及代谢产物的影响,揭示其治疗高脂血症的组方机制。【方法】取雄性SD大鼠30只,分为正常组、模型组、三七组、黄连组及田黄组。采用高脂乳剂灌胃法复制高脂血症大鼠模型并给予相应药物治疗,采集治疗4周后的血液,采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用(UPLC/Q-TOF MS)技术建立大鼠血清的代谢物指纹图谱。应用主成分分析和偏最小二乘判别分析模型组和田黄组、三七组、黄连组之间的代谢物谱差异,并通过变量重要性投影(VIP)选取生物标志物,比较各组的标志物并找出差异。【结果】田黄方对饮食性高脂血症大鼠模型的干预作用主要体现在对脂肪代谢、氨基酸代谢、炎症和氧化应激的调节作用,而三七、黄连虽能一定程度改善模型组大鼠的代谢紊乱状态,但未能从根本上恢复。【结论】田黄方对高脂血症动物模型血脂及代谢产物的调节作用优于三七、黄连单用,其中三七以调节氨基酸代谢、能量代谢为主,黄连以调节炎症、氧化应激及能量代谢为主,田黄方对上述代谢紊乱均有调节作用。

田黄方对高脂饮食诱导小鼠肾脏损伤的改善作用及机制研究

目的探究田黄方(THF)对高脂饮食诱导C57BL/6J小鼠肾脏损伤的改善作用及机制。方法将SPF级的C57BL/6J雄性小鼠分为正常组、模型组、田黄方组,高脂饮食诱导5个月及给药干预6周;采用H&E染色观察小鼠肾脏组织病理情况;生化检测试剂盒检测肾脏匀浆脂代谢和氧化应激状态指标:乳酸脱氢酶(LDH)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平;末端标记法(TUNEL)染色检测小鼠肾脏组织细胞凋亡情况;免疫组化法检测小鼠肾脏组织中凋亡蛋白Cleaved caspase-3的原位表达情况;采用蛋白免疫印迹法(WB)法检测PI3K、p-AKT、Bax、Cleaved caspase-3和Bcl-2蛋白的表达水平。结果与正常组相比,模型组小鼠肾脏病理可见肾小球体积增大及球囊黏连,肾脏TC、TG、LDL-C、LDH和MDA水平显著升高,SOD水平显著降低,凋亡蛋白Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达亦显著增加,抗凋亡通路蛋白PI3K、pAKT、Bcl2和Bcl2/Bax表达显著减少。与模型组相比,THF组可有效改善肾脏病理损伤,并显著抑制高脂诱导的凋亡信号通路的激活。结论THF能够有效改善高脂诱导的小鼠肾损伤,其机制可能与调节PI3K/AKT信号通路、抑制细胞凋亡、改善机体氧化应激及脂质代谢紊乱有关。

基于肠道菌群-TβMCA-FXR轴探讨田黄方对老年脂代谢紊乱小鼠作用机制

目的:从肠道菌群角度探讨中药复方田黄方改善老年高脂血症小鼠脂代谢紊乱的作用机制。方法:3 w~4 w龄雄性C57BL/6J小鼠正常饮食喂养至12月成自然衰老小鼠,喂饲高脂饮食14 w构建老年高脂血症模型,给予田黄方提取物100 mg/kg干预10 w,正常对照组予普通饲料喂养至试验结束。试剂盒检测小鼠血清和肝脏总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)含量、胆盐水解酶(BSH)活力,靶向代谢组学联合16S rDNA测序分析胆汁酸代谢谱以及肠道菌群结构,Western Blot、PCR法检测法尼醇X受体(FXR)、蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP1)、胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)、成纤维生长因子15(FGF15)的mRNA和蛋白表达情况。结果:与模型对照组相比,田黄方提取物100 mg/kg组小鼠肝脏TC、TG含量显著下降(P<0.01),肠道菌群发生重塑,大肠埃希菌属(Escherichia)、阿克曼菌属(Akkermansia)、拟杆菌属(Bacteroides)丰度明显减少(P<0.05或P<0.01)、BSH酶活力下降(P<0.01),肠道中游离胆汁酸脱氧胆酸(DCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)和石胆酸(LCA)含量降低(P<0.01);与模型对照组相比,牛磺-β-鼠胆酸(TβMCA)20 mg/kg组小鼠血清及肝脏TC、TG含量显著下降(P<0.01),回肠和肝脏Fxr、Fgf15 mRNA和蛋白表达下调(P<0.05),Cyp7a1 mRNA和蛋白表达上调(P<0.05)。结论:田黄方通过调节肠道菌群,抑制BSH活性,使TβMCA水平增加进而抑制肠道FXR、FGF15表达,同时下调肝脏FXR和SHP表达,上调CYP7A1表达,导致胆汁酸合成增加,TC降低。田黄方通过肠道菌群-TβMCA-FXR轴发挥降脂作用。

田黄方对高尿酸血症小鼠肾损伤及纤维化的作用

目的:观察田黄方对高尿酸血症肾病(HN)小鼠肾损伤的保护作用,并通过网络药理学探讨其可能的作用机制。方法:将所有小鼠随机分为5组,正常组、模型组、非布司他组、田黄方低、高剂量组。正常组小鼠每日灌胃0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na),其余组小鼠灌胃500 mg·kg^(-1)次黄嘌呤和腹腔注射200 mg·kg^(-1)氧嗪酸钾诱导HN模型,非布司他组小鼠每日灌胃5 mg·kg^(-1)非布司他,田黄方组小鼠每日灌胃60 mg·kg^(-1)和120 mg·kg^(-1)田黄方,连续给药3周。检测小鼠血清尿酸、肌酐、尿素氮水平和24 h尿蛋白含量;采用苏木素-伊红(HE)染色和过碘酸雪夫(PAS)染色观察肾脏损伤程度,采用天狼猩红染色观察肾脏纤维化情况;通过蛋白免疫印迹法(Western blot)、网络药理学及分子对接研究田黄方在HN小鼠中的作用及其分子机制。结果:生化结果提示,与模型组比较,田黄方低剂量组BUN和24 h尿蛋白水平明显降低(P<0.05),SUA、SCr水平显著降低(P<0.01),田黄方高剂量组,SUA、BUN、SCr和24 h尿蛋白水平显著降低(P<0.01);病理染色结果表明田黄方各剂量组对肾脏损伤和间质纤维化有不同程度改善作用(P<0.05);Western blot结果表明田黄方高剂量组能够使NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎性小体、白细胞介素-1β(IL-1β)、纤维黏连蛋白(FN)、及尿酸转运蛋白1(URAT1)、磷酸化p65(p-p65)和磷酸化核转录因子(NF)-κB抑制蛋白α(p-IκBα)的表达降低到正常水平(P<0.01),而田黄方低剂量组不影响HN小鼠IL-1β、URAT1和p-IκBα的蛋白表达。结论:田黄方通过抑制NF-κB和NLRP3炎性小体激活改善肾脏炎症和纤维化减轻HN。

田黄方降脂作用配伍机制的尿液代谢组学研究

目的:在前期研究发现田黄方合用比单用三七、黄连对高脂血症大鼠模型血脂调节作用更优的基础上,进一步采用代谢组学技术比较其合用及单用对饮食性高脂血症大鼠尿液代谢产物的差异,揭示其治疗高脂血症的配伍机制。方法:取雄性SD大鼠30只,分为空白组、模型组、黄连组(3g/kg)、三七组(3g/kg)、田黄方组(3g/kg),采用高脂乳剂灌胃法复制高脂血症大鼠模型并给予相应药物治疗,给药30天后,采集24 h尿样用于代谢组学的分析。尿液样品UPLC-TOF/MS检测分析,质谱数据采MarkerLynx XS软件统计分析,并采用主成分分析法(PCA)和偏最小二乘-判别分析法(PLS-DA)对获得的数据进行处理。结果:在得分图中,各给药组与模型组显著分离;黄连组与三七组较接近,处于模型组和正常组之间;田黄方组和正常组较接近。同时三七、黄连、田黄方分别对8、10、15个生物标志物具有干预作用,综合评价各给药组对高脂血症大鼠代谢和生物标志物的干预作用,结果田黄方全方作用最好,黄连次之,三七最弱。结论:田黄方(3g/kg)对饮食性高脂血症大鼠模型的干预作用主要体现在对脂肪代谢、氨基酸代谢、炎症和氧化应激的调节作用,而三七、黄连虽能一定程度的改善模型组大鼠的代谢紊乱状态,但未能从根本上恢复,说明田黄方组合的合理性。

田黄方抑制ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化作用及机制研究

目的基于1-磷酸鞘氨醇(S1P)/1型1-磷酸鞘氨醇受体(S1PR1)通路探讨田黄方抑制ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化的作用及相关机制。方法将40只ApoE^(-/-)小鼠随机分为模型组、田黄方低剂量组(1.5 g/kg)、田黄方高剂量组(4.5 g/kg)和阿托伐他汀组(10 mg/kg),每组10只,另选具有相同遗传背景的同龄野生型C57BL/6J小鼠10只为对照组。模型组与药物干预组均给予高脂饲料喂养8周,对照组给予普通饲料喂养。干预组每日灌胃相应药物,对照组与模型组给予等量生理盐水灌胃。12周后,取小鼠血清,分离主动脉,保存于-80℃冰箱。全自动生化分析仪检测血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C水平,高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS/MS)检测血清中S1P含量;油红O染色法观察主动脉组织形态学变化;RT-PCR法检测肝脏与胆固醇逆转运相关蛋白CD36、ABCA1、SR-BI、LXRa和S1PR1 mRNA表达情况。结果模型组主动脉管腔内及主动脉根部可见较大的AS斑块形成,与模型组比较,干预组主动脉管腔内及主动脉根部的AS斑块面积显著减小(P<0.05)。与对照组比较,模型组小鼠血清中TG、TC、LDL-C水平及CD36 mRNA表达升高(P<0.01),HDL-C、S1P水平及ABCA1、SR-BI、LXRa和S1PR1 mRNA表达降低(P<0.01)。与模型组比较,各给药组TG、TC、LDL-C水平及CD36 mRNA表达降低(P<0.05,P<0.01),HDL-C水平及ABCA1、SR-BI、LXRa mRNA表达升高(P<0.05,P<0.01)。结论田黄方具有调节血脂和抗AS的作用,其机制可能与其调控S1P-S1PR1通路介导胆固醇逆转运有关。