藏方甲嘎松汤挥发油体外抗氧化活性的谱效关系研究

目的对藏方甲嘎松汤挥发油指纹图谱的特征峰与体外抗氧化活性进行谱效相关性研究,为其药效评价和合理应用提供初步实验依据。方法通过气相色谱质谱联用技术建立甲嘎松汤挥发油的指纹图谱,采用DPPH和ABTS+自由基清除方法探讨甲嘎松汤挥发油体外抗氧化作用,通过皮尔逊相关分析、灰关联度分析对特征峰与药效进行谱效学分析。结果依据谱效相关性大小,确定单个抗氧化作用成分贡献的大小顺序依次为对聚伞花烯、(-)-4-松油醇、桉油精、α-雪松烯、α-姜烯、1R-α-蒎烯、α-松油醇、石竹烯、榄香素、肉豆蔻醚、β-水芹烯、α-蒎烯。结论该研究确定了甲嘎松汤挥发油指纹特征峰抗氧化药效的大小,为甲嘎松汤药用物质基础研究,药效评价及质量标准制定提供参考。

甲嘎松汤挥发性成分GC-MS分析

目的:研究藏方甲嘎松汤挥发性化学成分。方法:采用水蒸气蒸馏法分别提取甲嘎松汤的单味药挥发油及其单味药材组成的复方总挥发油,采用气相色谱-质谱联用技术对挥发油分别进行研究,应用峰面积归一法测定各组分的相对含量。结果:单方药中干姜共检出103个成分,鉴定出87个化合物,肉豆蔻共检出58个成分,鉴定出38个化合物,白豆蔻共检出49个成分,鉴定出38个化合物,复方总挥发油中共检出89个成分,鉴定出63个化合物。结论:桉油精、β-水芹烯和其他萜类为甲嘎松汤挥发性化学成分的特征性指标;其挥发性成分和含量的变化可为甲嘎松汤配伍的科学性和合理性提供证据。

甲嘎松汤对急性肝损伤小鼠肠道菌群及细胞因子的影响

目的:研究甲嘎松汤对急性肝损伤小鼠的肠道菌群和细胞因子的影响。方法:甲嘎松汤预防给药7 d后,采用四氯化碳制备小鼠急性肝损伤模型。测定肝功能指标;菌落计数法检测盲肠内容物中大肠杆菌、粪肠球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌数量,计算B/E值;ELISA法测定血清和肝组织中细胞因子的水平。结果:甲嘎松汤高剂量组ALT水平明显低于模型对照组,甲嘎松汤中剂量组AST水平明显低于模型对照组;甲嘎松汤高剂量组肠道中大肠杆菌数量显著低于模型对照组,甲嘎松汤低、中剂量组肠道中双歧杆菌数量显著高于模型对照组;甲嘎松汤低、中、高剂量组B/E值均显著高于模型对照组;甲嘎松汤低、中、高剂量组IL-6、IFN-γ、TGF-β1水平均明显低于模型对照组,IL-10水平明显高于模型对照组。结论:甲嘎松汤可改善急性肝损伤小鼠肠道菌群失调状态,调节细胞因子的水平,对急性肝损伤小鼠具有保肝作用。

气质联用-模式识别对甲嘎松汤质量控制的方法研究

目的:建立藏方甲嘎松汤的质量评价方法。方法:通过水蒸气蒸馏法提取甲嘎松汤挥发油样品,采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对挥发油进行分析,并转化成数据矩阵,采用主成分分析以及系统聚类分析进行化学模式识别研究。结果:经聚类分析可将16批甲嘎松汤挥发油样品分为2大类,经主成分分析可将甲嘎松汤综合为3个主成分,可分为2大类;2种模式识别方法对不同甲嘎松汤挥发油样品能准确识别,且其识别结果一致。结论:气质联用-模式识别是一种科学、准确、有效的甲嘎松汤质量控制和评价方法。

甲嘎松汤防治慢性乙型肝炎临床研究

目的:观察甲嘎松汤治疗慢性乙型肝炎(CHB)的临床疗效及安全性,并初步探讨甲嘎松汤治疗慢性乙型肝炎的作用机理。方法:选取60例符合纳入标准的CHB患者作为研究对象,按随机对照原则分为治疗组和对照组各30例,治疗组患者采用中药甲嘎松汤治疗,对照组患者采用拉米夫定治疗。观察比较两组患者治疗前后临床症状、体征积分的变化及相关实验室检查结果。结果:两组患者的临床症状及肝功能均明显改善,血清中HA、LN、IVC含量减少,HBeAg、HBV-DNA指标得到改善,且甲嘎松汤改善作用及治疗总有效率均优于拉米夫定,差异具有统计学意义(P<0.05);治疗后,甲嘎松汤治疗组患者总有效率为83.3%,明显高于拉米夫定对照组的70.0%,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:甲嘎松汤可改善慢性乙型肝炎患者的临床症状,提高其生活质量,抗肝纤维化,延缓病程,作为治疗慢性乙型肝炎的有效方剂,值得临床推广应用。

甲嘎松汤对藏医寒性肝病动物模型肠肝轴的调控机制研究

建立藏医寒性肝病模型,探讨藏方甲嘎松汤对寒性肝病动物模型肠肝轴损伤的改善作用以及调控机制,采用隔日皮下注射α-萘异硫氰酸酯(ANIT)造模14天诱导实验动物胆汁淤积慢性黄疸,同时每日灌胃番泻叶汤剂,建立寒性肝病模型.给予甲嘎松汤治疗后,检测血清中ALT、AST、AKP、TBA,观察肝脏和肠道的病理损伤,PCR检测肝脏和肠道胆汁酸受体及转运蛋白FXR、NTCP、MRP2,纤维化相关因子MMP2、MMP13和TIMP1,抗氧化酶NQO1和HO-1,抗炎因子IL-10的转录水平,免疫荧光共定位检测P-Smad2/3和紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的阳性表达,检测肠匀浆中GSH、MDA和GSSG,Elisa检测促炎因子IL-1β,HPLC-MS检测血清中25种主要胆汁酸成分的改变.结果显示,与正常组相比,寒性肝病模型中血清ALT、AST、AKP、TBA升高,肝脏胆管增生,肠绒毛断裂,ZO-1和Occludin表达减少,IL-10下降,IL-1β升高,GSH下降,MDA升高,GSSG显著升高,血清中毒性胆汁酸成分TCA、TLCA、TβMCA增多.与慢性黄疸模型组相比,寒性肝病模型组肝脏中出现更严重的炎性浸润、胆管增生和胶原沉积,P-Smad2/3入核增多,肠道中GSSG显著升高,GSH/GSSG显著下降.对于寒性肝病模型,甲嘎松汤能改善肝脏胆管增生,降低血清ALT、AST、AKP、TBA,改善肠道病理损伤,增加肝脏FXR、MRP2、NTCP的表达,增加肠道ZO-1、Occludin表达,上调肠道GSH、NQO1、HO-1、GSH/GSSG,下调GSSG;升高IL-10的转录,降低IL-1β转录;增加肠FXR的转录,血清中毒性胆汁酸的含量降低.本研究在慢性黄疸的模型基础上灌胃给予番泻叶汤剂,初步建立了寒性肝病的动物模型.甲嘎松汤能改善寒性肝病模型的肠肝轴损伤,表现为减轻寒性肝病模型造成的胆汁淤积肝脏损伤,改善肠道屏障损伤及氧化炎症损伤,降低血清中毒性胆汁酸含量.

甲嘎松汤调控Nrf2,Bach1表达保护氧化应激肝细胞

目的:研究甲嘎松汤对氧化应激损伤L-02的影响,并从Nrf2/Bach1-ARE抗氧化酶途径研究其抗氧化的机制。方法:MTT法评价建立葡萄糖氧化酶肝损伤细胞模型的方法。实验共分9组,分别为空白组,模型组,20%甲嘎松汤含药血清组,5μmol·L-1全反式视黄酸(ATRA)组,80μmol·L-1染料木黄铜(Genstein)组,80μmol·L-1叔丁基对苯二酚(t-BHQ)组,t-BHQ+20%甲嘎松汤含药血清组,ATRA+20%甲嘎松汤含药血清组,Genstein+20%甲嘎松汤含药血清组,以正常培养液或含t-BHQ,ATRA,Genistein的培养液干预L-02细胞12 h,再用20%甲嘎松汤含药血清培养液预保护12 h,最后采用100 U·L-1葡萄糖氧化酶制备氧化损伤模型。MTT法测定细胞活性,测定培养上清的丙氨酸氨基转移酶(ALT),天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性,丙二醛(MDA)含量,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,利用免疫荧光法和Western blot法观察细胞内核因子相关因子(Nrf2)和转录因子BTB-CNC异体同源体(Bach1)的分布及核内两者的表达量。结果:与空白组比较,模型组ALT,AST活性及MDA含量明显升高,GSH-Px活性明显降低(P<0.01),细胞核内Nrf2及Bach1的表达明显升高(P<0.01);与模型组比较,甲嘎松汤能升高氧化损伤以及3种干预剂下的细胞活性和GSH-Px活性,降低ALT,AST活性及MDA含量(P<0.05,P<0.01);可协同t-BHQ升高核内Nrf2表达,抑制ATRA降低核内Nrf2表达,抑制Genistein升高核内Nrf2表达,均具有统计学差异(P<0.01);在3种干预剂作用下,甲嘎松汤可促进Bach1出核(P<0.01)。结论:甲嘎松汤可保护葡萄糖氧化酶诱导氧化应激损伤肝细胞,其抗氧化保肝作用与调节Nrf2与Bach1表位位置以及核内蛋白水平有关。

甲嘎松汤对肝损伤的保护作用研究

目的:研究藏药甲嘎松汤对整体动物急慢性肝损伤模型及体外L02细胞氧化应激损伤模型的保护作用,并进行初步机制研究。方法:制备5种小鼠急性肝损伤模型、1种大鼠慢性肝损伤模型,观察甲嘎松汤对动物血清AST、ALT活性及四氯化碳致小鼠急性肝损伤的肝组织中CAT、GSH活性;采用RT-PCR技术,测定慢性酒精性肝损伤肝脏缺氧诱导因子-1 mRNA的表达。先给予Nrf2激活剂t-BHQ干预12h,再给予甲嘎松汤的含药血清作用12h后,利用终浓度为100mU/ml的葡萄糖氧化酶(Glucose Oxi-dase,GO)诱导人肝细胞L02氧化应激损伤模型,检测细胞培养上清液中AST、ALT活性;四甲基氮唑(MTT)比色法检测细胞活力。结果:在6种肝损伤动物中均可见甲嘎松汤在0.66g/kg剂量下的AST、ALT活性比模型组显著降低;显著升高四氯化碳引起的小鼠急性肝损伤模型中抗氧化酶CAT、抗氧化剂GSH活性;在一定程度上降低模型组HIF-1α因子mRNA表达,但与模型组比较无统计学差异。在细胞模型中,20%甲嘎松汤含药血清组与t-BHQ组均能于不同时间点显著升高细胞活力;显著降低AST,ALT活性;与t-BHQ组比较,20%甲嘎松汤含药血清+t-BHQ组于不同时间点上述指标有明显改善,并且对单用t-BHQ作用8小时后表现出的肝细胞活力降低有改善作用。结论:甲嘎松汤有一定的保肝作用,与Nrf2激活剂t-BHQ有协同效应,能纠正Nrf2持续激活导致的细胞损伤,说明甲嘎松汤保肝作用可能与维持Nrf2在细胞内的动态平衡有关。

甲嘎松汤提取工艺的正交设计法优选

目的建立同时测定甲嘎松汤中两种成分含量的高效液相色谱法,采用正交设计法优选甲嘎松汤中有效成分的提取工艺。方法以6-姜辣素和去氢二异丁香酚的总含量为指标,采用正交实验,对提取时间、乙醇体积分数及乙醇用量进行考察,优化提取条件。结果最佳提取工艺条件为加30倍90%的乙醇,超声30 min。结论该提取工艺合理,有效成分提取效率较高。

甲嘎松汤HPLC特征指纹图谱

目的:建立甲嘎松汤的HPLC特征指纹图谱。方法:选择6-姜辣素和去氢二异丁香酚为对照成分,采用HPLC测定,色谱条件为Platisil ODS色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相乙腈-甲醇-0.3%磷酸水梯度洗脱,检测波长274 nm,柱温25℃,流速1.0 mL·min-1,进样量10μL。利用"中药色谱指纹图谱相似度评价系统"2004年A版分析10批甲嘎松汤样品的HPLC指纹图谱。结果:共获得15个共有峰,指认了其中2个共有峰分别为6-姜辣素和去氢二异丁香酚。10批样品的指纹图谱相似度均>0.9,表明相关性较好,所含化学成分基本一致。结论:该法操作简便、灵敏度高、准确可靠,为甲嘎松汤的质量评价提供科学依据。