2022—2023年北京市通州区甲型H3N2亚型流感病毒血凝素基因特征分析

目的分析2022—2023年北京市通州区流感病原学监测中甲型H3N2亚型流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)基因特性,为流感防控提供科学依据。方法对通州区2022—2023年流感病原学监测结果进行统计分析,选取不同时间分离到的34株甲型H3N2亚型流感毒株,进行HA基因扩增和测序,应用MEGA11进行HA基因的核苷酸和氨基酸变异分析,采用邻接法构建HA基因遗传进化树,在线预测N-糖基化位点,分析其基因变异和进化特征。结果2022—2023年共检测流感病原学监测样本3660件,流感病毒核酸阳性率为21.50%,其中甲型H3N2亚型流感病毒占比为57.81%。发热疫情样本共计4855件,流感病毒核酸阳性率为54.25%,其中甲型H3N2亚型流感病毒占比为61.50%。34株甲型H3N2亚型流感病毒的HA基因序列与疫苗株A/Darwin/9/2021相比,核苷酸相似度为97.00%~98.50%,氨基酸相似度为97.40%~98.10%。基因进化分析显示,2022—2023均分布在3c.2a1b.2a分支,2022年8—11月分离的14株毒株分布在1a.1亚分支,2023年2—3月分离的20株毒株则分布在2a.3a.1亚分支。与疫苗株相比,2022—2023年的34株毒株在4个抗原决定簇上(B、C、D和E)发生了多位点氨基酸变异,且在186和225位点上均发生了替换。2022年的14株毒株,增加了158NYTY位点,存在13个潜在糖基化位点,2023年的20株分离株122NESF糖基化位点丢失,共有12个潜在糖基化位点存在。结论2022—2023年,北京市通州区人群中流行的甲型H3N2亚型流感病毒分布在2个进化分支上,2023年3C.2a1b.2a.2a.3a.1分支取代了2022年3C.2a1b.2a.1a.1分支,成为流行株。及时分析流感病毒基因特性和进化趋势,对流感的防控有重要意义。

甲3型流感病毒M2基因在痘苗病毒天坛株中的表达

为获得表达甲3型流感病毒(H3N2)M2蛋白的重组天坛株痘苗病毒RVJ1175M2,使用PCR方法扩增流感病毒全长M2基因,将其克隆到天坛株痘苗病毒同源重组质粒pJSC1175中,获得重组质粒pJSC1175M2,通过与痘苗病毒载体同源重组,构建了含流感病毒M2基因的重组痘苗病毒株RVJ1175M2。PCR检测结果证明,流感病毒(H3N2)M2蛋白基因准确插入到天坛株痘苗病毒TK区;Western blot、免疫荧光和流式细胞计数表明重组病毒RVJ1175M2可以有效地表达M2蛋白,表达的M2蛋白有两条带,分别为15kD和13kD,与相关文献报道一致;M2蛋白可有效分布在感染细胞的细胞膜上。这些结果表明重组痘苗病毒株RVJ1175M2可以有效地表达流感病毒M2蛋白,为使用表达M2蛋白的不同类型疫苗进行广谱流感疫苗效果的比较研究奠定了基础。

甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及序列分析

目的构建含有甲型流感病毒M2基因的真核表达载体并分析插入的M2基因序列。方法从接种人流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,用特异引物进行RT-PCR,扩增M2基因。通过分子克隆技术将所扩增片段克隆入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)。经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的M2基因序列进行分析。结果经双酶切、PCR及测序鉴定证实M2基因的真核表达载体构建成功。序列分析有4个氨基酸出现变异,提交Genbank进行Blast比对显示同源性97%(Genbank/NCBI AY768951)。结论M2四聚体蛋白具有H+通道功能,能够协助病毒与宿主细胞膜融合后释放RNP复合体,还能稳定HA蛋白的结构。M2蛋白的高度保守性和具有交叉保护能力特性使之成为新型的通用流感疫苗的突破口。该结果将为甲型流感病毒基因工程疫苗,通用疫苗和核酸疫苗的研究打下基础。

甲型流感病毒M2e与CtB基因融合表达及其免疫特性初步研究

目的:构建真核表达重组质粒pcDNA 3.1a(+)-M2e/CtB,并初步研究其在NIH3T3细胞中的表达特性及免疫特性。方法:重叠PCR法扩增甲型流感病毒M2e基因和霍乱毒素CtB基因,将扩增得到的融合基因片段M2e-CtB定向克隆入真核表达载体pcDNA 3.1a(+)中,再转化E.coli JM109。将酶切鉴定、PCR扩增及序列鉴定正确的重组质粒命名为pcDNA3.1a(+)-M2e/CtB。用KEGEN TRANSⅢ阳离子聚合物将重组质粒pcDNA 3.1a(+)-M2e/CtB转染NIH3T3细胞,经免疫荧光、RT-PCR产物序列分析、Western blot检测其稳定表达产物。结果:重组质粒pcDNA 3.1a(+)-M2e/CtB含完整的M2e和CtB基因,与相对应基因的序列同源性分别为100%。重组质粒转染NIH3T3细胞后获得了有效表达,并且稳筛株细胞裂解物和上清均能用抗霍乱毒素抗体和抗流感病毒抗体检测到Mr约18000的蛋白条带。结论:成功构建了真核表达重组质粒pcDNA 3.1a(+)-M2e/CtB,初步证明其在体外表达的重组蛋白可分泌至胞外,且有M2e和CTB的双特异反应原性和免疫原性,为流感病毒核酸疫苗的进一步研究奠定了坚实基础。

小鼠β-防御素6与甲型流感病毒M2e基因融合表达及其免疫特性研究

目的构建小鼠β-防御素6(mBD6)与甲型流感病毒M2蛋白胞外功能区(M2e)真核表达质粒,并研究其在真核细胞中的表达与免疫特性。方法通过重叠延伸PCR法(overlap-PCR)将M2e与mBD6通过一段多肽接头Gly4Ser融合成为mBD6-M2e。将其插入载体pcDNA3.1(+),构建成pcDNA3.1(+)/mBD6-M2e。鉴定正确后,转染MDCK细胞,免疫荧光、MTT检测mBD6-M2e表达和分泌。免疫小鼠,半定量PCR检测脾细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α、CCR7表达。结果融合基因mBD6-M2e真核表达载体pcDNA3.1(+)/mBD6-M2e构建成功,在MDCK细胞膜上成功表达融和蛋白,转染细胞的培养上清刺激淋巴细胞增殖。免疫小鼠细胞因子表达改变。结论融合基因mBD6-M2e真核表达载体成功构建,为研究防御素在流感病毒核酸疫苗中的佐剂作用奠定了基础。

甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及初步表达

目的:构建含有甲型流感病毒M2基因的真核表达载体。体外转染真核细胞株HEK293细胞并检测目的蛋白的表达。方法:从接种人流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,用特异引物进行RT-PCR,扩增M2基因。通过分子克隆技术将所扩增片段插入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)。经酶切及PCR鉴定后用PolyFect脂质体将其转染到HEK293细胞中,通过免疫荧光技术鉴定其表达。结果:经双酶切、PCR及测序鉴定证实M2基因的真核表达载体构建成功。免疫荧光技术证实流感病毒M2基因的表达。结论:甲型流感病毒M2蛋白是一种具有高保守性,可形成离子通道并影响流感病毒表面蛋白血凝素(HA)天然构象的形成,被认为是具有交叉免疫保护性的结构蛋白。甲型流感病毒M2基因真核表达质粒的构建及成功表达将为甲型流感病毒基因工程疫苗,通用疫苗和核酸疫苗的研究打下基础。

A型禽流感病毒不同拷贝数基质蛋白胞外区基因的原核表达及免疫保护力研究

为研究含禽流感病毒(AIV)不同拷贝数基质蛋白胞外功能区(M2e)亚单位疫苗在SPF鸡体中的免疫保护效力差异,根据已发表的高致病性AIV M2基因序列设计合成两对引物,利用PCR技术扩增单个M2e基因片段,以此为基础顺次串联得到不同拷贝数的M2e基因片段,并将其克隆到pMAL-C2x载体中,构建不同拷贝数的A型AIV M2e基因的重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定。表达产物经纯化后免疫家兔、SPF鸡,制备抗M2e融合蛋白的多克隆抗体。Western blot和间接免疫荧光试验检测纯化的融合蛋白免疫原性,间接ELISA测定鸡血清抗体水平,表明MBP-3M2e融合蛋白的抗体水平较高,且MBP-3M2e亚单位疫苗产生最好的免疫保护力。

2009年新型甲型H1N1流感病毒基质蛋白及核蛋白基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲型流感病毒(A/H1N1)基质蛋白(M)及核蛋白(NP)基因的进化规律。方法:从NCBI数据库下载147条甲型H1N1流感病毒M基因及NP基因序列,采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0(MEGA4.0)软件对M基因和NP基因序列进行比对,并用NJ法构建进化树,同时采用EpiInfo软件分析1918～2009年人H1N1病毒的M基因和NP基因序列进化距离的线性趋势。采用MEGA4.0软件对M2蛋白氨基酸序列进行比对。结果:不同地区的2009年新型甲型H1N1流感病毒M基因、NP基因同源性高,但与历史上流行的H1N1流感病毒M基因、NP基因差异较大,且M基因进化距离随分离年限变化的趋势性检验结果有统计学意义(Ptrend=0.001)。2009年新型甲型A/H1N1流感病毒M2蛋白与1918～2008年人A/H1N1病毒M2蛋白氨基酸序列进行比对,结果显示在第11、43、54、57、77、78氨基酸位点发生了改变;与猪、禽A/H1N1的M2蛋白氨基酸序列进行比对,结果显示仅在第43、77位氨基酸位点发生改变。结论:2009年新型甲型A/H1N1流感病毒NP基因片段较以往流行的人H1N1流感病毒NP基因发生了改变;M2蛋白位于胞外编码区的第11位氨基酸、位于TM结构域的第43位氨基酸突变可能导致了新型甲型A/H1N1流感病毒对金刚烷胺类特异性抗病毒药物产生耐药。

2015年盐城市甲型H3N2亚型流感病毒HA1基因分子进化特征分析

目的了解盐城市2015年甲型H3N2流感病毒分离株表面血凝素HA1基因分子进化特征。方法对哨点医院流感样病例标本进行核酸检测、病毒分离;选取甲型H3N2毒株,采用一步法RT-PCR扩增其HA1区,并进行序列分析,采用DNAStar软件包中MegAlign进行核苷酸及氨基酸同源性分析,以MEGA6.0软件进行序列比对及基因种系进化特征分析。结果 2015年盐城市流感样病例(ILI)监测样本中流感病毒核酸阳性率为8.36%,乙型、甲型H3N2、新甲H1N1型交替流行。抽取的7株甲型H3N2分离株,其HA1基因核苷酸同源性为98.7%~100.0%,氨基酸同源性为97.9%~100.0%;其HA1区氨基酸位点变异呈散在性分布,均未发生氨基酸的丢失和插入,氨基酸突变主要位于抗原决定簇的A、B和C区。除A/JSYC/11025/2015外,其余6株新增2个糖基化位点,其中158aa位点位于抗原决定簇B区。结论 2015年盐城市流感流行以甲型H3N2和乙型Yamagata系为主,具有典型的冬、夏双高峰特点。病毒HA1区基因特性逐渐发生变异,可能导致抗原变化,应进一步加强流感病原学监测。

甲型流感病毒M2e与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的将甲型流感病毒M2蛋白胞外区(M2e)基因与人血清白蛋白(HSA)基因融合,以构建高效分泌表达的毕赤酵母菌株。方法通过RT-PCR扩增HSA基因,构建pPICZα-HSA质粒,将人工合成的M2e序列与pPICZα-HSA质粒分别经BstBI和KpnI酶切消化后连接,构建真核表达载体pPICZα-HSA/M2e,线性化后电转化毕赤酵母X-33。用PCR法筛选Zeocin抗性阳性的克隆,SDS-PAGE和Western印迹法筛选高表达HSA/M2e菌株。结果经RT-PCR法克隆的HSA基因序列与GenBank登录的cDNA序列一致,构建的pPICZα-HSA/M2e真核表达载体,经电转化获得Zeocin抗性阳性的克隆。SDS-PAGE和Western印迹分析证实了甲醇诱导的培养基上清中含有HSA/M2e,分子量约为68kD。结论成功构建了分泌表达重组HSA/M2e融合蛋白的毕赤酵母菌株,为进一步研究其生物学活性奠定了基础。

吉林省2018-2020年甲型H3N2亚型流感病毒耐药基因分析

目的掌握2018-2020年吉林省内H3N2亚型流感流行株对金刚烷胺类药物以及神经氨酸酶抑制剂类药物的耐药情况,为流感的临床治疗及预防控制提供参考依据。方法选取甲型H3N2亚型流感毒株34株,对M2和NA基因进行PCR扩增,测序后对耐药位点进行分析。结果2018-2020年吉林省分离到流感毒株981株,其中甲型流感病毒毒株934株,乙型流感毒株47株。在分离到的甲型流感病毒毒株中,57.49%为H1N1pdm亚型毒株,39.61%为H3N2亚型毒株。对34株H3N2亚型流感病毒测序结果显示M2基因S31N耐药位点上发生了突变;在NA耐药相关基因位点E119V、Q136K、D151A、I222V、H274Y、R292K、N294S均未发生突变。结论吉林省2018-2020年以甲型流感流行为主。34株甲型H3N2亚型流感病毒均对金刚烷胺类药物耐药,但仍对神经氨酸酶抑制剂敏感。

甲型流感病毒M1基因真核表达载体的构建及其表达

研究旨在构建含有甲型流感病毒M1基因的真核表达载体,并探讨其在真核细胞中的表达。提取流感病毒Influenza A/FM/1/47(H1N1)RNA,RT-PCR扩增M1基因并将目的基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)。经酶切及PCR鉴定后用PolyFect脂质体将其转染到Vero细胞,免疫荧光技术鉴定其表达。甲型流感病毒M1蛋白重组质粒pcDNA3.1-M1的成功构建,为开发研制流感病毒保守蛋白DNA疫苗奠定了基础。

2014-2016年镇江市甲型H3N2流感病毒HA和NA基因遗传进化研究

目的对2014-2016年镇江市甲型H3N2流感病毒的HA和NA基因进行分子流行病学分析,了解其进化特征。方法收集2014-2016年镇江市流感样病例咽拭子标本,对核酸检测鉴定为阳性的标本进行病毒分离;随机抽取13株经血凝抑制试验(HI)鉴定确认为甲型H3N2亚型毒株,用特异性的引物扩增其HA和NA基因,进行序列分析。对分离株和疫苗株、参比毒株的核苷酸、氨基酸同源性进行分析,对其抗原表位、耐药位点和糖基化位点进行分析。结果 2014-2016年镇江市共采集9 532份流感样标本,流感病毒阳性检出率为11.77%,3年分别为11.23%、13.82%和10.61%,差异有统计学意义(χ^(2)=16.602,P<0.001)。甲型H3N2亚型为最主要的亚型(占43.76%),其次为乙型BY型(占35.65%);除2015年乙型BY亚型为主(占70.13%),2014年、2016年均以甲型H3N2亚型为主(分别占48.30%、54.80%)。与北半球疫苗株A/Texas/50/2012(2013-2015)及A/Switzerland/9715293/2013(2015-2016)比对,选取的13株甲型H3N2镇江分离株的HA和NA基因核苷酸、氨基酸的同源性均≥97.4%,与北半球疫苗株HA和NA基因核苷酸、氨基酸的同源性均≥94.8%。13株镇江分离H3N2毒株主要分为4个进化分支。13株均未出现主要抗原位点氨基酸序列缺失,存在Y94H、A128T、S138A、G142R等散点性突变。与M2、NA蛋白相关的耐药位点未发现变异;3株糖基化位点发生D329N氨基酸替换。结论甲型H3N2亚型流感病毒是镇江市优势流行亚型。主要抗原位点、耐药位点均未发现重要突变,糖基化位点相对保守,仍应继续加强监测。

人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位串联基因原核表达载体的构建

目的构建人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位串联基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达目的蛋白。方法合成人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位的串联基因,克隆入pET-28a(+)载体中,构建重组表达载体pET-28a-H3,经酶切鉴定和DNA序列分析后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并进行ELISA和Westernblot鉴定。结果重组载体pET-28a-H3酶切片段大小和DNA序列分析与预期结果一致。表达的目的蛋白相对分子质量约9400,与相应的多克隆抗体反应性良好。结论已成功构建人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位串联基因原核表达载体pET-28a-H3,并表达了目的蛋白,为制备单克隆和多克隆抗体奠定了基础。

甲型流感病毒M_2蛋白胞外功能区真核表达质粒的构建和表达分析

目的构建流感病毒M2蛋白胞外功能区(M2e)真核表达质粒,并研究其在真核细胞中的表达。方法根据Genbank(NCBI ISDN13425)中查得的M2e编码序列,设计并合成两条DNA单链;在两条链两端添加碱基构成酶切位点的粘性末端,退火后使之互补结合成为M2e编码序列;然后将其插入到经双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-M2e;经酶切和DNA测序鉴定后,转染HEK293细胞,用免疫荧光技术检测pcD-NA3.1(+)-M2e在HEK293细胞的表达,并通过MTT检测刺激淋巴细胞增殖及M2e蛋白的分泌情况。结果合成的寡核苷酸链经退火形成双链,插入酶切的真核表达载体后构建成pcDNA3.1(+)-M2e。免疫荧光技术证实该质粒表达的M2e蛋白定位于细胞膜上,转染细胞的培养上清经MTT实验证实能刺激淋巴细胞增殖,表明表达的M2e蛋白也可分泌至细胞外。结论成功构建了流感病毒M2e的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-M2e,表达的M2e蛋白不仅存在于细胞膜上,也可分泌到细胞外。流感病毒M2e基因真核表达质粒的构建及成功表达为流感病毒基因工程疫苗、通用疫苗和核酸疫苗的研究奠定了基础。

甲型流感病毒M2e通用疫苗的研究进展

流感严重地影响人们的身体健康和工作生活,给社会带来巨大经济损失。疫苗接种是预防流感的有效措施之一,市场上的流感疫苗包括流感灭活疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗等。这些流感疫苗只能预防相同亚型流感病毒的感染,无法预防不同亚型流感病毒引起的季节性流感和流感大流行,因此迫切需要研发广谱的能预防不同亚型的甲型流感病毒感染的通用疫苗。在此简要介绍甲型流感病毒M2e通用疫苗的研究进展。

H3N2亚型流感病毒分离株全基因组序列特征分析及其临床意义

目的分析H3N2亚型流感病毒流行株的全基因组序列及其与临床特征的相关性。方法检测2014年12月—2015年3月收集的呼吸道感染患者鼻拭子样本,对其中H3N2亚型流感病毒株PCR扩增后直接进行全基因组测序,分析其核酸序列特征及氨基酸变异情况。结果与WHO推荐2014—2015流感疫苗株参考病毒株相比,来自不同患者的14个病毒株HA1蛋白抗原决定簇均发生不同程度突变,抗原决定簇结构改变较明显的病毒株其宿主具有更高的体温和更严重的临床表现。全部14个病毒株发生HA1蛋白E190D氨基酸突变。6个病毒株NA蛋白出现1个新增糖基化位点。1个病毒株存在导致金刚烷胺耐药的M2蛋白V27A突变。全部14个病毒株PB1-F2蛋白发生I18T突变。结论 M2蛋白耐药突变的出现和PB1-F2蛋白氨基酸突变提示分离获得的H3N2流感病毒株在进化过程中曾经结合H1N1亚型流感病毒基因片段。HA1蛋白抗原决定簇突变的增加可能引发患者更强的免疫反应。

A型禽流感病毒M2蛋白胞外功能区（M2e）基因的原核表达和免疫原性分析

为研究A型禽流感病毒M2蛋白胞外功能区（M2e）蛋白亚单位疫苗在鸡体的免疫保护力，利用笔者所在实验室已构建的含M2e基因的质粒pGEM—T-1459，获得顺次串联的基因片段3M2e，将其克隆到原核表达载体pMAL—C2x中，经酶切和DNAN序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导表达，SDS—PAGE和Western—blot分析，结果显示，

2018-2020年克拉玛依市甲型H3N2流感病毒分子特征分析

目的了解克拉玛依市甲型H3N2流感病毒HA和NA基因特征,为防控提供科学依据。方法收集2018-2020年克拉玛依市甲型H3N2流感毒株进行HA和NA基因序列测定,运用Mega软件与疫苗株进行序列比对和分析。结果 18株毒株HA基因与A/Hong Kong/4801/2014同源性高于A/Kansas/14/2017,NA基因与A/Hong Kong/4801/2014同源性低于A/Kansas/14/2017。相对疫苗株,克拉玛依市毒株已出现氨基酸同时在2个及以上抗原决定簇发生替换;HA蛋白均发生了糖基化位点的改变;未发现与耐药相关位点突变。结论 2019-2020年克拉玛依市毒株与当年度疫苗推荐株匹配度降低且HA已发生抗原漂移,可能导致本地区H3N2毒株流行,神经氨酸酶抑制剂类药物依旧能够有效治疗流感,应加强对流感病毒HA和NA基因进行监测。