食源性甲型肝炎病毒快速检测技术研究进展

病毒在食源性疾病的爆发中起着至关重要的作用,其中,甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)感染后能够致人衰弱,并引发急性肝衰竭。由于其传染迅速,影响范围广,HAV污染已经给消费者带来了严重的健康风险,且在全球范围内造成了大规模的食源性疫情和经济损失。因此,早期快速准确的检测HAV对于食品安全和疫情暴发的溯源至关重要,以便及时确定并召回受污染的食品,防止感染的进一步发生。传统的HAV检测方法由于检出率不高以及病毒在细胞内的培养周期长等问题,往往耗时费力,无法快速有效地对其进行检测。本文对目前报道较多的HAV快速检测技术进行了阐述和梳理,对各项技术的检出限、检测时间以及优缺点进行了比较,并对HAV快速检测技术研究进行了展望,为后续HAV的快速检测研究提供依据,也有助于进一步探讨与开发HAV快速检测的新技术,以有效防止HAV的传播与危害。

2020—2023年山东地区13株3型鸭甲型肝炎病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析

为研究2020—2023年山东地区3型鸭甲型肝炎病毒的流行变异情况,试验采集了山东地区13份疑似鸭肝炎病毒感染的病料,通过病毒分离、RT-PCR扩增鉴定,并进行VP1基因测序及遗传变异分析。结果显示:共分离到13株3型鸭甲型肝炎病毒,均属于GⅠa分支,且分属于GⅠa分支不同小分支,其中2020年分离株(20148、20149)与2021年商品肉鸭分离株(SP21042)核苷酸相似性在98.8%~100%;2023年商品鸭分离株(SP23012、SP23014、SP-2、SP-3、SP23009)核苷酸相似性在99.7%~100%;2021年种鸭分离株(21083)与2022年、2023年种鸭分离株(22443、22468、BL23028)、2023年商品鸭分离株(SP23010)核苷酸相似性在98.8%~99.4%,小分支内相似性均高于98.8%,不同小分支间相似性在96.9%~98.2%;2023年部分3型DHAV分离株VP1基因出现了个别氨基酸位点的突变。研究表明,山东地区分离的13株GⅠa分支鸭甲型肝炎病毒VP1基因出现了变异,需要加以关注。

识别不同亚型鸭甲型肝炎病毒VP0蛋白单克隆抗体的制备及表位鉴定

为制备鸭甲型肝炎病毒(DHAV)VP0蛋白的单克隆抗体(MAb),本实验经PCR扩增DHAV-1和DHAV-3的VP0基因并克隆至原核表达载体pMAL-c5x中分别构建重组质粒pMAL-c5x-DHAV1-VP0和pMAL-c5x-DHAV3-VP0。重组质粒均经PCR和测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,采用IPTG诱导表达,并经亲和层析的方法纯化后,采用SDS-PAGE检测两个重组蛋白的表达与纯化效果。SDS-PAGE结果显示,分别在约70 ku处出现目的条带,且纯化后的条带较单一。表明两种重组VP0蛋白(DHAV-1 rVP0和DHAV-3 rVP0蛋白)均获得了表达,且纯化效果均较好。采用纯化的DHAV-1 VP0和DHAV-3 VP0蛋白交叉免疫BALB/c小鼠4次,并在冲击免疫后3 d收获小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用间接ELISA方法筛选能够稳定分泌DHAV-1 VP0及DHAV-3 VP0蛋白抗体且MBP蛋白抗体为阴性的杂交瘤细胞株,采用试剂盒鉴定MAb的亚类。结果显示,获得了针对DHAV-1及DHAV-3 VP0蛋白的MAb 1H10,且其为IgG1亚型,轻链为κ链。将构建的表达DHAV-1及DHAV-3 VP0蛋白的重组真核表达质粒经PCR和测序鉴定正确后分别转染HEK293T细胞,24 h后以该MAb作为一抗,分别采用western blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定。结果显示,转染两种重组质粒的细胞均在35 ku处出现特异性条带,且细胞中均出现特异性绿色荧光,而转染空载体的对照细胞无该条带和绿色荧光。表明制备的MAb可以用于western blot和IFA鉴定DHAV-1和DHAV-3 VP0蛋白的表达。通过对VP0基因截短表达并采用western blot鉴定其识别的抗原表位,并对该表位的氨基酸序列与NCBI数据库中VP0蛋白的氨基酸序列比对。结果显示,MAb 1H10识别的线性表位为VP0蛋白的184LRTNTEIDL192,该表位与不同年代和不同地域分离的DHAV-1及DHAV-3 VP0蛋白相应氨基酸序列的同源性均为100%。表明该抗原表位在不同DHAV分离株中的保守性很高。本研究为DHAV检测方法的建立及具有广谱保护性表位疫苗的设计提供实验参考。

鸭甲型肝炎病毒3型和鸭圆环病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立同时检测鸭甲型肝炎病毒3型(DHAV-3)和鸭圆环病毒(DuCV)的双重荧光定量PCR方法,试验根据NCBI中收录的DHAV-3 VP1和DuCV cap基因序列,分别设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了同时检测DHAV-3和DuCV的双重荧光定量PCR,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估,并采用该方法对临床样品进行检测。结果显示:建立的方法不与其他常见鸭病原发生交叉反应,对DHAV-3和DuCV的检测灵敏度分别为3.8 copies/μL和7.3 copies/μL,批内和批间变异系数均小于2%,从65份临床样品中分别检出DHAV-3和DuCV阳性样品11份和28份,与现有地方标准符合率分别为95.4%和90.8%。研究表明,建立的双重荧光定量PCR特异性强、敏感性高、重复性好,可用于DHAV-3和DuCV的快速检测。

基于荧光及可视化逆转录环介导等温扩增检测食源性甲型肝炎病毒的方法开发

目的基于荧光及可视化逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)开发食源性甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)的检测方法。方法从美国国家生物技术信息中心中选取世界范围内具有代表性的HAV基因信息,设计LAMP引物,开发了一种荧光曲线RT-LAMP和可视化RT-LAMP检测方法。以HAV质粒为模板,评估方法的扩增效率、灵敏度和稳健性,并与实时荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)进行检出限及实际样品验证比较。结果荧光及可视化LAMP方法检测灵敏度为10.76copies/μL,与实时荧光RT-PCR一致;在95%置信水平下经概率回归分析检出限(limitofdetection,LOD_(95%)),荧光曲线RT-LAMP的LOD_(95%)为17.46copies/μL(7.00~511.29 copies/μL,95%),实时荧光RT-PCR的LOD_(95%)为79.30copies/μL(24.68~3208.71copies/μL,95%);稳健性分析表明方法稳定;与实时荧光RT-PCR比较,检测30份实际样品的验证比对符合率为100%。结论该检测方法经济便捷,可通过肉眼直接观察结果,适合于食品安全现场监测,具有很好的应用前景。

鸭甲型肝炎病毒3型对商品肉鸭的致病性研究

为了解鸭甲型肝炎病毒3型(DHAV-3)对商品肉鸭的致病性,利用DHAV-3型强毒株SD20株滴口接种10日龄雏鸭,对攻毒后死亡雏鸭的组织病变进行了观察,并对攻毒后24和48 h雏鸭的血清生化指标进行了测定。结果显示:DHAV-3对雏鸭的致死率达85%,对肝脏等组织造成广泛的病理损伤,同时严重影响感染肉鸭的血清生化指标。攻毒后24 h,鸭血清中直接胆红素显著性降低(P<0.05),γ-谷氨酰转移酶和肌酐显著性升高(P<0.05);攻毒后48 h,鸭血清中白蛋白、直接胆红素显著升高(P<0.05),白球比、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、γ-谷氨酰转移酶、尿素氮和肌酐均极显著升高(P<0.01),谷丙/谷草和血糖均极显著下降(P<0.01),而总蛋白、球蛋白、总胆红素、间接胆红素、碱性磷酸酶指标变化不显著(P>0.05)。研究结果提示,DHAV-3对商品肉鸭致病性较强,养殖过程中需要积极预防。

甲型肝炎病毒IgM抗体快速检测试剂国家参考品的建立

目的建立甲型肝炎病毒IgM抗体快速检测试剂国家参考品,制订其质量标准,用于该类试剂的质量评价。方法通过对200多份单采浆站收集到的血浆进行初筛,筛选出16份备选样本。经多家实验室协助标定,分析标定结果,确定参考品的组成及其质量标准,并对参考品稳定性进行评估。结果本参考品由10份阴性参考品、1份最低检出限参考品和重复性参考品组成。质量标准为10份阴性参考品符合率(-/-)应为10/10,最低检出限参考品要求1:40稀释时检测阳性,重复性参考品要求1:15稀释时连续检测10次,结果应均为阳性,且显色度均一。稀释血浆应均为HCV、HBV和HIV标志物阴性。参考品在4℃放置3、7 d和反复冻融2次条件下相对比较稳定。结论成功建立甲型肝炎病毒IgM抗体快速检测试剂国家参考品,可用于该类试剂的质量控制及评价。

甲型肝炎病毒抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的:建立快速检测甲型肝炎病毒(HAV)抗原含量的双抗体夹心ELISA方法,并进行验证及初步应用。方法:用HAV多克隆抗体和HAV单克隆抗体酶结合物建立双抗体夹心ELISA法,检测HAV抗原含量。对建立的方法进行特异性、线性(标准曲线)、准确度、精密度、灵敏度验证,对不同生产厂家生产的HAV疫苗(人二倍体细胞)与不同工艺阶段的HAV疫苗(人二倍体细胞)中间产品进行适用性检测。结果:HAV多克隆抗体的最佳包被浓度为8μg/mL,酶标抗体最佳稀释度为1∶10 000,封闭剂为1%BSA。该方法与其他人用疫苗和辅料成分无交叉反应;线性范围0.546 875~17.500 000 IU/mL,R^(2)> 0.99;准确度验证回收率80.1%~123.7%;精密度验证变异系数<8.3%。检测不同厂家的HAV疫苗(人二倍体细胞)和不同工艺阶段的HAV疫苗(人二倍体细胞)中间产品呈良好的剂量依赖效应。结论:建立了适用于HAV抗原含量检测的双抗体夹心ELISA方法,符合定量检测的需求,可用于不同毒株生产的HAV疫苗(人二倍体细胞)检测,可用于甲肝病毒收获液、浓缩液、纯化液、灭活液及原液等不同工艺阶段样品检测。

新疆伊犁2005年甲型肝炎病毒流行株基因分型研究

为了解2005年新疆伊犁甲型肝炎病毒（甲肝病毒）流行株分子流行病学特征，收集了部分甲肝病人血清标本，用国际上通用的甲肝病毒结构区基因VP1—2A分型引物，经核酸提取，做RT-PCR，序列测定，对甲肝病毒基因进行分型研究，并对甲肝病毒在甲型肝炎（甲肝）病人血清中存在的时间进行了探讨。结果显示，甲肝病毒核苷酸序列变异在0～3．2％之间，分为不同的基因簇，但都属于1A亚型（同一基因亚型间核苷酸序列变异小于7．5％）;氨基酸序列几乎相同。甲肝发病8周后的病人血清中仍能检测到甲肝病毒。结果说明该流行区有多株甲肝病毒存在，其传染源可能有多个传播途径，当人群免疫水平较低时，可引起甲肝流行。甲肝病毒在病人血液中可存在较长时间。这些工作为今后进一步开展甲肝病毒溯源研究及有效控制甲肝病毒流行提供了理论和技术支撑。

中国五省市甲型肝炎病毒基因分型的研究

为了解甲型肝炎 (甲肝 )病毒 (HAV)在中国几个城市的基因型分布 ,选择浙江杭州、江苏启东、安徽铜陵、云南昆明和上海市等的甲肝病人粪便标本或血清标本 ,以逆转录 -套式聚合酶链反应 (RT nPCR)扩增合成HAVVP1/2A交接区基因区 ,并进行直接核苷酸序列分析和差异比较。结果表明 ,从这些城市甲肝病人分离到的 17株HAV株均属基因Ⅰ型 ,为IA和IB亚型 ;所有HAV株间核苷酸差异均小于 15 % ,但约 5 0 %HAV株株间核苷酸差异大于 7 5 % ,说明中国流行或散发的HAV株可能有基因IA、IB亚型同时存在。该项研究结果将为HAV的分子流行病学追踪调查提供方法和依据。

小浆果中食源性甲型肝炎病毒和诺如病毒流行状况及检测方法的研究进展

小浆果是食源性甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)和诺如病毒(norovirus,NoV)感染爆发的重要传播载体,受到全世界的广泛关注。为及时了解小浆果产品的病毒污染情况,需要对不同类型小浆果中的食源性病毒进行准确检测。由于受污染的小浆果携带病毒含量较低,且自身质地脆弱并含有大量果胶、多酚、多糖、色素等反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)抑制物,容易产生大量的"假阴性"结果,给食源性病毒的监测带来困难。在广泛查阅文献的基础上,本文综述了HAV和NoV在小浆果中的流行状况,指出了小浆果中食源性病毒检测的改进方向,阐述了全程过程控制、分子过程控制和RT-PCR过程控制在食源性HAV和NoV检测中的应用情况,为加强HAV和NoV在小浆果中的防控能力提供方法学参考。

应用抗体捕捉聚合酶链反应(AC/PCR)检测贝类甲型肝炎病毒污染

污染水体中生长的贝类是传播甲型肝炎的重要途径之一。本文介绍了一种抗体捕捉后进行ＰＣＲ扩增来检测贝肉中甲肝病毒（ｈｕｍａｎｈｅｐａｔｉｔｉｓＡｖｉｒｕｓ，ＨＡＶ）的方法。贝肉中ＨＡＶ的浓集回收采用洗脱一沉淀法井加以改进，用脊髓灰质炎病毒作为指示病毒，经二次沉淀后病毒的回收经率为２６％，３０克贝肉中的病毒浓集回收在１．０～１．５ｍｌ上清液中。此方法计算检测限＜３０－３００ＨＡＶ／３ｇ贝肉。从１４份大连海域标本中，用该法检测出阳性标本７份，阳性率为５０％。此浓集病毒的方法还可应用于检测贝肉中污染的脊髓灰质炎病毒、诺瓦克病毒、轮状病毒等其它病毒。

抗甲型肝炎病毒抗体Fab在大肠杆菌中的表达

目的在大肠杆菌中高效表达人源抗HAV抗体Fab，为进一步研究该抗体的功能奠定基础。方法依次将抗HAV抗体的Fd及轻链基因克隆到表达载体pASK84的不同信号序列下，构建成Fab表达质粒，在大肠杆菌JM83中进行表达，并对表达产物进行复性。用SDS-PAGE、western blot和ELISA法检测Fab的表达及其与甲肝病毒抗原的结合活性。结果 构建了抗HAV Fab的重组表达质粒p84Fab，在大肠杆菌JM83中获得表达，表达的Fab占全菌的25%，主要以包涵体形式存在，复性后具有抗原结合活性；培养基、菌体可溶性蛋白部分也能检测到有抗原结合活性的Fab。 结论抗HAV抗体Fab在大肠杆菌中得到了表达，并具有良好的抗原结合活性。

鸭甲型肝炎病毒的遗传和抗原稳定性分析

本研究测定了实验室保存的25株(2000年～2017年)鸭甲型肝炎病毒1型(DHAV-1)和32株(2008年～2017年)鸭甲型肝炎病毒3型(DHAV-3)的VP1基因序列,利用生物信息学软件对其以及Genbank中下载的DHAV的VP1基因进行遗传进化关系分析,并选取代表毒株进行血清中和试验,分析DHAV-1或DHAV-3的遗传和抗原稳定性。结果表明,DHAV-1进化为2个遗传分支,2016年～2017年的分离毒株分布在同一分支上;DHAV-3进化为2个不同的分支,2008年～2017年分离毒株集中在相同分支上,又进一步进化为不同的亚分支;DHAV-1或DHAV-3毒株之间无明显的地理分布差异。血清交叉中和试验结果表明,DHAV-1或DHAV-3同一血清型之间具有较好的交叉保护,表明同一血清型的DHAV未发生抗原变异。本研究揭示了DHAV-1或DHAV-3的遗传进化特点和相同血清型之间的抗原稳定性。

用多聚酶链反应检测环境样品中甲型肝炎病毒RNA的实验研究

采用直接逆转录一多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）对加标海水、海泥、毛蚶的浓缩样品，用不同消毒方法处理过的甲型肝炎病毒（ＨＡＶ）及毛蚶实测样品进行了ＨＡＶ－ＲＮＡ分析。结果表明，该方法可检出加标海水、海泥及毛蚶中的ＨＡＶ－ＲＮＡ；对苯酚消毒灭活的ＨＡＶ检验结果表明含有完整核酸序列的灭活病毒也能用ＲＴ－ＰＣＲ方法检出；毛蚶实测样品结果表明，只有１９８８年上海毛蚶ＲＴ－ＰＣＲ阳性，但细胞培养间接免疫荧光法检测结果为阴性，说明毛蚶冻存太久（≥５年），ＨＡＶ已不具感染性。直接ＲＴ－ＰＣＲ方法简便敏感，不需超速离心及其它特殊设备，在普通实验室也能使用。

在人二倍体细胞上分离和适应的甲型肝炎病毒株

应用人二倍体细胞ＫＭＢ＿（１７）株，从甲型肝炎患者粪便中直接分离到３株甲型肝炎病毒（ＨＡＶ）。３株ＨＡＶ在ＫＭＢ＿（１７）细胞上已稳定地传代１０次，其抗原滴度可达５１２，感染滴度为７．０～７．７５１ｏｇＴＣＩＤ＿（５０）／ｍ１。用直接免疫荧光法在感染细胞胞浆内检测到特异性荧光着染颗粒，免疫电镜可见成堆２７～３０ｎｍ空心和实心混杂的病毒颗粒，中和试验结果表明抗－ＨＡＶ血清可完全中和这些病毒。证明分离的３株病毒均属ＨＡＶ，可作进一步研究应用。

氯对甲型肝炎病毒抗原性及核酸多态性影响的研究

为了探讨氯灭活甲型肝炎病毒 (HAV)的机制 ,采用酶联免疫吸附试验和RNA的随机引物扩增指纹图谱技术分别检测在氯灭活HAV前后病毒抗原以及核酸多态性的变化。结果显示 :灭活病毒的感染性(加氯 10mg L或 2 0mg L接触 30min)先于破坏病毒的抗原性 (加氯 10mg L或 2 0mg L接触 6 0min) ,当病毒感染性被灭活时 ,往往可以看到病毒核酸多态性的变化。结果表明 :氯灭活HAV可能是通过破坏核酸局部片段所致。

根癌农杆菌介导甲型肝炎病毒(HAV)衣壳蛋白融合基因转化柑桔成年材料的研究

本研究以柑桔优良品种不知火(shinanui)为试料,通过携带质粒pBI121-A的根癌农杆菌转化成年树腋芽,获得转甲型肝炎病毒(HAV)衣壳蛋白融合基因不知火植株。研究结果表明,锦橙试管砧木培养15d时不知火成年树腋芽的嫁接成活率最高,达到90%;不知火不同成熟度的枝条应采用不同的消毒时间,木质化的枝条消毒时间要长些,半木质化的枝条消毒时间要短些。对获得的拟转化植株进行PCR分析以及对PCR阳性植株进行测序,结果表明HAV衣壳蛋白融合基因已整合到不知火的基因组中。

甲型肝炎病毒吕8株的快速适应性培养

用12天35℃初步适应培育出一株在KMB17细胞稳定传代、感染性滴度高、增殖周期短的HAV适应株LU8株，其感染性滴度为108．33TCID50／ml，抗原滴度为1：1024，一步生长曲线试验和免疫电镜观察结果表明12天为该株病毒增殖高峰。LUB株和H2减毒株HAV经纯化和灭活后接种豚鼠，第一次接种后4周血清HAV抗体均阳转，第二次接种后滴度为1：13．5和1：4．8（GMT），第三次接种后滴度增至1：16和1：8。提示LUB株抗原性较H2株强。

斑点金免疫渗滤试验快速检测抗甲型肝炎病毒IgM抗体

目的：建立胶体金免疫渗滤试验用于快速检测抗甲型肝炎ＩｇＭ抗体．方法：将甲型肝炎抗原固相在硝酸纤维薄膜上，用来捕获血清标本中的ＩｇＭ抗ＨＡＶ，通过胶体金标记抗人ＩｇＭ而显色．斑点色泽鲜艳，结果易于判断．整个试验过程仅需２～４ｍｉｎ．结果：用本法与ＥＬＩＳＡ对比检测血清标本２７９份，两法均阳性１４８份，两法均阴性１２５份，总符合率为９７．８％．阻断试验与２－ＭＥ破坏试验证实其结果是特异的．本试验不需任何仪器设备，不受类风湿因子影响．结论：本方法可用于甲型肝炎的早期诊断和流行病学监测．