化学发光微粒子免疫检测法定量检测开封市从业人员抗甲型肝炎病毒IgG抗体含量

目的探讨化学发光微粒子酶免疫分析法定量检测开封市区从业人员抗HAV-IgG含量的临床应用价值。方法分别采用化学发光微粒子免疫法和ELISA法对664份血清进行抗HAV-IgG定性检测,对598份抗HAV-IgG阳性样本使用化学发光微粒子免疫法定量检测。结果化学发光微粒子酶免疫分析法阳性率为90.06%,ELISA法阳性率为83.73%,化学发光微粒子酶免疫分析法阳性率高于ELISA法,差异有统计学意义(P<0.01)。从业人员抗HAVIgG S/CO值随着年龄的增长逐渐升高,女性的S/CO值高于男性。结论相较于传统的ELISA法,化学发光微粒子免疫检测法检测阳性率更高,结果更精确,值得临床推广应用。

识别不同亚型鸭甲型肝炎病毒VP0蛋白单克隆抗体的制备及表位鉴定

为制备鸭甲型肝炎病毒(DHAV)VP0蛋白的单克隆抗体(MAb),本实验经PCR扩增DHAV-1和DHAV-3的VP0基因并克隆至原核表达载体pMAL-c5x中分别构建重组质粒pMAL-c5x-DHAV1-VP0和pMAL-c5x-DHAV3-VP0。重组质粒均经PCR和测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,采用IPTG诱导表达,并经亲和层析的方法纯化后,采用SDS-PAGE检测两个重组蛋白的表达与纯化效果。SDS-PAGE结果显示,分别在约70 ku处出现目的条带,且纯化后的条带较单一。表明两种重组VP0蛋白(DHAV-1 rVP0和DHAV-3 rVP0蛋白)均获得了表达,且纯化效果均较好。采用纯化的DHAV-1 VP0和DHAV-3 VP0蛋白交叉免疫BALB/c小鼠4次,并在冲击免疫后3 d收获小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用间接ELISA方法筛选能够稳定分泌DHAV-1 VP0及DHAV-3 VP0蛋白抗体且MBP蛋白抗体为阴性的杂交瘤细胞株,采用试剂盒鉴定MAb的亚类。结果显示,获得了针对DHAV-1及DHAV-3 VP0蛋白的MAb 1H10,且其为IgG1亚型,轻链为κ链。将构建的表达DHAV-1及DHAV-3 VP0蛋白的重组真核表达质粒经PCR和测序鉴定正确后分别转染HEK293T细胞,24 h后以该MAb作为一抗,分别采用western blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定。结果显示,转染两种重组质粒的细胞均在35 ku处出现特异性条带,且细胞中均出现特异性绿色荧光,而转染空载体的对照细胞无该条带和绿色荧光。表明制备的MAb可以用于western blot和IFA鉴定DHAV-1和DHAV-3 VP0蛋白的表达。通过对VP0基因截短表达并采用western blot鉴定其识别的抗原表位,并对该表位的氨基酸序列与NCBI数据库中VP0蛋白的氨基酸序列比对。结果显示,MAb 1H10识别的线性表位为VP0蛋白的184LRTNTEIDL192,该表位与不同年代和不同地域分离的DHAV-1及DHAV-3 VP0蛋白相应氨基酸序列的同源性均为100%。表明该抗原表位在不同DHAV分离株中的保守性很高。本研究为DHAV检测方法的建立及具有广谱保护性表位疫苗的设计提供实验参考。

甲型肝炎病毒IgM抗体快速检测试剂国家参考品的建立

目的建立甲型肝炎病毒IgM抗体快速检测试剂国家参考品,制订其质量标准,用于该类试剂的质量评价。方法通过对200多份单采浆站收集到的血浆进行初筛,筛选出16份备选样本。经多家实验室协助标定,分析标定结果,确定参考品的组成及其质量标准,并对参考品稳定性进行评估。结果本参考品由10份阴性参考品、1份最低检出限参考品和重复性参考品组成。质量标准为10份阴性参考品符合率(-/-)应为10/10,最低检出限参考品要求1:40稀释时检测阳性,重复性参考品要求1:15稀释时连续检测10次,结果应均为阳性,且显色度均一。稀释血浆应均为HCV、HBV和HIV标志物阴性。参考品在4℃放置3、7 d和反复冻融2次条件下相对比较稳定。结论成功建立甲型肝炎病毒IgM抗体快速检测试剂国家参考品,可用于该类试剂的质量控制及评价。

甲型肝炎病毒抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的:建立快速检测甲型肝炎病毒(HAV)抗原含量的双抗体夹心ELISA方法,并进行验证及初步应用。方法:用HAV多克隆抗体和HAV单克隆抗体酶结合物建立双抗体夹心ELISA法,检测HAV抗原含量。对建立的方法进行特异性、线性(标准曲线)、准确度、精密度、灵敏度验证,对不同生产厂家生产的HAV疫苗(人二倍体细胞)与不同工艺阶段的HAV疫苗(人二倍体细胞)中间产品进行适用性检测。结果:HAV多克隆抗体的最佳包被浓度为8μg/mL,酶标抗体最佳稀释度为1∶10 000,封闭剂为1%BSA。该方法与其他人用疫苗和辅料成分无交叉反应;线性范围0.546 875~17.500 000 IU/mL,R^(2)> 0.99;准确度验证回收率80.1%~123.7%;精密度验证变异系数<8.3%。检测不同厂家的HAV疫苗(人二倍体细胞)和不同工艺阶段的HAV疫苗(人二倍体细胞)中间产品呈良好的剂量依赖效应。结论:建立了适用于HAV抗原含量检测的双抗体夹心ELISA方法,符合定量检测的需求,可用于不同毒株生产的HAV疫苗(人二倍体细胞)检测,可用于甲肝病毒收获液、浓缩液、纯化液、灭活液及原液等不同工艺阶段样品检测。

新型冠状病毒肺炎病例尿液SARS-CoV-2特异性IgM、IgG抗体结果分析

目的:探讨尿液严重急性呼吸综合征冠状病毒2特异性抗体免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)的临床应用价值。方法:选取30例新型冠状病毒肺炎康复期患者,于出院后第14日采集研究对象的血清及尿液标本,分别用磁微粒全自动化学发光免疫分析系统化学发光免疫分析仪(Axceed 260)和新型冠状病毒(2019-nCOV)IgM/IgG检测试剂盒(磁微粒化学发光法)检测SARS-CoV-2特异性IgM/IgG抗体,并选取10例无SARS-CoV-2接触史健康体检者作为对照。应用线性回归分析血清IgM与尿液IgM、血清IgG与尿液IgG抗体水平的相关性,并通过Logistic回归形成联合预测因子绘制ROC曲线并计算曲线下面积评估其诊断价值。结果:COVID-19康复期患者血清IgM与尿液IgM、血清IgG与尿液IgG抗体水平分别呈正相关性(均P<0.001);与健康对照组相比,COVID-19组尿液特异性IgM、IgG抗体水平高,其中尿液特异性IgM抗体差异有统计学意义(P=0.043)。通过Logistic回归形成联合预测因子绘制ROC曲线,结果显示尿液IgM、IgG抗体联合检测AUC为0.713。结论:尿液SARS-CoV-2 IgM、IgG抗体检测作为一种无创快速简便的新型检测方法,为COVID-19诊断提供了新思路。

抗戊型肝炎病毒IgG抗体定量线性标准品的标定及初步应用

目的建立抗戊型肝炎病毒(Anti-HEV)IgG抗体的定量线性标准品,并进行初步应用。方法利用抗-HEV IgG和抗-HEV IgM ELISA检测试剂筛选出1份抗-HEV IgG阳性血清L9,经基因1型和4型的HEV ORF2C-端抗原及239抗原进行Western blot确认后,用WHO定量标准品,由3个实验室协作标定,利用量反应平行线法计算其抗-HEV IgG的含量。考察已标定的L9血清的稳定性,并用所标定的1.5倍系列稀释的血清对国内外6家抗-HEV IgG试剂的灵敏度进行检测。选择一灵敏度较高的试剂,在其线性范围内取L9的5个稀释度作为抗-HEV IgG抗体定量线性标准,对高、中、低浓度的3份临床血清重复检测5次,考察其重复性;对实验感染猴的系列血清中抗-HEV IgG含量进行定量检测,考核该定量线性标准品的应用效果;并对每次定量试验中的线性方程进行分析,确定相关系数r值和斜率k值的范围。结果经国内外试剂检测筛选出的阳性血清L9与基因1型和4型的HEV ORF2 C-端抗原及239抗原均有阳性反应。经协作标定,L9血清抗-HEV IgG含量为16.9U/ml。L9血清在-20℃下保存6、12、18个月,2～8℃保存24、48、96h后,定量结果均在95%置信区间内,且抗-HEV IgG含量均未明显下降。6家抗-HEVIgG检测试剂灵敏度差异较大,范围为0.03～5.00U/ml。确定L9血清从0.42U/ml开始的5个1.5倍系列稀释度,作为某一试剂抗-HEVIgG抗体定量线性标准品。利用该线性定量标准检测高、中、低浓度的3份临床血清,定量结果重复性较好;对实验感染猴系列血清进行定量检测,结果可有效地反映抗体水平变化趋势;94%的定量检测试验,r≥0.98,1.15≥k≥0.95。结论已建立了抗-HEVIgG抗体定量线性标准品,可用于疫苗免疫原性评价和流行病学调查。

甲型肝炎病毒免疫接种后人群特异性IgG 抗体水平的动态观察

甲型肝炎病毒免疫接种后人群特异性ＩｇＧ抗体水平的动态观察王昆英黄萍（武汉市武昌区卫生防疫站，武汉４３００７１）ＨＡＶ减毒活疫苗的接种，是预防甲型肝炎流行，降低感染率的有效手段，而ＨＡＶ易感率的高低是由人群中ＨＡＶ特异性ＩｇＧ抗体水平来决定的。本文动态...

抗甲型肝炎病毒抗体Fab在大肠杆菌中的表达

目的在大肠杆菌中高效表达人源抗HAV抗体Fab，为进一步研究该抗体的功能奠定基础。方法依次将抗HAV抗体的Fd及轻链基因克隆到表达载体pASK84的不同信号序列下，构建成Fab表达质粒，在大肠杆菌JM83中进行表达，并对表达产物进行复性。用SDS-PAGE、western blot和ELISA法检测Fab的表达及其与甲肝病毒抗原的结合活性。结果 构建了抗HAV Fab的重组表达质粒p84Fab，在大肠杆菌JM83中获得表达，表达的Fab占全菌的25%，主要以包涵体形式存在，复性后具有抗原结合活性；培养基、菌体可溶性蛋白部分也能检测到有抗原结合活性的Fab。 结论抗HAV抗体Fab在大肠杆菌中得到了表达，并具有良好的抗原结合活性。

人源抗乙型肝炎病毒表面抗原基因工程IgG全抗体的表达、纯化及初步鉴定

目的对人源抗乙型肝炎病毒表面抗原的基因工程IgG全抗体进行表达、纯化及初步鉴定。方法用含Fc片段抗-HBsAg Fab抗体基因的载体pAC-HBs-Fc,与杆状病毒线性DNA共转染昆虫细胞sf9,产生重组抗-HBsAg的全抗体。以不同浓度的HBsAg包被酶标板孔,用间接ELISA法检测培养上清中抗体的表达及特异性;用蛋白G亲和层析柱进行抗体的纯化,并对纯化的抗体进行SDS-PAGE、Western blot和竞争性ELISA分析。结果上清中表达的重组IgG抗体仅与HBsAg呈阳性反应,特异性良好,纯化后其纯度达97.1%。经SDS-PAGE和Western blot分析可见,IgG抗体轻链和重链的相对分子质量分别约为27000和55000,为人源IgG抗体。CHO表达的HBsAg和血源性HBsAg能竞争性抑制该重组IgG抗体与E.coli表达的HBsAg反应,其抑制率分别为55.9%和81.9%。结论人源抗乙型肝炎病毒表面抗原的基因工程IgG全抗体可在杆状病毒载体表达系统中成功表达。

2013年广州市甲型肝炎IgG抗体检测结果调查分析

目的调查分析2013年健康体检人群14 230例甲型肝炎IgG抗体结果的阳性率及不同年龄间的差异,为临床医生提供预防与诊断依据及更好的遏制甲肝的发生和流行起到一定的作用。方法选取2013年1～12月共14 230例健康体检者血清,根据年龄分成0～〈10岁,10～〈20岁,20～〈30岁,30～〈40岁,40～〈50岁,50～〈60岁,60～〈70岁,70～〈80岁,≥80岁,用酶联免疫吸附法检测甲型肝炎IgG抗体,比较各项阳性率并进行分析。结果在14 230例健康体检者人群中,在0～〈10岁、10～〈20岁、20～〈30岁、30～〈40岁、40～〈50岁、50～〈60岁、60～〈70岁、70～〈80、≥80岁中男性IgG抗体阳性率分别为96.47%、97.47%、98.88%、98.67%、98.04%、98.51%、97.99%、98.91%、98.60%;上述各年龄层女性IgG抗体阳性率依次为99.05%、95.96%、98.31%、98.75%、98.39%、98.17%、99.15%、98.68%、98.67%。结论广州市对于人群易感者进行甲型肝炎疫苗免疫对于甲肝的暴发流行与防控起到了一定的作用。

日照市城区不同人群甲型肝炎病毒抗体的检测

目的 了解甲型肝炎病毒 (HAV)在日照市城区人群中的感染情况和流行病学特征 ,探讨更加有效的预防控制措施。方法 用随机抽样的方法从日照市城区人群中采集血样本 3 3 0份 ,用酶联免疫吸附试验 (ELISA)法检测甲肝病毒抗体(抗 -HAV -IgG)。结果 检测显示甲肝抗体阳性率 84.5 % ,男女之间差异无显著性 (P >0 0 5 ) ,各年龄组人群之间差异有非常显著性 (P <0 0 0 5 )。结论 甲肝病毒在人群中感染普遍 ,8～ 15岁之间的少年儿童甲肝抗体阳性率较低 ,应该加强该人群的免疫预防工作。

电化学发光免疫分析和酶联免疫吸附试验检测甲型肝炎病毒IgM抗体的比较

目的比较和评价电化学发光免疫分析法(ECLIA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)测定甲型肝炎病毒(HAV)抗体IgM。方法选择本院住院或门诊患者血清共116例,均使用ECLIA和ELISA检测HAV-IgM抗体,对两种方法的一致性和临床诊断效能进行比较分析。结果用ECLIA和ELISA方法同时检测116例血清标本的HAV-IgM抗体,两种方法的阳性符合率为12.8%,阴性符合率为100%,总符合率为70.7%,两种方法的检测结果有统计学差异(P<0.05)。对两种方法检测结果不一致的34例患者进一步跟踪和随访,以临床诊断为标准,ECLIA检测HAV-IgM的敏感度、特异性、阳性检出率分别是:62.5%、100.0%、4.3%;ELISA方法的敏感度、特异性、阳性检出率分别是:100.0%、71.3%和33.6%。结论 ECLIA和ELISA对HAV-Ig M抗体检测结果的一致性较低,ELISA方法敏感度高,但ECLIA特异性好,检测过程可全自动化,检验结果更符合临床,可引入实验室检测,为临床甲型肝炎病毒感染提供诊断依据。

HIV患者合并甲型肝炎病毒抗体阳性概率研究

目的研究我院近3年来HIV患者合并甲型肝炎病毒感染概率,为进一步研究奠定基础。方法收集我院近3年来所有HIV患者样本,进行甲型肝炎抗体与CD4淋巴细胞计数检测。结果 HIV患者样本99份,均经过省疾病控制中心确诊,进行CD4淋巴细胞计数检测,CD4淋巴细胞计数<200个/μL有50例,CD4淋巴细胞计数>200个/μL有49例,甲型肝炎抗体阳性患者0例。结论我院作为定点救治单位,每年均对HIV感染者进行定期检测。HIV感染者的治疗管理工作到位,甲型肝炎患病率达到零概率。

南通市甲型肝炎抗体IgG监测结果分析

甲型肝炎(简称甲肝)是南通市主要传染病之一.为了解健康人群的甲肝免疫水平,2002年在全市范围内开展了甲肝抗体IgG的监测工作,现将结果报告如下.

微粒子酶联免疫分析法与电化学发光免疫分析法测定甲型肝炎病毒抗体一致性评价

为对微粒子酶联免疫分析法(MEIA)测定甲型肝炎病毒抗体方法学进行验证,用MEIA与电化学发光免疫分析法(ECLIA)同时检测476份血清标本的甲型肝炎病毒抗体,对其测量准确性、特异性及重复性进行评估分析。结果表明,MEIA与ECLIA比较,阳性符合率为98.7%,阴性符合率为97.0%,总符合率为98.3%。类风湿因子(RF)阳性、重度溶血、脂血、黄疸血清对检测无明显影响。MEIA与ECLIA测定甲型肝炎病毒抗体一致性较高。

类风湿因子与甲型肝炎病毒抗体IgM假阳性关系的实验研究

目的 探讨类风湿因子 (RF)浓度与甲型肝炎病毒抗体 (抗HAV -IgM)假阳性之间的关系 ,为排除该抗体的假阳性提供客观依据。方法 RF采用透射比浊法测定 ,抗HAV -IgM采用酶联免疫法检测。结果 实验组RF明显增高 ,且与抗HAV -IgM检测的光密度OD值之间存在直线回归关系。 结论 抗HAV -IgM阳性的确定应依据临床症状、病史、年龄及RF水平来综合判定以降低假阳性。

Pichia pastoris酵母中表达人源中和性抗甲型肝炎病毒scFv-Fc融合抗体的研究

为了探讨人源抗甲型肝炎(甲肝)病毒scFv-Fc融合抗体在酵母中的表达特性,将获得的人源抗甲肝病毒中和性单链可变区抗体(scFv抗体)基因克隆入含信号肽及人IgG1Fc抗体基因的酵母细胞表达载体中,获得了一株中和性人源抗甲肝病毒pPiscFv-FcHA16融合抗体的分泌表达,并对表达产物进行了纯化。同时对表达产物的生物学特性进行了一系列鉴定。表达的pPiscFv-FcHA16融合抗体为具有不同糖基化形式的同源二聚体,与相应的CHO细胞表达的IgG抗体相比,pPiscFv-FcHA16融合抗体仍保持很好的抗原结合活性,以及与中和性鼠抗甲肝病毒单克隆抗体的竞争抑制能力。同时也保持了对甲肝病毒的体外中和活性。这些结果表明,在酵母中表达的单链可变区(scFv)与IgG1Fc区的融合抗体具有很好的生物学活性,有希望用做体外诊断,用纯化相应的抗原,或者可能用于体内预防与治疗。

人源性抗甲型肝炎病毒Fab噬菌体抗体分子的初步筛选

目的从自建的大容量非免疫Fab噬菌体抗体库中筛选具有抗甲型肝炎病毒(HAV)抗原活性的噬菌体抗体,并进行鉴定。方法采用纯化的甲型肝炎病毒作为包被抗原,对自建的容量为1.26×1011pfu/ml的Fab噬菌体抗体库进行筛选和富集,分别对原始库和筛选后的抗体库进行Phage-ELISA和活性检测,经酶切鉴定和DNA测序分析后进行诱导表达。结果经2轮筛选,抗-HAV抗原的噬菌体抗体得到了明显富集,ELISA检测证实其具有良好的抗甲肝病毒抗原的特异性,抑制率为38.61%。酶切鉴定表明抗体库重组较稳定。SDS-PAGE检测显示Fab抗体蛋白在E.coliDH5α中得到了表达。结论从自建的非免疫Fab噬菌体抗体库中成功获得了抗甲肝病毒噬菌体抗体,所构建的非免疫抗体库可用于人源性抗体的筛选。