华细辛(异)丁香酚-O-甲基转移酶(IEMT)基因的分离与功能分析

甲基丁香酚(methyleugenol,ME)是中药细辛Asari Radix et Rhizoma挥发油中主要活性成分之一,具有镇痛、麻醉、抗炎等功效,其在植物体内的生物合成是初始前体物苯丙氨酸在众多酶的催化下经过一系列中间产物而完成的过程。丁香酚-O-甲基转移酶(eugenol O-methyltransferase,EOMT)是其中的关键酶之一,可使丁香酚苯环4位上的羟基甲基化,从而将丁香酚转化为甲基丁香酚。该研究首次从华细辛Asarum sieboldii中克隆1条(异)丁香酚-O-甲基转移酶[(iso)eugenol O-methyltransferase,IEMT]基因,其开放阅读框包含1 113 bp,编码1个由370个氨基酸残基组成的蛋白质;该蛋白具有甲基转移酶特征性结构域,以及二聚化结构域;构建原核表达重组质粒pET28a(+)-AsIEMT,诱导目标蛋白表达并分离纯化蛋白,以及对目标蛋白进行体外酶学分析,结果表明,AsIEMT具有双重催化活性,既能催化丁香酚生成甲基丁香酚,也能催化异丁香酚生成甲基异丁香酚,但后者效率更高;以异丁香酚为底物时,酶反应动力学常数K_(m)为(0.90±0.06)mmol·L^(-1),V_(max)为(1.32±0.04) nmol·s^(-1)·mg^(-1)。该研究拓展了对苯丙素类次生代谢关键酶基因的了解,为中药细辛品质形成机制的阐明提供了重要的研究基础。