甲基丙二酰辅酶A变位酶表达载体的构建及初步表达

目的:克隆表达甲基丙二酰辅酶A变位酶(MCM)蛋白,为进一步研究相关基因突变对功能的影响机制奠定基础。方法:自人外周血淋巴细胞中提取总RNA、逆转录,并与pET32a构建融合蛋白原核表达载体;优化蛋白表达诱导条件;经SDS-PAGE、WesternBlot检测目的蛋白的表达。结果:经酶切鉴定并经测序证实获得全长2210bp的甲基丙二酰辅酶A变位酶基因(MUT),并成功构建融合蛋白原核表达载体,SDS-PAGE在102 kDa处获得目的条带,Western Blot检测确定为MCM表达蛋白。结论:成功克隆表达出MCM表达蛋白。

地中海拟无枝酸杆菌甲基丙二酰CoA变位酶和消旋酶的纯化及性质

采用原生质体裂解方法确定甲基丙二酰CoA变位酶(MCM)和消旋酶(MCR)均是胞浆内酶。各经过四步纯化得到电泳纯酶。纯化MCM酶的比活力为12.84u/mg,纯化倍数为528,酶活回收为60％,纯化的MCM酶服从典型的米氏底物饱和曲线,对琥珀酰CoA和辅酶B_(12)的K_m值分别为9.723#mol/L和0.1277#mol/L。经SephadexG-150测定MCM分子量约为134.000±2000,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示两条分子量分别为67000和65000的蛋白带,说明该酶由两个大小不等亚基组成。吸收光谱测定每摩尔纯化全酶含两摩尔辅酶B_(12)。纯化MCR酶比活力为2.305u/mg,纯化倍数96,酶活回收46.7％。MCR酶由两个分子量均为17500的亚基组成。MCR酶活性能被二价金属离子Cu^(2+)、Co^(2+)、Mg^(2+)、Mn^(2+)和Fe^(2+)所促进。两酶的酶学性质和其他生物来源的MCM、MCR酶明显相似。

15例甲基丙二酸血症患儿临床特征和基因突变分析

目的分析15例甲基丙二酸血症(MMA)患儿临床特征和基因突变,为家系遗传咨询、产前诊断和新生儿筛查提供依据。方法选择15例先证者MMA患儿,其中男性7例,女性8例;年龄63 h~11岁,中位年龄2岁;cblC型12例(1个月~11岁,中位年龄1岁6个月),mut型3例(年龄63 h、3 d和3岁)。分析其临床资料。应用液相色谱和串联质谱技术对患儿尿液和血液代谢物进行筛查,应用Sanger测序方法结合高通量测序对患儿家系进行相关基因检测和分析。结果15例MMA患儿临床表现各异,累及全身多系统,常见临床表型主要为癫痫、水电解质紊乱、贫血、粒细胞缺乏和呼吸性/代谢性酸中毒等。在12例cblC型患儿钴胺素代谢相关C基因(MMACHC)中共检测出8种基因突变,包括7种错义突变和1种缺失突变,其中最常见的为c.658-660delAAG、c.609G>A和c.80A>G,分别占25%(6/24)、20.83%(5/24)和20.83%(5/24)。在3例mut型患儿甲基丙二酰辅酶A变位酶基因(MUT)中共检测出5种基因突变,包括3种错义突变、2种剪接位点突变。结论MMA亚型cblC型与表型存在一定相关性,mut型临床表现比cblC型更为严重。该研究结果丰富了MMA相关基因突变谱,为遗传咨询、产前诊断和新生儿筛查提供了依据。

甲基丙二酸血症患儿MUT基因突变分析

目的检测甲基丙二酸血症（methylmalonicacidemia，MMA）患儿MUT基因突变类型及突变频率，探讨基因型与临床表型之间的关系。方法依据串联质谱检测血酰基肉碱、气相色谱质谱检测尿甲基丙二酸以及维生素B12负荷试验等，诊断21例单纯MMA患儿；采用聚合酶链反应和直接测序法对这些患儿进行MUT基因突变检测分析。结果在21例单纯MMA患儿中14例检测到17种MUT基因突变，其中8种为未报道突变。以c．323G〉A（R108H）、c.729_730insTT（D244LfsX39）与c.630_1631GG〉TA（G544X）较为常见，突变频率分别为14．3％、10．7％及14．3％，以错义突变多见（64．7％）。14例MUT突变患儿中10例为早发型，1例为迟发型，3例由新生儿出生筛查检出；11例为维生素B12无效型，3例为有效型。结论揭示了中国MMA患儿中MUT基因的部分突变谱，MUT基因突变患儿发病较早，多为维生素B12无效型。

患儿甲基丙二酸血症的临床研究现状

患儿甲基丙二酸血症(MMA)的发病率和病死率均较高,是一种罕见的常染色体隐性遗传性丙酸代谢障碍性疾病,由甲基丙二酸辅酶(MMA的最常见原因)缺乏或在合成腺苷钴胺(辅因子)过程中未能将L-甲基丙二酸辅酶A转化为琥珀酰辅酶A引起。迄今为止已经鉴定出272种不同的突变,其中大多数为错义/无义突变,此种代谢错误表现为血浆和尿液中积累了大量甲基丙二酸,伴有或不伴有高同型半胱氨酸血症(称为孤立性MMA)。患儿可经历反复和严重的急性代谢失代偿期,表现为代谢性酸中毒、高氨血症和进行性脑病等,如不及时治疗,将严重危害生命。本文旨在对MMA的流行病学特点、临床表现、诊断、治疗等作一综述。

基于前体供给途径遗传改造提高褐黄孢链霉菌纳他霉素的产量

纳他霉素(natamycin)是一种高效、广谱、安全的抗真菌剂,广泛应用于食品防腐与医药领域。纳他霉素可由多种链霉菌发酵产生。它是以乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A及甲基丙二酰辅酶A为前体经Ⅰ型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)催化合成的多烯大环内酯类化合物。本研究以纳他霉素产生菌——褐黄孢链霉菌为研究材料,分别对不同前体分子供给途径中的关键酶进行过表达,并确定影响纳他霉素产量的关键前体供给途径。研究结果发现:通过过表达乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthase,ACS)加强乙酰辅酶A合成途径,以及通过过表达甲基丙二酰辅酶A变位酶(methylmalonyl-CoA mutase,MCM)加强甲基丙二酰辅酶A合成途径,重组菌株纳他霉素产量分别比野生型菌株提高了44.19%和20.51%。共过表达ACS和MCM,重组菌株纳他霉素产量获得进一步提升(达1123.34 mg/L),比野生型菌株提高了66.29%。上述发现为通过前体代谢工程的策略构建纳他霉素工业高产菌株提供了参考,也为其他聚酮类天然产物高产工程菌株的构建提供了借鉴。