甲基丙烯化明胶微球缓释Kartogenin修复髓核退变的体外评估

背景:细胞外基质合成与降解的失衡是髓核退变的主要原因,小分子药物Kartogenin(KGN)可恢复基质合成和降解的平衡。利用合适的载药系统实现KGN的缓释对KGN发挥长期有效的治疗至关重要。目的:用甲基丙烯酰化明胶(gelatin methacryloyl,GelMA)包裹KGN,通过微流控技术制备成可注射的水凝胶微球,探究其生物相容性和对髓核细胞生物学功能的影响。方法:将β-环糊精(β-cyclodextrins,β-CD)与KGN混合成包合物,与10%GelMA按1∶9的体积混合,利用微流控技术制备可注射水凝胶微球GelMA@β-CD@KGN,扫描电镜表征微球的微观形貌,检测水凝胶微球浸泡于PBS中1个月的药物释放情况。提取SD大鼠髓核细胞,将第1代细胞分3组培养:对照组单独培养髓核细胞,另外两组分别将GelMA@β-CD微球、GelMA@β-CD@KGN微球与髓核细胞共培养,利用CCK-8法检测细胞增殖,活死细胞染色检测细胞存活。分别用含有白细胞介素1β和不含白细胞介素1β的完全培养基将髓核细胞与两种微球共培养,采用RT-PCR法检测髓核细胞基质合成蛋白和分解蛋白的mRNA表达。结果与结论:①扫描电镜下可见,冻干后的GelMA@β-CD@KGN微球为规则的球形,保持高度分散且大小均一,形状饱满;GelMA@β-CD@KGN微球体外可持续释放药物,至30 d时药物释放量达到总量的62%;②活死细胞染色显示,GelMA@β-CD@KGN可保持髓核细胞的活性;CCK-8检测显示,GelMA@β-CD@KGN可促进髓核细胞的增殖;③在含或不含白细胞介素1β的完全培养基中,GelMA@β-CD@KGN微球组聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原的mRNA表达均高于GelMA@β-CD微球组(P<0.05,P<0.01),基质金属蛋白酶13、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5的mRNA表达均低于GelMA@β-CD微球组(P<0.01);④结果表明,GelMA@β-CD@KGN微球具有良好的生物相容性和药物缓释能力,作为载药系统是一种具有广阔应用前景的生物材料。

应用于3D生物打印的甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶相关理化性能的研究进展

甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)水凝胶由明胶和甲基丙烯酸(MA)聚合反应合成。GelMA水凝胶的制备方法简单,并具有良好的生物相容性及机械性能可调节性,受到众多研究者的关注。其在伤口敷料、药物释放支架及组织工程等生物医学工程领域具有巨大的应用潜力。文章对GelMA水凝胶的制备及其性能进行概括,对近年来利用纳米材料、天然聚合物和合成聚合物与GelMA水凝胶结合对材料改性进行综述,并对应用于3D生物打印的多功能GelMA水凝胶未来发展方向进行总结与展望。GelMA水凝胶属于多肽类水凝胶,脆弱易碎裂的特征极大限制了其应用,经过后期的改性提高力学性能的同时,可能将造成其生物相容性的降低,使材料的最终临床转换面临重大挑战。未来将通过不断探索复合天然/合成聚合物的混合水凝胶,提升支架的机械性能,同时保留GelMA优越的生物相容性。特别是纳米材料与GelMA水凝胶结合,将支架实现智能功能,尤其是在敷料支架领域的研究。

可注射纳米复合甲基丙烯酸化明胶水凝胶在骨修复中的应用

目的构建可缓释血小板衍生生长因子(PDGF)的可注射复合成骨水凝胶,验证其体内外成骨再生效应。方法通过简单共混纳米锂钙石(SN)、PDGF与甲基丙烯酸化明胶(GelMA),构建可注射复合水凝胶(GelMA-SN-PDGF),并进一步通过紫外光交联优化水凝胶力学性能。扫描电子显微镜、流变仪、万能力学试验机等分析GelMA-SN-PDGF的理化属性和力学性能;ELISA法测定复合水凝胶的PDGF缓释曲线,Transwell和划痕实验验证复合水凝胶的趋化性能;CCK-8法、Live/Dead染色法、DAPIPhalloidin染色法评估GelMA-SN-PDGF的生物相容性;qRT-PCR和免疫荧光染色标记法评估GelMA-SNPDGF的体外成骨能力,茜素红染色法分析其基质矿化能力。建立大鼠颅骨临界骨缺损模型并通过Micro-CT和Masson三色染色分析GelMA-SN-PDGF的体内成骨能力。结果GelMA-SN-PDGF复合水凝胶制备简易,能通过注射器注射,SN和PDGF的加入并未显著影响GelMA支架结构,紫外光交联后的GelMA支架满足骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的力学环境;PDGF在复合水凝胶中实现了理想的长期控释模式,并有效地刺激了BMSCs的归巢。GelMA-SN-PDGF复合水凝胶在体外促进了BMSCs中成骨相关标志物的表达和基质矿化,并展现了较好的体内临界骨缺损修复能力。结论可注射的GelMA-SNPDGF复合水凝胶具有良好的生物相容性和生物活性,能通过注射器微创修复骨缺损,体内外成骨效应较好,为临床骨缺损治疗提供了一种简单而快速的策略。

载细胞多孔甲基丙烯酸酐化明胶三维支架及对细胞行为的影响

背景:水凝胶材料支架是三维培养细胞的理想材料之一,但水凝胶内部密集的网络结构对细胞增殖及舒展有明显抑制作用,水凝胶支架内部的多孔结构对上述问题有明显改善。目的:探讨以甲基丙烯酸酐化明胶为支架材料、聚环氧乙烷溶液为造孔剂构建三维载细胞多孔水凝胶支架的方法,以及多孔水凝胶支架对细胞行为的影响。方法:制备甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶溶液与聚环氧乙烷溶液,将二者分别以4∶1、3∶1、2∶1、1∶1的体积比混合,加入骨髓间充质干细胞,设计构建可载细胞的三维多孔水凝胶支架,表征支架的微观形貌与力学性能,利用活死染色观察细胞相容性、细胞骨架染色观察细胞形态。结果与结论:(1)扫描电镜下可见,各组支架截面呈均匀分布的多孔结构,各孔隙之间相互连通,孔隙呈类椭圆形或类圆形,随着聚环氧乙烷溶液比例的增加,支架的孔径及孔隙率增加;(2)多频应变曲线显示,各组支架的应变均可达到40%以上,其中体积比1∶1支架的应变可达到60%;随着聚环氧乙烷溶液比例的增加,支架的储能模量下降,其中体积比1∶1支架的力学强度较差,仅能勉强维持支架的形态;(3)体外培养14 d的活死染色显示,各组支架内的细胞存活率均>85%;(4)体外培养14 d的细胞骨架染色显示,体积比3∶1支架中大部分细胞呈短梭形,体积比2∶1、1∶1支架中的细胞呈星形或长梭形,细胞间建立了广泛的连接;(5)结果表明,三维载细胞多孔水凝胶支架有利于骨髓间充质干细胞的舒展和增殖,其中体积比为2∶1的支架兼顾了力学强度及生物学性能,是较为理想的三维细胞培养平台。

甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶介导的骨髓间充质干细胞增强肩袖损伤后愈合的研究

目的探索以甲基丙烯酸酐化明胶(Gelatin methacrylate,GelMA)水凝胶加载骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)的细胞治疗方法增强肩袖损伤后愈合的研究。方法分离培养并鉴定近交系Wistar大鼠BMSCs,以GelMA包裹细胞构建BMSCs/GelMA水凝胶,体外培养后以CCK-8法检测BMSCs/GelMA的细胞增殖情况,细胞骨架染色观察GelMA中的细胞形态。选用36只近交系Wistar大鼠,建立肩袖损伤模型,切断冈上肌肌腱止点,破坏纤维软骨层,并予腱-骨修复。实验分为3组(n=12):①BMSCs/GelMA组,修复术中加入BMSCs/GelMA水凝胶;②GelMA组,修复术中加入GelMA水凝胶;③对照组,仅行修复手术。术后2周和4周取材,以实时定量PCR检测腱-骨界面相关基因的表达情况。术后4周取材标本另行组织学检测和生物力学检测,以判断腱-骨愈合情况。结果本研究提取的BMSCs表现出多向分化潜能,BMSCs/GelMA水凝胶体外培养显示出良好的细胞增殖性和细胞形态。基因检测提示术后2周BMSCs/GelMA组中腱-骨相关基因的表达均上调,术后4周时BMSCs/GelMA组Ⅱ型胶原的表达明显高于术后2周(P<0.01)和其他组(P<0.05)。术后4周组织学染色均显示BMSCs/GelMA组的腱-骨界面有较多的纤维软骨形成和胶原沉积。术后4周三组的腱-骨生物力学检测结果无显著差异。结论GelMA水凝胶为BMSCs提供了合适的生长微环境;以GelMA加载BMSCs的方式修复肩袖损伤,显示出良好的软骨再生能力,表现出较好的腱-骨愈合效果。

力学性能可控的甲基丙烯酸化明胶(GelMA)人工软骨性能及软骨/骨表界面结合研究

目的 探寻优化骨表面力学匹配的软骨修复材料,并探讨软骨修复材料与骨结合的表界面性能,为软骨修复材料的设计及制备提供依据。方法 以明胶和甲基丙烯酸酐为原料,在明胶分子中引入双键结构,使用紫外光交联的方式制备甲基丙烯酸化明胶(GelMA)水凝胶。运用扫描电子显微镜、万能力学试验机分析水凝胶的形貌、孔径大小和力学性能;体外降解实验、体外拉伸实验评估水凝胶的降解和拉伸特性;黏附能力定性实验、三维立体光学显微镜和扫描电子显微镜评估水凝胶的黏附能力;细胞增殖测试和Live/Dead染色测定细胞活性和毒性。探讨了不同紫外光照时间下GelMA水凝胶的理化性能及软骨/骨材料结合的表界面结合性能,对性能适宜的修复材料进行了配比、力学优化。结果 紫外光照(UV)交联时间为1 min时水凝胶孔隙最大(110.25±6.51)μm,孔隙率高达(45.24±2.78)%;12 h时水凝胶的平衡溶胀比达(148.43±3.84)%;28 d失重率为(17.40±2.38)wt%;水凝胶的拉伸性能随紫外光照时间延长而逐渐增加;GelMA水凝胶对骨髓间充质干细胞增殖无明显抑制作用;水凝胶软骨修复材料与骨的结合良好,可黏附于仿生骨材料表面。结论 紫外光照交联时间1 min时GelMA水凝胶的吸水速率和平衡溶胀比最佳,降解速快,拉伸性能与天然软骨结构类似,具有良好的生物相容性,与骨修复材料力学匹配,该力学性能可控的GelMA水凝胶软骨修复材料为软骨/骨的连接及性能匹配提供了依据。

氧化铈纳米酶-甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶在小鼠全层皮肤缺损感染创面修复中的作用

目的探讨氧化铈纳米酶-甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)水凝胶(以下简称复合水凝胶)在小鼠全层皮肤缺损感染创面修复中的作用。方法该研究为实验研究。采用水热法制备粒径为(116±9)nm的氧化铈纳米酶,同时制备具有多孔网状结构且成胶性能良好的GelMA水凝胶。筛选出25μg/mL氧化铈纳米酶可明显促进人皮肤成纤维细胞增殖和具有较高的超氧化物歧化酶活性,将其加入GelMA水凝胶中制备复合水凝胶。计算用磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡3、7 d后复合水凝胶中氧化铈纳米酶的释放百分比。将小鼠红细胞悬液分为用相应溶液处理的PBS组、Triton X-100组、氧化铈纳米酶组、GelMA水凝胶组及复合水凝胶组,利用酶标仪检测处理1 h后红细胞的溶血情况。测定用PBS、氧化铈纳米酶、GelMA水凝胶及复合水凝胶培养耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和大肠埃希菌2 h后的细菌浓度。以上实验样本数均为3。取24只8周龄雄性BALB/c小鼠,在背部对称位置各制备1个用MRSA感染的全层皮肤缺损创面。将小鼠分为不进行药物干预的对照组及滴加相应溶液的氧化铈纳米酶组、GelMA水凝胶组和复合水凝胶组,每组6只小鼠。观察伤后3、7、14 d创面愈合情况并测量伤后3、7 d剩余创面面积(样本数为5)。取小鼠伤后3 d创面分泌物,检测MRSA的浓度(样本数为3),采用激光散斑血流成像系统观测小鼠伤后5 d创面血流灌注量(样本数为6)。伤后14 d,取小鼠创面组织,行苏木精-伊红染色观察新生上皮情况,行Masson染色观察胶原情况(样本数均为3)。结果浸泡3、7 d后,复合水凝胶中氧化铈纳米酶释放百分比分别约为39%、75%。处理1 h后,与Triton X-100组比较,PBS组、GelMA水凝胶组、氧化铈纳米酶组及复合水凝胶组红细胞溶血程度均明显下降(P<0.05)。与用PBS培养比较,用氧化铈纳米酶、GelMA水凝胶、复合水凝胶培养2 h的MRSA、大肠埃希菌浓度均明显降低(P<0.05)。伤后3~14 d,4组小鼠创面均逐渐愈合,复合水凝胶组小鼠伤后14 d创面全部愈合。伤后3、7 d,复合水凝胶组小鼠剩余创面面积分别为(29±3)、(13±5)mm^(2),明显小于对照组的(56±12)、(46±10)mm^(2)和氧化铈纳米酶组的(51±7)、(38±8)mm^(2)(P值均<0.05),与GelMA水凝胶组的(41±5)、(24±9)mm^(2)相近(P值均>0.05)。伤后3 d,复合水凝胶组小鼠创面MRSA浓度明显低于对照组、氧化铈纳米酶组、GelMA水凝胶组(P值均<0.05)。伤后5 d,复合水凝胶组小鼠创面血液灌注量明显大于对照组、氧化铈纳米酶组、GelMA水凝胶组(P值均<0.05)。伤后14 d,复合水凝胶组小鼠创面基本完成上皮化,上皮化情况明显优于其他3组;复合水凝胶组小鼠创面胶原含量较其他3组明显增多,排列也更为有序。结论复合水凝胶具有良好的生物相容性和体内外抗菌效果,可持续缓释氧化铈纳米酶,改善早期创面血流灌注,促进创面再上皮化及胶原合成,从而促进小鼠全层皮肤缺损感染创面愈合。

甲基丙烯酸酐化明胶-甲壳素纳米晶须生物墨水的特性和3D打印效果

目的探讨由甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)和甲壳素纳米晶须(ChiNC)组成的混合生物墨水的物理特征、生物相容性,以及3D打印效果。方法2021年5月至2022年12月,于100mg/mlGelMA生物墨水中添加ChiNC,制备成ChiNC浓度分别为5、10、20mg/ml的混合生物墨水,分别命名为GC5、GC1O、GC20组,与未添加ChiNC的GelMA生物墨水(CCO组)共同实验。采用扫描电镜观察4组生物墨水光固化后形成的水凝胶的横截面,计算孔隙率。称量各组水凝胶溶胀前后质量,计算平衡溶胀比。将4组生物墨水加入48孔板中,光固化成水凝胶,表面种植入脐静脉内皮细胞(HUVECs),于培养基中培养至第1、3、7天分别行CCK-8实验检测吸光度A值,比较4组水凝胶中细胞的增殖速度。4组生物墨水中添加HUVECs,打印网格状支架,于培养基中培养至第1、7天分别行Live-Dead染色,观察细胞存活率。采用打印挤出成丝实验,观察各组生物墨水挤出时的连续成丝性,比较各组的打印效果。采用最佳配比的混合生物墨水3D打印模拟膀胱壁黏膜层、黏膜下层和肌层解剖结构的组织工程膀胱补片,观察打印结构的稳定性和保真度,验证混合生物墨水打印多层复杂结构的可行性。结果扫描电镜观察结果显示,GCO、GC5、GC1O、GC20组水凝胶的孔隙率分别为(51.43±6.23)%、(51.85±6.47)%、(50.55±4.59)%和(42.49±2.20)%,GC0组与其他3组比较差异均无统计学意义(P=0.9994、P=0.9948、P=0.1200)。GC0组平衡溶胀比为9.37±0.49,低于GC5组(8.81±0.41,P=0.0457)、GC10组(7.95±0.19,P<0.01)、GC20组(7.71±0.14,P<0.01),差异均有统计学意义。CCK-8检测结果显示,GCO、GC5、GC10、GC20组培养第1天的吸光度A值分别为0.357±0.0070.350±0.012、0.360±0.009、0.345±0.018,GC10组与其他3组比较差异均无统计学意义(P=0.9332、P=0.5464、P=0.4937);培养第3天的吸光度A值分别为0.634±0.010、0.704±0.009、0.755±0.012、0.653±0.015,GC10组与其他3组比较差异均有统计学意义(P<0.01、P=0.0033、P=0.0002);培养第7天的吸光度A值分别为0.846±0.026、0.930±0.043、1.001±0.031.0.841±0.024,GC10组与其他3组比较差异均有统计学意义(P=0.0012、P=0.1390、P=0.0010)。GCO、CC5、GC10、CC20组培养第1天的HUVECs细胞存活率分别为(90.13±1.63)%、(90.6±2.45)%、(92.58±2.15)%、(91.40±3.17)%,GC0组与其他3组比较差异均无统计学意义(P=0.9869、P=0.3093、P=0.8008);培养第7天的细胞存活率分别为(89.97±3.10)%、(92.18±2.21)%、(92.05±2.25)%、(90.12±1.97)%GC0组与其他3组比较差异均无统计学意义(P=0.3965、P=0.4511、P=0.9995)。打印挤出成丝测试结果显示,GC0组在24℃~25℃时挤出连续且能成丝,GC10组在24℃~27℃时挤出连续且能成丝。使用CC10组打印组织工程膀胱补片,结果显示打印的补片稳定,无塌,保真度高。结论在GelMA中添加ChiNC能促进细胞黏附、增殖,扩大GelMA生物墨水的打印窗口。在GelMA中添加10mg/ml ChiNC制备的混合生物墨水的生物相容性良好,能打印模拟天然膀胱壁解剖结构的组织工程膀胱补片。

负载ZIF-8的GelMA水凝胶制备及其药物缓释性能和抑菌作用评价

目的:制备一种含沸石咪唑类骨架材料8(ZIF-8)的复合光交联水凝胶,评价其体外细胞毒性、药物释放能力和抗菌性能。方法:采用水热法合成ZIF-8颗粒,扫描电子显微镜(SEM)观察ZIF-8颗粒微观形态表现。将ZIF-8颗粒以质量分数0.2%的比例与甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)混合获得复合水凝胶GelMA-Z。采用原子吸收光谱法检测各时间点GelMA-Z中锌离子(Zn^(2+))累计释放量。NIH-3T3细胞分为对照组、GelMA组和GelMA-Z组,将GelMA和GelMA-Z与NIH-3T3细胞共培养1、3和7 d,采用CCK-8法检测各组细胞存活率。大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)分为对照组、GelMA组和GelMA-Z组,将GelMA和GelMA-Z分别与E.coli和S.aureus共培养6、12和24 h,采用酶标仪检测不同时间点各组细菌活性,采用平板抑菌实验和活/死细菌染色实验检测各组细菌菌落形成情况和活/死细菌染色情况。结果:SEM观察,采用水热法合成的ZIF-8颗粒具有均匀的粒径。原子吸收光谱法检测,GelMA-Z中Zn^(2+)在1 d内呈突释阶段后缓慢释放,7 d左右达到平衡。与对照组比较,1、3和7 d时GelMA组和GelMA-Z组细胞存活率均大于90%,差异无统计学意义(P>0.05)。酶标仪检测菌液活性,与细菌共培养6、12和24 h时,与对照组和GelMA组比较,GelMA-Z组E.coli和S.aureus活性明显降低(P<0.05)。平板抑菌实验,GelMA-Z组中菌液涂布后形成的菌落数明显少于对照组和GelMA组。活/死细菌染色实验,GelMA-Z组存在大量红色荧光染色的死细菌,对照组和GelMA组中则为大量绿色荧光染色的活细菌。结论:负载ZIF-8的GelMA水凝胶可实现原位光交联,具有良好的Zn^(2+)释放能力和抗菌性,是一种可用于感染伤口治疗的新型水凝胶敷料。

生物3D打印仿生支架促进肩袖损伤后的愈合

背景:大多数肩袖损伤发生于冈上肌腱,由于肌腱组织缺少血管以及肩袖复杂的解剖结构,临床治疗效果非常有限。组织工程技术和干细胞生物学的快速发展为提高肌腱修复质量带来了新的希望。目的:通过生物3D打印技术制备人脐带间充质干细胞/甲基丙烯酸酐化明胶复合支架,观察该支架修复肩袖损伤的效果。方法:(1)体外细胞实验:制备明胶微载体,将人脐带间充质干细胞接种于明胶微载体表面构建组织工程化干细胞。制备甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶打印墨水,使用甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶打印墨水重悬组织工程化干细胞,放入3D打印机的生物墨水容器中进行打印,蓝光照射固化5 min后即得人脐带间充质干细胞/甲基丙烯酸酐化明胶复合支架。通过死活染色、CCK-8实验检测支架内人脐带间充质干细胞的活性。(2)动物体内实验:采用随机区组设计方法将24只SD大鼠随机4组,每组6只:正常组不进行任何处理,肩袖损伤组、单纯支架组、细胞支架组建立冈上肌腱撕裂的肩袖损伤模型,单纯支架组、细胞支架组造模后分别将甲基丙烯酸酐化明胶支架、人脐带间充质干细胞/甲基丙烯酸酐化明胶复合支架植入肌腱损伤处。术后4周,分别进行大鼠行为学测试及肩袖冈上肌腱组织学病理组织形态观察。结果与结论:(1)体外细胞实验:死活染色结果显示,明胶微载体可减轻3D打印过程对人脐带间充质干细胞造成的损伤,随着培养时间的延长,支架内的人脐带间充质干细胞存活率升高;CCK-8实验结果显示,随着培养时间的延长,支架内的人脐带间充质干细胞活性无明显变化。(2)动物体内实验:行为学测试结果显示,相较于肩袖损伤组、单纯支架组,细胞支架组大鼠四肢运动功能明显改善;肩袖冈上肌腱苏木精-伊红与Masson染色结果显示,相较于肩袖损伤组、单纯支架组,细胞支架组肌纤维排列较规律,无明显的炎性细胞浸润,胶原容积百分比降低;免疫荧光染色结果显示,相较于肩袖损伤组、单纯支架组,细胞支架组肩袖冈上肌腱内白细胞介素6、肿瘤坏死因子α蛋白表达明显降低。(3)结果表明,生物3D打印的人脐带间充质干细胞/甲基丙烯酸酐化明胶复合支架可促进肩袖损伤组织修复再生。

原位交联含氧化石墨烯的甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶对小鼠全层皮肤缺损创面血管化的影响

目的制备含氧化石墨烯(GO)的甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)水凝胶并探讨原位光聚合GO-GelMA复合水凝胶对小鼠全层皮肤缺损创面血管化的影响。方法采用实验研究方法。将0.2 mg/mL的GO溶液50μL均匀涂抹于导电胶上,烘干后于场发射扫描电子显微镜下观察GO的结构和大小。将人皮肤成纤维细胞(HSF)分为采用相应终质量浓度GO处理的0μg/mL GO(不加GO溶液,下同)组、0.1μg/mL GO组、1.0μg/mL GO组、5.0μg/mL GO组、10.0μg/mL GO组,用酶标仪检测细胞培养48 h的吸光度值,以此表示细胞增殖活性(样本数为6)。将HSF和人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)分别分为采用相应终质量浓度GO处理的0μg/mL GO组、0.1μg/mL GO组、1.0μg/mL GO组、5.0μg/mL GO组,采用划痕试验检测划痕后24、36 h HSF的迁移率(样本数为5)及划痕后12 h HUVEC的迁移率(样本数为3),采用酶联免疫吸附测定法检测培养4、6、8 h后HSF分泌的血管内皮生长因子(VEGF)水平(样本数为3)。将配制的含相应终质量浓度GO的GO-GelMA复合水凝胶设为0μg/mL GO复合水凝胶组、0.1μg/mL GO复合水凝胶组、1.0μg/mL GO复合水凝胶组、5.0μg/mL GO复合水凝胶组,观察其交联前后的性状,检测用磷酸盐缓冲液浸泡3、7 d后GO的释放情况(样本数为3)。在16只6周龄雌性C57BL/6小鼠背部制作全层皮肤缺损创面,将采用原位交联的含相应终质量浓度GO的GO-GelMA复合水凝胶处理的小鼠按随机数字表法分为0μg/mL GO复合水凝胶组、0.1μg/mL GO复合水凝胶组、1.0μg/mL GO复合水凝胶组、5.0μg/mL GO复合水凝胶组,每组4只,观察治疗3、7、14 d创面大体情况并计算创面愈合率,采用激光多普勒血流仪检测治疗3、7、14 d创面血流灌注并计算平均灌注单位(MPU)比值,采用苏木精-伊红染色观察治疗7 d创面血管新生情况并计算血管密度(样本数均为3)。取0μg/mL GO复合水凝胶组和0.1μg/mL GO复合水凝胶组治疗7 d的创面组织,采用苏木精-伊红染色观察GO分布与血管新生的关系(样本数为3),行免疫组织化学染色后观察VEGF的表达。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析、Tukey法。结果GO为多层片状结构,宽度约为20μm、长度约为50μm。培养48 h,10.0μg/mL GO组HSF的吸光度值明显低于0μg/mL GO组(q=7.64,P<0.01)。划痕后24 h,4组HSF迁移率相近(P>0.05);划痕后36 h,0.1μg/mL GO组HSF迁移率明显高于0μg/mL GO组、1.0μg/mL GO组、5.0μg/mL GO组(q值分别为7.48、10.81、10.20,P值均<0.01)。划痕后12 h,0.1μg/mL GO组HUVEC迁移率明显高于0μg/mL GO组、1.0μg/mL GO组、5.0μg/mL GO组(q值分别为7.11、8.99、14.92,P值均<0.01),5.0μg/mL GO组HUVEC迁移率明显低于0μg/mL GO组和1.0μg/mL GO组(q值分别为7.81、5.33,P<0.05或P<0.01)。培养4、6 h,4组HSF的VEGF表达均相近(P>0.05);培养8 h,0.1μg/mL GO组HSF的VEGF表达明显高于0μg/mL GO组和5.0μg/mL GO组(q值分别为4.75、4.48,P值均<0.05)。4组GO-GelMA复合水凝胶在交联前均呈红色液体状,交联后呈微黄色凝胶状且流动性无明显差异。0μg/mL GO复合水凝胶组复合水凝胶各时间点均无GO释放,其余3组GO-GelMA复合水凝胶中的GO于浸泡3 d部分释放,至浸泡7 d全部释放。治疗3~14 d,4组小鼠创面可见水凝胶敷料覆盖在位并保持湿润,创面逐渐愈合。治疗3、7、14 d,4组小鼠创面愈合率均相近(P>0.05)。治疗3 d,0.1μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面MPU比值明显高于0μg/mL GO复合水凝胶组、1.0μg/mL GO复合水凝胶组、5.0μg/mL GO复合水凝胶组(q值分别为10.70、11.83、10.65,P<0.05或P<0.01)。治疗7、14 d,4组小鼠创面MPU比值均相近(P>0.05)。0.1μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面治疗7 d的MPU比值明显低于治疗3 d(q=14.38,P<0.05),治疗14 d的MPU比值明显低于治疗7 d(q=27.78,P<0.01)。治疗7 d,0.1μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面新生血管密度为每200倍视野下(120.7±4.1)根,明显高于0μg/mL GO复合水凝胶组、1.0μg/mL GO复合水凝胶组、5.0μg/mL GO复合水凝胶组的每200倍视野下(61.7±1.3)、(77.7±10.2)、(99.0±7.9)根(q值分别为12.88、7.79、6.70,P值均<0.01);1.0μg/mL GO复合水凝胶组和5.0μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面新生血管密度均明显高于0μg/mL GO复合水凝胶组(q值分别为5.10、6.19,P<0.05)。治疗7 d,相较于0μg/mL GO复合水凝胶组,0.1μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面中成簇新生血管更多,且聚集于GO附近;0.1μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面中GO和新生血管分布区域有大量VEGF表达。结论GO质量浓度低于10.0μg/mL对HSF增殖活性无明显影响,0.1μg/mL的GO能够促进HSF和HUVEC迁移,能促进HSF分泌VEGF。原位光聚合GO-GelMA复合水凝胶敷料能够通过促进小鼠全层皮肤缺损创面血管新生,增加创面早期血流灌注,且GO对新生血管有富集作用,其机制可能与GO促进创面细胞分泌VEGF相关。

甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶在创面修复领域中的应用研究进展

创面修复是临床中常见难题,严重影响患者生活质量,也给社会带来沉重负担。基于水凝胶开发的多功能敷料在治疗急性和慢性创面中显示了较强的潜力。甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)水凝胶除具备良好的组织相容性、细胞黏附性和生物可降解性等优势外,还因成本低廉、反应条件温和、理化性质可调节、临床应用广泛等而备受关注。该文介绍了GelMA水凝胶的特征及其在创面修复领域中的应用研究进展,并对用于治疗创面的多功能GelMA水凝胶敷料的未来发展进行了展望。

甲基丙烯酸酐化明胶/海藻酸钠纳米复合水凝胶对小鼠前成骨细胞增殖分化的影响

目的制备甲基丙烯酸酐化明胶(gelatin methacrylate,GelMA)、海藻酸钠(sodium alginate,Alg)及纳米羟基磷灰石(nano-hydroxyapatite,nHA)复合水凝胶材料(GelMA-Alg-nHA),对其理化性能、细胞相容性及成骨分化作用进行研究。方法通过紫外光交联制备GelMA-Alg-nHA复合水凝胶。将实验材料分为GelMA、GelMA-nHA、GelMA-Alg和GelMA-Alg-nHA 4组,通过扫描电子显微镜、力学测试对其进行结构表征和性能测试。通过体外细胞实验检测4组水凝胶对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1细胞活性、黏附、增殖及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的影响。结果各组水凝胶均具有多孔结构,GelMA-Alg-nHA水凝胶较其余几组水凝胶孔径略小,孔洞表面更粗糙,材料强度与GelMA比较从(9.75±1.27)kPa提高到(30.02±2.41)kPa(P<0.001)。体外实验显示,GelMA-Alg-nHA水凝胶具有良好的生物相容性,促进成骨细胞的增殖分化的能力更强(P<0.001)。结论GelMA-Alg-nHA水凝胶具有良好的生物相容性和诱导MC3T3-E1成骨分化的能力,可成为潜在的骨缺损修复材料。

负载姜黄素可注射微球延缓椎间盘的退变

背景:椎间盘退变机制复杂,炎症通路激活、炎症因子泛滥、活性氧过度积累等均可加速椎间盘退变进程。姜黄素是从中药材姜黄中提取的天然药物,具有抑制炎症、抗氧化应激等药理作用。目的:探讨负载姜黄素的缓释微球局部注射延缓大鼠椎间盘退变的疗效。方法:①采用微流控技术制备负载姜黄素的甲基丙烯酸酰化明胶缓释微球,评估其体外释药和降解情况;②将缓释微球与未载药微球分别与髓核细胞共培养,以单独培养的细胞为对照,将3组细胞分别培养于正常环境和氧化应激环境(加入H_(2)O_(2))中,通过CCK-8、活/死染色实验评估细胞的活性与增殖情况,qRT-PCR实验检测相关因子的表达水平;③将30只SD大鼠随机分为正常组、退变组、未载药微球组、姜黄素组、缓释微球组,每组6只,在大鼠尾椎7-8和8-9节段经皮穿刺建立椎间盘退变模型,未载药微球组、姜黄素组、缓释微球组退变的椎间盘内注射对应的溶液。4周后,通过影像学与组织学观察椎间盘组织结构改变。结果与结论:①缓释微球可缓慢持续释放姜黄素,至28 d时释放姜黄素总量为(84.11±2.71)%;在含有胶原酶的PBS中,缓释微球质量逐渐减小,至第5周时消失。②CCK-8和活/死染色实验显示,在正常环境下,缓释微球不会影响髓核细胞的增殖活力;在氧化应激环境下,相比未载药微球,缓释微球可维持髓核细胞的增殖活力。qRT-PCR实验显示,相较于正常环境,氧化应激环境激活了髓核细胞中多种炎症因子mRNA的过量表达;在氧化应激环境下,相较于未载药微球组与对照组,缓释微球组肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6及基质金属蛋白酶3的mRNA表达降低,Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的mRNA表达升高。③动物体内实验结果显示,未载药微球组4周后的影像学与组织学评估与退变组比较无明显差异;姜黄素组的椎间隙高度及MRI评分在第1周时较退变组和未载药微球组虽有一定程度改善,但在第4周时其影像学与组织学评估均不如缓释微球组。④结果表明,姜黄素缓释微球能够抑制H_(2)O_(2)诱导的髓核细胞凋亡、延缓椎间盘退变进程,其机制与抑制核因子κB通路、降低氧化应激水平有关。

3D生物打印构建复层尿道组织的初步研究

目的探讨利用生物打印体外构建具有复层结构的尿道空腔组织的可行性。方法将7%GelMA和2%Alginate制备复合水凝胶,分别同绿色和红色的microbeads或2×106 cells/mL尿道上皮细胞和尿道平滑肌细胞混匀,通过本实验室改进的同轴多通道打印系统,以10～20μL/min的速度推进内、外层,以80～200μL/min的速度推进CaCl2,边打印边交联;打印后不含细胞的空腔结构,置于荧光显微镜下观察;打印后含有细胞的组织,以尿道上皮细胞和尿道平滑肌细胞混合培养液于六孔板内体外培养,分别于第0～7天live/dead染色检测细胞活力,F-actin染色检测细胞铺展情况;将培养24 h的打印后组织,予以红色颜料灌注。结果复合水凝胶混合microbeads后,荧光显微镜下可以清楚看到内、外双层结构,复层管腔的内、外径分别为(663.66±51.74)μm和(976.84±63.43)μm,内外亚层壁厚分别为(62.06±10.45)μm和(93.78±10.25)μm。尿道细胞在第0天和第7天的细胞活力分别为84.52%和86.26%,免疫荧光染色第7天F-actin染色铺展均匀,提示细胞铺展生长。灌注过程中,打印后空腔组织内红色灌注液可以顺利通过管腔结构,颜料并无外溢,管壁无破损。结论利用复合水凝胶和同轴多通道生物打印系统可以初步构建尿道空腔结构,打印后尿道细胞可在空腔结构内长期存活。

基于增材制造技术的GelMA/HA水凝胶支架的制备及其研究

目的利用增材制造技术制备甲基丙烯酸酯化明胶/羟基磷灰石(GelMA/HA)复合水凝胶支架,通过微观结构表征和生物相容性测试,探究其作为骨组织工程修复支架的可行性。方法将GelMA溶液和HA颗粒混合形成均匀的生物墨水,利用增材制造技术制备GelMA/HA水凝胶支架。采用扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)对复合支架及其成分进行表征。采用万能力学实验机测试样品抗压缩性能。利用CCK-8法和活/死细胞染色检测支架的细胞相容性。通过碱性磷酸酶(ALP)染色法探究其促BMSCs成骨分化的能力。结果GelMA/HA水凝胶支架内部呈清晰的多孔网格状结构,与纯GelMA支架比较,抗压性能提高。活死细胞染色实验显示,BMSCs在复合水凝胶支架上生长良好,培养7 d后细胞在支架上铺展呈梭形形态。细胞增殖实验显示,培养3、7 d的纯GelMA水凝胶支架组及GelMA/HA复合水凝胶支架组的BMSCs增殖快于空白组(P<0.05)。ALP染色实验结果表明,与空白组和纯GelMA水凝胶支架组比较,GelMA/HA复合水凝胶支架组的ALP阳性面积增加(P<0.05)。结论GelMA/HA复合水凝胶支架具有良好的生物相容性,并且对BMSCs的成骨分化具有促进作用,具备作为填充修复支架应用于骨组织工程的潜力。

3D生物打印复层空腔组织的初步研究

目的探讨利用生物打印系统一次性同步快速构建复层管状结构的可行性。方法将不同浓度的海藻酸盐和GelMA配比,进行生物力学检测,确定复合水凝胶打印的可行性;将水凝胶分别混合示踪剂及标记细胞,打印具有双层结构空腔管状结构,进行细胞活力检测并验证可灌注性。结果复合水凝胶杨氏模量为(8.78±1.73)×10-3 MPa,较单纯Gel MA的(2.38±0.69)×10-3 MPa和单纯海藻酸盐的(0.83±0.24)×10-3 MPa有明显统计学差异;同轴打印内外复层结构的壁厚分别为(62.06±0.45)μm和(93.78±10.25)μm;内、外管的管径分别为(663.66±51.74)μm和(976.84±63.44)μm;外管(红色微珠颗粒标识)和内管(绿色微珠颗粒标识)具有明显的分层差异;3T3细胞分别在内、外层同时打印后,体外培养1周,第1、3、7天细胞活力可以维持在(88.50%±5.8%)、(85.57%±6.22%)和(96.29%±2.64%);复层管状结构橙色溶液灌注,复层管壁完整性良好,未见明显液体渗出。结论本实验利用复合水凝胶构建复层空腔组织,打印后空腔组织内细胞能够长期存活,并具有一定的灌注功能。

GelMA/PBS复合水凝胶的制备及性能研究

天然水凝胶具有良好的生物相容性和生物降解性,在组织工程软骨修复手术中具有巨大的应用潜力。但是,天然水凝胶与人体组织在力学性能方面存在一定差异性,从而限制了天然水凝胶在组织工程中的应用。选择具有优异生物性能的甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)代替天然水凝胶,以聚丁二酸丁二醇酯(PBS)和GelMA水凝胶为原料,采用紫外光交联的方法共混,制备了具有优良力学性能和生物性能的GelMA/PBS复合水凝胶。通过扫描电子显微镜、X射线衍射仪、热重分析仪、差示扫描量热仪对GelMA/PBS复合水凝胶的结构和性能进行研究。结果表明,当GelMA与PBS质量比为1∶4时,复合水凝胶的结晶度最高,生物相容性最好,有效增强了复合水凝胶的机械性能。

GelMA水凝胶移植修复椎间盘退变的研究进展

下腰痛是一组以下背部、腰骶部和臀部疼痛为主要症状的疾病,伴或不伴下肢放射痛。近年来,下腰痛的发病率逐年上升,已成为影响人类健康的重要疾病之一。椎间盘退变(IVDD)是导致下腰痛的重要原因,在生活方式、遗传因素等共同作用下,椎间盘(IVD)组织出现生物力学和结构变化,从而导致下腰痛发生。保守治疗是IVDD最主要的治疗方式,但当保守治疗效果欠佳时,需接受外科手术治疗。IVDD外科手术可能导致术后炎症反应、骨不融合等并发症,这些并发症一直是临床医生面临的难题。甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)水凝胶是一种光敏性的生物水凝胶材料,具有良好的生物相容性,在可见光或紫外光下能够快速固化,形成适合细胞增殖、分化且具有一定强度的三维结构,被广泛用于IVDD的动物研究。近年研究发现,GelMA水凝胶既可作为携带生长因子的载体,诱导成骨分化,促进骨愈合,又可通过负载药物抑制IVD炎症反应,减少术后并发症的发生。同时,GelMA水凝胶还可负载IVD细胞,从而有效补充外科手术过程中丢失的IVD细胞和细胞外基质成分。此外,GelMA水凝胶还能构建IVD适宜微环境,3D打印IVD,从而形成IVD移植的组织再生支架。因此,GelMA水凝胶移植有可能成为外科治疗IVDD的有效手段。

GelMA复合凝胶的挤出式3D打印工艺及其性能研究

甲基丙烯酸酐明胶(Methacrylated gelatin,Gel MA)是具有光敏官能团的改性明胶,有良好的生物相容性,广泛用于构建皮肤、神经等软组织支架。然而,光照交联单一成分的GelMA,其力学性能和结构维持性较差,难以通过挤出3D打印成形生物支架。提出一种适用于挤出式打印且力学性能增强的GelMA复合凝胶,其主要成分为GelMA、明胶和海藻酸钠。黏度测试试验筛选出适合挤出3D打印的复合材料配比,3D打印工艺试验研究和分析了打印气压、喷头移动速度、喷头高度、光照条件对挤出连续性和微丝直径的影响。当喷头内径为200μm时,GelMA复合凝胶实现顺畅出丝(φ293~1211μm)的条件为气压在0.05~0.25 MPa,打印速度为1~15 mm/s,喷头高度为200~600μm,光照强度为70~272.56 mW/cm^2。拉伸试验表明光照交联后,复合凝胶较之同浓度Gel MA(5%,w/v)的弹性模量提高近1倍,伸长率保持一致。细胞培养试验显示GelMA复合凝胶具有良好的生物相容性,包埋在其内部的人真皮成纤维细胞培养至第7天时存活率达85%。