ID4基因甲基化定量PCR检测在急性白血病中的临床意义

尽管治疗的进步极大地改善了急性白血病患者的预后和生存,但时至今日多数类型的急性白血病没有特异性的生物标记,因此对于多数白血病患者,影响生存的复发这一重要因素缺少有效的预警机制。ID4基因启动子区甲基化广泛发生于各类型急性白血病。本研究在前期建立的甲基化定量PCR体系的基础上,用该方法检测患者骨髓样本,探讨ID4甲基化定量指标(percentage of methylated reference,PMR)的临床意义。采集我院门诊及住院确诊的初治、完全缓解、复发3个阶段的急性白血病患者骨髓样本及正常对照者骨髓样本。应用ID4甲基化定量PCR体系对样本进行检测。按初治、完全缓解、复发分组比较PMR值。比较相同病例不同疾病状态的PMR的动态变化。结果表明,初治组PMR最高,其次为复发组,而完全缓解组最低。初治组PMR与完全缓解组比较存在统计学差异。4例随访病例的PMR值波动与病情变化一致。在1例复发病例中,PMR升高早于骨髓细胞学检查确认复发1.7个月。结论:本研究通过ID4基因启动子区甲基定量检测的方法初步验证:甲基化水平的量化指标PMR值与急性白血病患者肿瘤细胞负荷关系密切。PMR动态监测波动与疾病变化一致,可能具有预测复发的作用,但ID4甲基化定量指标的临床价值还有待进一步研究证据的支持。

急性白血病细胞中ID4基因甲基化的PCR定量检测系统的建立及其特异性和敏感性

ID4基因启动子区甲基化发生率在急性白血病中极高,甲基化程度与急性白血病关系密切。因缺少合适的研究方法,其具体的甲基化量化水平与疾病的关系,人们一直缺乏认识。本研究旨在建立ID4甲基化定量PCR体系,同时验证该方法的特异性及敏感性,并初步尝试在初治急性白血病骨髓样本中评估ID4的甲基化水平。首先构建质粒并建立体系标准曲线,分别使用MSP和定量MSP对细胞系样本进行检测,以传统MSP的结果为对照,验证新方法的特异性;按不同比例将甲基化阴性和阳性细胞混合,用甲基化定量PCR扩增验证新方法敏感性。结果表明,本研究成功建立了符合绝对定量要求的标准曲线;通过细胞系验证,MSP结果与定量MSP结果完全一致;同时在甲基化阴性细胞背景下,定量MSP可以稳定的检测到1∶10-5水平的ID4甲基化阳性细胞。在急性白血病骨髓样本检测中,定量MSP甲基化阳性检出率高于MSP。结论:本研究成功建立了完整的ID4基因甲基化定量PCR体系,该方法特异性好、敏感性高。

甲基化DNA免疫沉淀-荧光实时定量PCR检测人精浆游离DNA睾丸和附睾特异性甲基化启动子

目的:建立检测精浆游离DNA(cfsDNA)启动子甲基化水平的甲基化DNA免疫沉淀-荧光实时定量PCR(MeDIP-qPCR)方法。方法:提取精液参数正常(6例)和输精管结扎(6例)男性的cfsDNA,将两组不同个体的cfsDNA分别进行混合,超声处理后形成DNA片段,通过MeDIP分离甲基化DNA片段,然后用qPCR方法检测启动子甲基化水平。结果:精液参数正常组的PRAME、PEG10、MORC1、GML、HOXA5、DNMT3L、SNURF、MSH4、DAZ1和CLPB启动子甲基化水平分别为14.93%、2.64%、0.69%、2.66%、17.50%、21.10%、5.98%、2.28%、13.50%和3.86%,明显低于输精管结扎组的121.25%、73.62%、16.25%、42.90%、76.74%、112.40%、59.79%、25.85%、91.90%和64.53%。其中,PRAME、MORC1、GML、HOXA5、DNMT3L、SNURF、MSH4和DAZ1等8个启动子MeDIP-qPCR的检测结果与启动子甲基化芯片结果一致。结论:通过MeDIP-qPCR方法可以定量检测到cfsDNA中的特异性启动子甲基化,为确定cfsDNA中睾丸和附睾特异性甲基化启动子提供了有效途径。

甲基化荧光定量PCR快速检测自闭症男童中脆性X综合征的临床应用

目的建立一种经济、快速的检测男性脆性X综合征检测方法。方法应用甲基化实时荧光定量PCR法(qMSP)检测已知脆性X综合征男性患者和正常男性的脆性X智力低下基因1(FMR1)启动子区甲基化状态,测试该方法的灵敏度和特异性。应用该方法对特殊学校54例自闭症男童进行病因学检查,并对阳性样本用侧翼PCR(F⁃PCR)进行复核。结果在特殊学校的54例自闭症男童样本中发现1例FMR1甲基化阳性,F⁃PCR方法复核为CGG重复数为全突变,其母亲为前突变携带者。结合临床症状,该自闭症男童可以确诊为脆性X综合征,检出率为1.85%(1/54)。结论本文所建立的qMSP方法可以对FMR1基因的CpG甲基化状态进行快速分析,可作为男性疑似脆性X综合征检测的可靠方法。

甲基化荧光定量PCR在消化系肿瘤中的应用

甲基化荧光定量PCR(MethyLight)是一种新的甲基化定量检测技术,该技术使用荧光标记探针(Taqman)对基因甲基化水平进行定量测定,具有实时监测、灵敏性高的特点,并可以对大规模的样本进行测定,在消化系肿瘤的诊断和治疗等方面有着广阔的应用前景。

多重MethyLight在结直肠癌相关基因ALX4和SEPT9甲基化检测中的应用

【目的】探讨多重Methy Light方法在检测结直肠癌(CRC)外周血ALX4、SEPT9基因甲基化状态中的价值,为CRC无创检测提供新方法。【方法】采用不同的荧光报告基团标记ALX4、SEPT9基因甲基化探针,利用高敏感性、高特异性的多重实时定量甲基化特异性PCR方法(MSP,Methy Light),同时检测ALX4、SEPT9基因在CRC外周血中的甲基化情况。【结果】ALX4、SEPT9基因可分别在48%(24/50),75%(38/50)的CRC患者外周血及6%(3/50),4%(2/50)的健康人群外周血中检测到甲基化;与健康人群相比,CRC患者外周血中ALX4、SEPT9基因的甲基化水平均明显升高(P<0.001)。【结论】利用多重Methy Light多基因联合检测技术,可高效特异地检测到CRC外周血中ALX4、SEPT9基因甲基化水平明显升高。

膀胱癌患者尿脱落细胞中TWIST1基因启动子甲基化的检测

目的:探讨膀胱癌患者尿脱落细胞TWIST1基因启动子甲基化在膀胱癌诊断中的价值。方法:实时荧光定量甲基化特异性聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative methylation specific PCR,qMSP)检测了50例膀胱癌患者,13例非肿瘤性尿路疾病患者和7例健康志愿者尿脱落细胞TWIST1基因启动子的甲基化状态。结果:50例膀胱癌患者,TWIST1基因启动子甲基化的有32例(64.0%),而20例对照者尿脱落细胞中均未检测到甲基化现象,差异有统计学意义(P<0.01)。TWIST1基因启动子甲基化与患者年龄相关(P<0.05)。结论:尿脱落细胞TWIST1基因启动子甲基化检测可作为膀胱癌早期诊断的生物学标志物。

MGMT、RASSF1A、FHIT基因启动子甲基化水平在非小细胞肺癌患者早期诊断中的意义

目的探讨DNA修复基因06-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)、Ras凋亡家族1A(RASSF1A)、脆性组氨酸三联体(FHIT)基因启动子甲基化水平在非小细胞肺癌(NSCLC)患者早期诊断中的意义。方法选取2016年2月至2018年2月在郑州市第六人民医院收治的136例NSCLC患者作为肺癌组,选取同期145例健康体检者作为对照组,采用实时荧光定量甲基化特异PCR(qMSP)法检测外周血DNA中MGMT、RASSF1A和FHIT基因启动子甲基化水平并进行分析。结果肺癌组MGMT、RASSF1A、FHIT基因启动子甲基化水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。肺癌组不同病理组织学类型MGMT、FHIT基因启动子甲基化水平比较,差异有统计学意义(P<0.05),肺癌组RASSF1A基因启动子甲基化水平与其临床分期有关(P<0.05)。NSCLC患者MGMT、RASSF1A、FHIT基因启动子甲基化水平联合检测灵敏度、阴性预测值、准确性高于单独检测,差异有统计学意义(P<0.05)。结论检测MGMT、RASSF1A和FHIT基因启动子甲基化水平对早期诊断NSCLC及鉴别临床病理组织学分型有一定的指导价值。

乳腺癌患者血清sCD146与组织MCAM基因甲基化状态和临床病理特征的关系

目的探讨乳腺癌患者血清可溶性CD146[又称为黑色素瘤细胞粘附分子(MCAM)](sCD146)水平与肿瘤组织MCAM基因甲基化状态及患者临床病理特征之间的关系。方法收集2019年5月至2020年5月在我院确诊并接受手术治疗的148例原发性乳腺癌患者的新鲜肿瘤组织和癌旁组织以及术前血液样本,另收集30例健康体检人群的血液样本作为正常对照组。采用甲基化定量PCR技术(qMSP)确定组织中MCAM基因甲基化程度,并采用ELISA法检测血清sCD146水平。用Pearson法分析乳腺癌患者两项指标之间的相关性。结果对于乳腺癌患者,血清sCD146水平高于正常对照组人群(P<0.05),且乳腺癌组织MCAM基因甲基化程度的中位数明显低于相应的癌旁组织(P<0.05)。血清sCD146水平与肿瘤组织中MCAM基因甲基化程度呈负相关性(r=-0.461,P<0.001)。此外,血清sCD146水平与肿瘤组织中MCAM基因甲基化程度与肿瘤T分期、分级、Ki-67表达及雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)表达有关(P<0.05)。而且三阴性乳腺癌患者血清sCD146水平和组织MCAM基因低甲基化率最高,显著高于Luminal A型和Luminal B-HER2-型(P<0.05)。结论乳腺癌患者血清sCD146水平较健康对照人群普遍升高,以三阴性乳腺癌患者升高最明显,这可能与肿瘤组织中MCAM基因发生去甲基化有关;而且血清sCD146水平也随着肿瘤T分期和组织学分级增加而逐渐升高。

ccfDNA中RERG甲基化状态检测在诊断鼻咽癌中的临床意义

目的研究循环细胞游离DNA(ccfDNA)中RAS样雌激素调节生长抑制因子(RERG)基因甲基化状态检测在诊断鼻咽癌中的临床意义。方法选取2020年1月至2021年6月在该院就诊的100例(病理学诊断)原发性鼻咽癌患者作为鼻咽癌组,同时选取97例非癌志愿者作为对照组。提取活检组织DNA和ccfDNA,通过实时荧光定量PCR法DNA甲基化分析(qAMP)检测组织DNA和ccfDNA中RERG mRNA甲基化率。绘制受试者工作特征(ROC)曲线评价ccfDNA中RERG mRNA甲基化率对鼻咽癌的诊断价值。结果基于TCGA数据库中来自于头颈部鳞状细胞癌(HNSC)组织标本的RNA-Seq转录本数据相应患者临床资料,HNSC组织标本中RERG mRNA表达明显低于正常组织,RERG mRNA甲基化β值高于正常组织(P<0.001)。在临床试验中,鼻咽癌组ccfDNA中RERG mRNA甲基化率高于对照组[0.127(0.095,0.175)vs.0.023(0.014,0.036),P<0.001]。经ROC曲线分析,检测ccfDNA中RERG mRNA甲基化率诊断鼻咽癌的曲线下面积(AUC)为0.990(95%CI:0.980~0.999)。ccfDNA和肿瘤组织中RERG mRNA甲基化率呈正相关(r=0.407,P<0.001)。鼻咽癌患者ccfDNA中RERG mRNA甲基化率在不同肿瘤T分期、N分期、TNM分期及EB病毒(EBV)DNA状态人群之间差异有统计学意义(P<0.05)。结论ccfDNA中RERG mRNA甲基化状态可能为鼻咽癌筛查中潜在的血液学生物标志物。