镉胁迫下萝卜基因组DNA甲基化敏感扩增多态性分析

应用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术分析了重金属镉(cd)胁迫处理后萝卜基因组DNA甲基化程度的变化。结果表明,经50、250和500mg/L CdCl_2处理后,MSAP比率分别为37%、43%和51%,均高于对照(34%);全甲基化率(双链C^mCGG)分别为23%、25%和27%,而其对照为22%,表明重金属CdCl_2胁迫后,某些位点发生了重新甲基化。萝卜叶片DNA中总甲基化水平的增加与CdCl_2处理浓度呈显著正相关。甲基化变异可分为重新甲基化、去甲基化、不定类型以及与对照相同的甲基化模式等类型,Cd胁迫处理引起的植株基因组DNA甲基化程度的提高主要是重新甲基化。

甲基化敏感扩增多态性技术(MSAP)在生态学中的应用

DNA甲基化是生物体内最为重要的表观遗传修饰形式之一,在生态学上的应用越来越广泛。在收集、整理生态表观遗传学相关文献的基础上,介绍了甲基化敏感扩增多态性技术(MSAP)的原理、优势与局限性及其在生态学上的应用和展望。MSAP因其应用广泛、操作简便等优点成为研究DNA甲基化水平的有力工具,特别是在探究生物体如何快速适应生境变化以及外来入侵生物如何突破遗传瓶颈等问题上。MSAP技术能够很好地揭示生物种群内部或种群之间的表观遗传差异,是对遗传多样性、遗传变异研究的有力补充。

绿色棉纤维发育过程中DNA表观遗传变化的甲基化敏感扩增多态性分析

【目的】分析绿色棉纤维发育过程中DNA甲基化状态差异。【方法】利用2组限制性内切酶Eco RⅠ/HpaⅡ和Eco RⅠ/MspⅠ对绿絮棉1号纤维基因组甲基化位点进行识别和切割,并采用甲基化敏感扩增多态性引物对切割产物进行扩增,分析基因组内5'-CCGG-3'位点的甲基化状态;同时对扩增的差异片段进行测序,分析其生物学功能。【结果】66对甲基化敏感扩增多态性引物共扩增出4112个条带;平均每个样品共扩增出822.4个带型,平均每对引物扩增出12.46个片段。随着绿色棉纤维的发育,甲基化条带总数、甲基化条带比率、全甲基化条带百分比均逐渐升高;其中,开花后10、15、20和25 d时甲基化条带总数分别比开花后5 d时增加11.45%,13.86%,20.10%和33.13%。与开花后5 d相比,开花后10、15、20和25 d时纤维DNA发生甲基化变化位点的比例分别为3.15%,3.43%,3.65%和2.52%;而去甲基化位点的比例分别为12.87%,14.72%,13.31%和48.81%。通过测序和Blast分析表明,17个片段与已知的功能基因同源性较高,包括棉花线粒体基因组、丝氨酸蛋白酶基因和酯酶基因,且这些基因均在开花后25 d发生去甲基化。【结论】绿色棉纤维发育过程中DNA发生了甲基化与去甲基化现象。

甲基化敏感扩增多态性技术检测体系的建立

为了获得理想的甲基化检测效果,通过调整基因组DNA用量、PCR试剂浓度等因素,优化了甲基化敏感扩增多态性技术(MSAP)体系。结果表明:基因组用量为250 ng,预扩与选扩体系分别采用Fermentas公司生产的PCR混合物1/2和1/4体系时,能得到理想的检测效果。

黄芪甲基化敏感扩增多态性(MSAP)扩增引物筛选及初步应用

[目的]建立并优化黄芪甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术扩增反应体系,对中药材黄芪甲基化水平进行研究。[方法]磁珠法提取黄芪DNA后,采用Hpa II/Msp I 2种内切酶进行酶切,将酶切产物加上连接接头序列,经预扩增和选择性扩增反应,最终从黄芪MSAP的256对引物中筛选出最佳分辨引物4对。应用筛选到的4对引物,分析12种不同产地黄芪的甲基化模式,并对甲基化水平聚类分析。[结果]经MSAP检测12个黄芪样本半甲基化率在12.5%~26.7%,全甲基化率在25.6%~51.1%,总甲基化率在48.7%~73.5%,总体上黄芪样本的全甲基化率大于半甲基化率。采用NTSYSpc软件对黄芪样品Hpa II和Msp I多态性数据进行分析,获得UPGMA聚类图和主成分分析PCA图。[结论]MSAP技术能够很好地用于黄芪的甲基化分析,结合NTSYSpc软件能对不同产地黄芪之间甲基化水平进行聚类分析,且初步分析结果表明从UPGMA和PCA图上来看,地区相近的单株聚类分析表现出了一定的地域性。

山核桃甲基化敏感扩增多态体系的建立与甲基化初步分析

山核桃Carya cathayensis为浙江省重要的经济树种。近年来细胞生物学及分子标记的研究发现,山核桃中存在无融合生殖,天然群体的多态性不佳,存在印迹数量性状位点(iQTLs)。iQTLs与DNA甲基化有关,而DNA甲基化对生物表观遗传调控起着重要的作用,是可遗传的生物现象。甲基化敏感扩增多态(MSAP)是基于PCR扩增多态性的DNA甲基化检测方法。在建立山核桃MSAP标记体系的基础上对来自3个天然居群的山核桃单株样品进行了分析。结果表明:山核桃存在甲基化,非甲基化相对水平大于总甲基化相对水平,且两者间差异极显著(Wilcoxon Rank Sum检验P<0.001),内侧胞嘧啶甲基化相对水平远大于半甲基化相对水平,且两者间差异极显著(分子方差分析及邓肯多重比较, P<0.001);天然居群山核桃内侧胞嘧啶甲基化相对水平高,则半甲基化相对水平和非甲基化相对水平则相对较低,反之亦然;居群间存在明显的表观遗传分化,主要变异存在于居群内。此外,山核桃的MSAP体系可用于薄壳山核桃Carya illinoensis, 2个物种在位点及位点数上存在差异。

不同致病力青枯雷尔氏菌的甲基化敏感扩增多态分析

【目的】探究不同致病力青枯雷尔氏菌连续传代过程中致病力、DNA甲基化水平与模式的变化。【方法】将不同致病力青枯雷尔氏菌连续传代培养50次,通过弱化指数(attenuated index,AI)和接种番茄盆栽苗,分析其F_(1)和F_(50)菌株致病力变化;采用甲基化敏感扩增多态(methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术分析不同致病力和传代数青枯雷尔氏菌DNA甲基化水平变化;利用荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)技术分析DNA甲基化和去甲基化相关酶基因的表达量变化。【结果】经连续传代50次后,强致病力菌株FJAT15304和过渡型菌株FJAT445均变为无致病力菌株,而无致病力菌株FJAT15249仍然保持其无致病力特性。MSAP分析显示,与F_(1)菌株相比,强致病力菌株传代50次的FJAT15304.F_(50)和致病力衰退型菌株传代50次的FJAT445.F_(50)的总甲基化率分别增加7.82%和38.22%;无致病力菌株FJAT15249的F_(1)和F_(50)的总甲基化率均为33.33%;强致病力和过渡型菌株的主要甲基化模式为全甲基化,其全甲基化率高于半甲基化率,而所有无致病力菌株主要甲基化模式为半甲基化。qRT-PCR分析表明,强致病力和过渡型菌株连续传代致病力衰退菌株的DNA甲基化酶相关基因dam、dcm和ftsZ表达量显著增加,而去甲基化酶相关基因alkB表达量显著降低,推测DNA甲基化水平变化在致病力衰退过程起重要作用。【结论】青枯雷尔氏菌连续传代出现致病力衰退现象,这种致病力衰退可能与DNA甲基化水平有关。本研究为利用无致病力菌株防治青枯病害提供依据。

急性温度胁迫对虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)基因组DNA甲基化的影响

为探讨急性温度胁迫对虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)基因组DNA甲基化水平的影响,本研究从表观遗传学角度,运用甲基化敏感扩增多态性(Methylation-sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术比较分析了升温海水(17℃和24℃)急性胁迫虾夷扇贝(原暂养于9℃的海水中)9 h和24 h后基因组DNA甲基化的变化情况。结果显示,9对引物在各组的总扩增位点数为314–337,总甲基化位点为79–94,所占比例为23.45%–28.51%;所有处理组基因组DNA总甲基化率低于对照组,急性升温胁迫使虾夷扇贝基因组DNA发生去甲基化,而且去甲基化程度随胁迫温差增大和胁迫时间增长而增强,说明急性升温胁迫能够改变DNA甲基化水平和模式。本研究为进行虾夷扇贝抗逆基因的筛查提供了新思路和研究基础,丰富了表观遗传学在扇贝中的研究资料。

铅胁迫下红麻生理特性及DNA甲基化分析

DNA甲基化在植物响应生物和非生物胁迫中起重要作用,但是有关铅胁迫下植物DNA甲基化水平变化的研究报道甚少。本研究以红麻P3A为材料,采用水培法对幼苗进行不同浓度(0、200、400、600μmol L^(-1))PbCl_(2)处理,测定幼苗农艺性状、根系ROS含量和抗氧化酶活性等变化情况;利用甲基化敏感扩增多态性技术(methylation-sensitive amplification polymorphism,MSAP)分析600μmol L^(-1)铅胁迫条件下根系DNA甲基化水平变化,回收差异甲基化片段并克隆测序,采用qRT-PCR技术对DNA甲基化差异基因进行表达分析。结果表明,不同浓度PbCl_(2)胁迫均显著抑制幼苗的茎粗、根长和根表面积,且400μmol L^(-1)及以上浓度PbCl_(2)胁迫显著抑制红麻幼苗的株高和全鲜重。随着铅浓度的提高,红麻幼苗根系的铅含量显著升高,O_(2)^(-)和MDA含量显著增加,SOD活性显著升高,POD活性呈先降低后升高,CAT活性呈先升高后降低的趋势。对照及600μmol L^(-1)PbCl_(2)处理下的幼苗根系DNA甲基化率分别为71.13%、62.20%,其中全甲基化率分别为50.52%、37.80%,半甲基化率分别为20.62%、24.40%,即铅胁迫显著降低了红麻幼苗根系的DNA甲基化率和全甲基化率,提高了根系的半甲基化率。qRT-PCR分析表明,7个与抗性密切相关的DNA甲基化差异基因也存在表达量差异,推测DNA甲基化水平变化在响应红麻铅胁迫中发挥重要作用。本结果为深入探索DNA甲基化响应植物非生物胁迫的潜在机制,以及生产上利用红麻改良土壤铅污染提供了理论基础。

柯乐猪血液基因组甲基化修饰与细胞因子水平的相关性

为探明柯乐猪血液免疫细胞的基因表达是否受甲基化调控,应用甲基化敏感扩增多态性技术(MSAP)和酶联免疫吸附测试技术(ELISA)对柯乐猪与大白猪血液基因组DNA的甲基化水平、血清中的细胞因子浓度进行检测,分析柯乐猪与大白猪在甲基化水平、细胞因子浓度方面的差异及其相关关系。结果表明:柯乐猪基因组总甲基化水平为32.38%,与大白猪接近(P>0.05);IL-2、IL-4、IL-6和IL-10浓度分别为(302.37±125.72)pg/mL、(88.71±32.05)pg/mL、(219.01±30.42)pg/mL和(116.95±30.24)pg/mL,其中IL-6和IL-10分别极显著、显著低于大白猪;IFN-α、IFN-γ分别为(211.09±76.08)pg/mL和(57.18±14.21)pg/mL,分别极显著、显著高于大白猪。柯乐猪基因组的全甲基化水平与IFN-γ浓度间呈弱负相关关系(ρ=-0.256)。说明,血液免疫细胞的基因表达可能受甲基化的调控,且与柯乐猪的抗病力强有关。

绵羊基因组DNA甲基化与传染性胸膜肺炎的关联性分析

为了从自身的角度提高绵羊对传染性胸膜肺炎的抗感染能力,采用MSAP(甲基敏感扩增多态性)的方法对20只患病绵羊和20只正常绵羊基因组DNA甲基化与传染性胸膜肺炎关联性进行了分析。以绵羊在患传染性胸膜肺炎前后的全基因组DNA为研究对象,经过同裂酶HpaⅡ和MspⅠ对其进行双酶切,最后通过测序胶的聚丙烯凝胶电泳处理从16对MSAP选择性引物组合中挑选出4对引物的扩增结果,进行绵羊患病前后甲基化变化的评估。分析结果,传染性胸膜肺炎的患病与否,与绵羊的甲基化程度有一定的关联,通过统计学分析得出患病绵羊甲基化水平普遍高于非患病绵羊,同时甲基化多态性也随之升高。结果对研究动物疾病与动物自身表观遗传之间关联起到一定的参考意义,也为今后的研究提供了理论依据。

不同感温性甘蓝型冬油菜DNA甲基化差异及At4g02000-like结构预测

为研究甘蓝型冬油菜(Brassica napus L.)在低温胁迫后DNA甲基化水平及模式的变化情况,以强抗寒的15TS306和14NS52-3等13个甘蓝型冬油菜为材料,利用甲基化敏感扩增多态性技术,选用12对引物组合对低温(4℃)胁迫后的冬油菜DNA甲基化水平及模式的变化情况进行检测,并对差异片段进行序列比对及克隆。结果发现:低温胁迫后,弱抗寒的14美切实7、14美切实16、14美切实20、14美切实3和美切实38等品系DNA甲基化水平有所升高,且具有较高的甲基化程度;而强抗寒的15TS306、14NS52-3、15TS309、14NS54-7和15TS312等品系去甲基化程度较高。经过对22条DNA甲基化特异片段的序列分析,有16条片段序列与已知和假定功能的酶及蛋白具有同源性,其中以At4g02000-like蛋白变化最为明显。克隆及生物信息学分析显示,At4g02000-like蛋白等电点9. 20,相对分子质量38. 89kD。甘蓝型冬油菜受低温胁迫后,抗寒性强的品种DNA甲基化水平降低,以去甲基化为主;抗寒性弱的材料DNA甲基化水平升高;而且油菜对低温环境的适应性与某些特定基因不同的甲基化模式密切相关。

水稻Wx基因的遗传多态性及其与主要米质指标的相关性分析

利用RM190和484/W2R-ACCⅠ标记分析了50个水稻非糯品种的Wx基因的等位性变异。其中,RM190揭示出7种(CT)n纯合变异类型和1种杂合类型,分别为(CT)20、(CT)19、(CT)18、(CT)17、(CT)14、(CT)11、(CT)10和(CT)11/(CT)18,并以(CT)11和(CT)18两种类型为主;484/W2R-ACCⅠ共揭示出2种纯合类型和1种杂合类型,分别为G/G型、T/T型及G/T型;(CT)11大多为G/G型,(CT)18大多为T/T型,这两个标记可将供试材料划分为10种等位基因变异类型。进一步分析表明,RM190揭示的Wx基因多态性可以解释直链淀粉含量变异的59.3%;484/W2R-ACCⅠ揭示的Wx基因多态性可以分别解释直链淀粉含量及胶稠度变异的56.1%和24.6%;而两标记共同可解释直链淀粉含量变异的72.4%。还对这两个标记在育种实践中的应用前景进行了探讨。

大花蕙兰子房授粉前后基因组DNA胞嘧啶甲基化状态的MSAP分析

应用甲基化敏感扩增多态性(Methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术分析了大花蕙兰(Cymbidium hybridium)授粉前后子房DNA甲基化状态的变化(甲基化水平和甲基化差异模式)。采用72对引物进行选择性扩增,共得到5892条带,其中748条带为甲基化多态性带。结果显示DNA甲基化在大花蕙兰子房发育过程中发生频繁,从授粉前后子房的总扩增位点甲基化水平(14%和11.4%)和全甲基化率(9.5%和7.8%)来看,授粉后都略低于未授粉子房,表明子房在授粉后的发育过程中在某些位点发生了去甲基化。除甲基化水平有变化外,大花蕙兰子房授粉前后的DNA甲基化模式也存在较大差异,共检测到14种带型,分为两大类(Ⅰ和Ⅱ型)。其中,授粉前后DNA甲基化状态保持不变的位点较少,只占25.6%,归为Ⅰ型;大部分检测位点(占74.4%,归为Ⅱ型)的DNA甲基化模式在授粉前后存在显著差异。上述结果表明,大花蕙兰子房发育过程中以DNA甲基化为代表的表观遗传调控起重要作用。本研究的开展将促进对与大花蕙兰子房发育相关的甲基化差异片段及受DNA甲基化调控的关键基因的克隆,进而为从表观遗传学这一新角度揭示大花蕙兰子房发育的分子机制奠定基础。

半夏多倍体复合体基因组DNA甲基化状态的MSAP分析

目的分析半夏多倍体复合体DNA甲基化状态的变化(甲基化水平和甲基化差异模式)。方法应用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术,采用34对引物进行选择性扩增。结果扩增共得到7708条带,其中5636条带为甲基化多态性带在半夏7倍、8倍、9倍、10倍体值株间DNA甲基化水平变化不大。总扩增位点甲基化水平在54%～58%,全甲基化率为24.1%～24.3%,高倍性植株甲基化程序相应比较高。除甲基化水平稍有变化外,半夏不同倍性株间的DNA甲基化模式也形式各异,检测到的带型分为两大类(和型)。其中,不同倍性间DNA甲基化状态保持不变的位点占52.5%,归为型;少部分检测位点(占47.5%,归为型)的DNA甲基化模式在不同倍性间存在显著差异。结论半夏多倍体复合体各倍性植株间存在大量的胞嘧啶甲基化变异且整体甲基化水平较高。

鲍曼不动杆菌多态性DNA指纹图与药敏谱对医院感染管理的指导作用

目的建立鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii,AB)药敏谱及基因分型指纹图谱,探讨其对医院感染管理的指导作用。方法收集2006年9月至2007年9月神经外科病房住院患者标本中分离的29株AB以及同年从该病房环境中分离的21株AB,以3个月为一期,采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术,对医院环境中AB和临床标本中分离的AB进行基因分型并建立DNA指纹图谱,同时结合WHO推荐的K-B法进行药敏试验,建立药敏谱,比较临床标本中AB与环境中分离的AB药敏谱与RAPD型间差异,判断相关性,并从中分析对医院感染管理的作用。结果临床标本中AB的药敏谱及分型指纹图谱与环境中AB的药敏谱及分型指纹图谱呈现相关关系。29株临床分离的AB共分12种基因型,15种抗菌药物药敏谱分18个型;呈单一对应关系有10种,一对二的对应关系有2种;二对一的对应关系有一种。21株环境中分离的AB共分10种基因型,15种抗菌药物药敏谱分14个型;呈单一对应关系的有8种,一对二的对应关系的有3种,多株临床标本中AB与环境中AB具有同源性。结论依据AB药敏谱及DNA分型指纹图谱对感染源的确定、防止耐药菌传播和制定一系列防治措施具有极为重要的指导意义。

慢性肾功能衰竭大鼠肾皮质基因组DNA表观遗传学变化的MSAP分析

以灌胃腺嘌呤诱导的慢性肾功能衰竭Wistar大鼠为实验材料,用高效液相色谱法(HPLC)检测了大鼠血清Hcy浓度的变化;应用甲基化敏感扩增多态性(methylation-sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术,检测了慢性肾衰大鼠肾皮质基因组DNA甲基化程度的变化,并对MSAP差异片段进行了分析.结果发现:(1)慢性肾衰大鼠血清Hcy浓度由正常的(10.56±1.20)μmol/L上升为(16.64±1.57)μmol/L,P<0.05,差异具有显著性.(2)慢性肾衰大鼠肾皮质基因组总甲基化率由正常的(41.95±1.94)%降低为(38.43±3.27)%,P<0.05,差异具有显著性.(3)甲基化差异片段涉及多个基因,其中包括多个甲基化转移酶相关基因.结果表明慢性肾功能衰竭大鼠会出现高同型半胱氨酸血症和肾皮质基因组总甲基化水平的降低,多个基因内部或上下游DNA序列出现甲基化状态变化.

四倍体菘蓝基因组DNA甲基化的甲基化敏感扩增多态性分析

目的分析四倍体菘蓝Isatis indigotica基因组DNA甲基化水平和模式。方法采用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)方法,对四倍体菘蓝基因组DNA的甲基化水平和模式进行分析。结果筛选36对MSAP选择性引物进行扩增,共得到1 733条清晰的条带。二倍体菘蓝基因组胞嘧啶甲基化水平为24.05%,四倍体菘蓝基因组胞嘧啶甲基化水平为23.70%。检测到83个(4.86%)CCGG位点在四倍体菘蓝基因组中发生了DNA甲基化模式的改变,其中37个(2.13%)位点发生了超甲基化,36个(2.08%)位点发生了去甲基化。结论二倍体和四倍体菘蓝在CCGG位点上存在胞嘧啶甲基化状态的改变。

干旱胁迫下油用牡丹‘凤丹’基因组DNA甲基化分析

利用甲基化敏感扩增多态性技术探究不同干旱处理下油用牡丹‘凤丹’基因组DNA甲基化的水平及其变异模式。结果表明:‘凤丹’4年生植株的基因组DNA甲基化率为93.24%;随着干旱程度的加强,‘凤丹’基因组DNA发生甲基化变化位点的比率呈先上升后下降的趋势;对不同程度干旱处理后的‘凤丹’进行复水,与对照植株相比,复水后的‘凤丹’植株基因组DNA总甲基化率均表现为上升。干旱胁迫下‘凤丹’基因组DNA甲基化出现4种变异模式,表现为15种条带类型。轻度干旱诱导‘凤丹’基因组39.78%的位点发生了甲基化,40.00%的位点发生了去甲基化;重度干旱诱导‘凤丹’基因组46.00%的位点发生了甲基化,38.60%的位点发生了去甲基化,表明干旱胁迫会诱导‘凤丹’基因组DNA甲基化状态发生改变。

双胚苗水稻单倍体及其杂交后代基因组DNA甲基化特异位点的分析及功能探讨

采用甲基化敏感性扩增多态性技术对水稻单倍体SARⅡ-628及它与蜀恢527、蜀恢363的杂交后代基因组DNA甲基化位点进行了分析。用16对选择性扩增引物在双亲及杂交后代中共检测到765个DNA甲基化位点,与双亲相比,杂交后代DNA甲基化水平均有不同程度的降低。通过分析两个杂交组合与双亲的甲基化带型差异,发现非单倍体遗传及单倍体独立遗传两种甲基化差异位点。对部分甲基化位点的序列进行功能分析,发现这些位点主要涉及细胞构造、代谢途径、应激反应等生物学功能。推测这类功能基因的甲基化修饰调控着相关基因的开启与关闭,为植物的生存、生长、发育及进化提供动力。