限制性内切酶结合半巢式PCR法检测人肝癌P16抑癌基因启动子区甲基化研究

目的建立甲基化敏感的限制性内切酶结合半巢式降落PCR方法,研究原发性肝癌P 16基因启动子区甲基化状态。方法针对P 16基因启动子区富含CpG的序列,设计3条引物,进行半巢式降落PCR扩增,检测原发性肝癌P 16基因启动子区甲基化状态;并将P 16基因启动子区340 bp片段克隆到pM D 18-T载体,E.coli JM 109扩增此质粒后经CpG甲基化酶M.S ssⅠ处理,再用Hp aⅡ酶切验证获得P 16基因启动子区甲基化阳性的质粒P 16Pm+并进行特异性和灵敏度实验。以此甲基化敏感的限制性内切酶结合半巢式降落PCR方法检测40例人原发性肝癌和3例正常人肝组织DNA样品的P 16基因启动子区甲基化状态。结果所采用的Hp aⅡ酶切后半巢式PCR方法的特异性强,灵敏度达100 fg;对40例人原发性肝癌组织DNA样品P 16基因的启动子区甲基化状态检测显示甲基化阳性率为30%(12/40),3例正常人肝组织均为阴性(0/3)。结论P 16抑癌基因启动子区甲基化可能与肝癌发生发展有关。本实验方法简便、成本低廉,并有高度的特异性与灵敏度,在大规模检查中有实际应用价值。

甲基化特异性PCR联合结合重亚硫酸盐限制性内切酶法在胃癌抑癌基因甲基化检测中的应用

目的探讨甲基化特异性PCR(MSP)方法检测胃癌组织中抑癌基因甲基化的准确性,联合应用MSP方法与结合重亚硫酸盐限制性内切酶法(COBRA)检测抑癌基因甲基化状态的意义。方法采用MSP检测胃癌组织抑癌基因Runx3启动子区甲基化的状态,随后再采用COBRA检测胃癌组织标本的甲基化状态。分析两种方法检测结果的关系。结果经MSP方法检测54例肿瘤组织中共有30例标本发生Runx3基因启动子区异常甲基化,甲基化阳性率为55.6%。经COBRA方法检测54例肿瘤组织中有27例出现酶切条带即存在甲基化,甲基化阳性率为50.0%。经COBRA方法检测,在MSP方法检测的30例阳性标本中有3例未出现酶切条带即为假阳性。在MSP方法检测Runx3基因甲基化阴性的24例标本中,经COBRA方法检测,Runx3基因甲基化阴性的标本亦为24例。两种检测方法检测结果的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结论甲基化特异性PCR方法在检测胃癌抑癌基因甲基化状态的研究中具有较高的灵敏度,COBRA方法可以检测出MSP方法中的假阳性标本,联合应用两种方法检测胃癌组织中抑癌基因的甲基化状态会使实验结果更可靠、准确。

甲基化特异性PCR法和限制性内切酶-PCR法检测脑胶质瘤hMLM1基因启动子区甲基化

目的研究脑胶质瘤中hMLM1基因启动子区的甲基化状态,并比较不同的甲基化检测方法。方法采用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)法和限制性内切酶-PCR法,检测42例脑胶质瘤和5例正常脑组织中hMLM1基因启动子区的甲基化状态。结果用MSP法和限制性内切酶-PCR法检测,hMLM1启动子区甲基化率分别为4.8%(2/42)和11.9%(5/42),启动子区甲基化与性别、年龄、病理类型和病理分级无明显的相关性。结论在脑胶质瘤中hMLM1基因启动子区甲基化少见,MSP法和限制性内切酶-PCR法是简单、灵敏的甲基化检测方法。

识别序列外DNA甲基化对限制性核酸内切酶PvuⅡ酶切活性影响的研究

构建了重组质粒ｐＳＶ２ｇｐｔ－ＳＶ４０ｏｒｉ－ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ｒａｓ（简称Ｐ１），利用这一重组体进一步证实了识别序列外ＤＮＡ甲基化对限制性核酸内切酶ＰｖｕⅡ切割活性的抑制作用，并对这一抑制作用进行了定量研究。结果表明：邻近ＰｖｕⅡ识别位，点的ＤＮＡ甲基化可降低ＰｖｕⅡ对该位点酶切活性的７０％左右。

O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因启动子甲基化对脑胶质瘤患者化学治疗敏感性及生存的影响

目的探讨O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)基因启动子甲基化对脑胶质瘤患者化学治疗敏感性及生存的影响。方法选择2014年1月至2017年8月延安大学咸阳医院收治的90例脑胶质瘤患者为研究对象,所有患者进行手术切除胶质瘤,术后给予同步放射治疗、化学治疗联合替莫唑胺辅助化学治疗。采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测患者胶质瘤组织和瘤旁组织中MGMT基因启动子甲基化水平,比较肿瘤组织与瘤旁组织中的MGMT基因启动子甲基化阳性率。所有患者术后随访36个月,比较复发与未复发患者的MGMT基因启动子甲基化阳性率,比较MGMT基因启动子甲基化阳性与阴性患者的无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,单因素和多因素Cox回归模型分析脑胶质瘤患者生存的影响因素。结果90例脑胶质瘤患者中,胶质瘤组织和瘤旁组织中MGMT基因启动子甲基化阳性率分别为43.33%(39/90)、4.44%(4/90),胶质瘤组织中MGMT基因启动子甲基化阳性率显著高于瘤旁组织(χ^(2)=37.430,P<0.05)。75例复发患者胶质瘤组织中MGMT基因启动子甲基化阳性率为42.86%(30/70),15例未复发患者胶质瘤组织中MGMT基因启动子甲基化阳性率为60.00%(9/15),复发患者胶质瘤组织中MGMT基因启动子甲基化阳性率显著低于未复发患者(χ^(2)=6.978,P<0.05)。39例胶质瘤组织中MGMT基因启动子甲基化阳性患者的PFS、OS分别为(58.69±3.36)、(82.36±4.56)周,51例胶质瘤组织中MGMT基因启动子甲基化阴性患者的PFS、OS分别为(52.74±3.08)、(78.76±4.01)周;胶质瘤组织中MGMT基因启动子甲基化阳性患者的PFS、OS显著长于阴性患者(t=8.730、3.932,P<0.05)。截至术后36个月,90例患者中存活28例,死亡62例。单因素分析结果显示,年龄、手术切除方式、肿瘤临床分期、MGMT基因启动子甲基化状态与脑胶质瘤患者生存有关(P<0.05),而性别、肿瘤直径、Karnofsky评分、肿瘤组织学类型、肿瘤部位与脑胶质瘤患者生存无关(P>0.05)。Cox回归模型分析显示,年龄>40岁、手术次全切是影响脑胶质瘤患者生存的独立危险因素(P<0.05),MGMT基因启动子甲基化是脑胶质瘤患者生存的保护因素(P<0.05)。结论MGMT基因启动子甲基化可提高脑胶质瘤患者的化学治疗敏感性,是患者生存的保护因素。

甲基化敏感扩增多态性技术检测体系的建立

为了获得理想的甲基化检测效果,通过调整基因组DNA用量、PCR试剂浓度等因素,优化了甲基化敏感扩增多态性技术(MSAP)体系。结果表明:基因组用量为250 ng,预扩与选扩体系分别采用Fermentas公司生产的PCR混合物1/2和1/4体系时,能得到理想的检测效果。

甲基化敏感性高分辨率熔解曲线检测结直肠癌组织及外周血MGMT基因甲基化

目的用甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法（MS-HRM）定量检测结直肠癌组织及外周血中MGMT基因甲基化水平,并结合结直肠癌病理参数分析探讨MGMT基因甲基化的临床意义。方法以33例结直肠癌组织和配对的正常黏膜组织以及其中16例患者的外周血为研究对象,用MS-HRM进行MGMT基因甲基化检测,分析MGMT基因甲基化与结直肠癌临床病理特征的关系和MS-HRM的方法特点。结果 MS-HRM从33例结直肠癌患者的癌组织中检测到12例（36.4%）MGMT基因启动子不同程度的甲基化（甲基化〈5%1例,5%-10%3例,10%-25%3例,25%-50%2例,50%-75%3例）,对应的正常结直肠组织中仅检测到甲基化〈5%1例（3.0%）。16例外周血中检测到甲基化小于〈5%3例（18.8%）。MGMT基因甲基化与患者的年龄、性别、肿瘤部位无相关性（P〉0.05）,但与结直肠癌的病理分期和分化程度的相关性有统计学意义（P〈0.05）。结论 MS-HRM可定量检测结直肠癌MGMT甲基化水平。MGMT基因甲基化与结直肠癌的进展评估有关。

小白菜小孢子培养再生植株的倍性与基因组DNA甲基化的关系

对小白菜品种进行游离小孢子培养,得到9株再生植株,其中2株为单倍体,7株为二倍体,二倍体自然加倍率为77.7%。为避免材料间差异,取单倍体和二倍体再生植株各2株,提取单株DNA,分别构建单倍体和二倍体DNA混合池。利用甲基化敏感性限制性内切酶-PCR法,结合SRAP分子标记技术,对2个DNA混合池进行筛选,共筛选768对引物,只有在未酶切的单倍体和二倍体DNA池中SRAP引物扩增无差异,而酶切后有差异的条带,才认为是单倍体和二倍体甲基化差异。试验共获得8对含有多态性的引物,试验结果证明小白菜小孢子培养获得的再生植株的倍性与基因组DNA甲基化有关。

H19差异甲基化位点MSRE-qPCR分析识别精子DNA新方法的可行性探究

目的:研究位于H19转录起始点-3390 bp的HhaI位点是否为差异甲基化位点,为精子DNA识别提供新依据。方法:从51份血样和20份精子样本提取基因组DNA,每个样本分别在同一反应体系中进行甲基化敏感酶HhaI消化和荧光定量PCR反应(MSRE-qPCR),扩增包含上述HhaI位点的114 bp片段。得到每个样本酶切前后的Ct值,用2^(-△△Ct)计算各样本酶切前后模板DNA相对表达量,将其作为DNA甲基化水平。结果:51份血样中该HhaI位点甲基化水平为(44.4±23.8)%,20份精子DNA甲基化水平为(120.5±52.5)%,差异有统计学意义(P<0.001)。结论:甲基化水平高于94%可识别精子DNA,H19差异甲基化区114 bp序列的MSRE-qPCR分析为精子DNA的识别提供了一种新方法。

逆转录聚合酶链反应检测Ⅲ型登革病毒的敏感性和特异性研究

本文应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,检测Ⅲ型登革病毒基因。所设计引物在E基因组,引物2位于核苷酸序列的1139～1158位,引物1位于1453～1471位,反应产物为333bp,内含1个HindⅢ限制性内切酶位点,酶切后有128 bp和199 bp两个片段。产物在含溴化乙锭的2％琼脂糖中电泳。采用RT-PCR法可测出少至5个半数组织细胞培养感染量(TCID_so)的病毒RNA。

初诊和复发急性髓性白血病p15、p16基因甲基化研究

目的探讨急性髓性白血病(AL)p15、p16、p18、p19基因失活的发生率及与疾病发生、发展、预后的关系。方法用聚合酶链反应(PCR)方法扩增46例患者的p15、p16、p18、p19基因外显子1和外显子2,再用限制性内切酶-PCR方法检测基因甲基化。结果46例患者中,急性淋巴细胞白血病(ALL)19例,11例p15基因失活,10例p16基因失活;急性非淋巴细胞白血病(ANLL)27例,9例p15基因失活,18例p16基因失活;均以甲基化失活为主。所有病例均无p18、p19基因失活。结论在AL发生、发展过程中,p15、p16基因失活主要是由于p15、p16基因甲基化所致。

转染miR-101类似物后卵巢癌细胞对紫杉醇敏感性的变化及其机制

目的观察转染miR-101类似物后卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性变化,并探讨其机制。方法培养卵巢癌SKOV3细胞,将SKOV3细胞分为观察组、对照组、单药组,三组均经0、6.25、25、100、400、1 600 ng/m L紫杉醇处理,观察组转染miR-101类似物,对照组转染无关序列,单药组不转染任何序列,MTT法观察各组细胞增殖能力,Annexin V-FITC/PI法测算各组细胞凋亡率。采用Western blotting法检测25 ng/m L紫杉醇注射液作用的观察组、对照组、单药组细胞DNMT3A蛋白。结果 0、6.25、25、100、400、1 600 ng/m L紫杉醇注射液作用的观察组细胞OD值分别为0.632±0.014、0.554±0.012、0.503±0.015、0.428±0.011、0.346±0.006、0.301±0.007,单药组分别为0.718±0.013、0.687±0.015、0.619±0.011、0.554±0.009、0.473±0.008、0.420±0.011,对照组分别为0.713±0.016、0.671±0.011、0.626±0.010、0.549±0.008、0.467±0.010、0.412±0.008,观察组与对照组相比,P均<0.05。0、6.25、25、100、400、1 600 ng/m L紫杉醇注射液作用的观察组细胞凋亡率分别为9.63%±0.38%、14.71%±0.64%、21.27%±0.79%、27.05%±0.92%、31.82%±1.07%、35.51%±1.63%,单药组分别为3.61%±0.24%、6.18%±0.48%、9.57%±0.42%、15.64%±0.75%、18.79%±1.12%、22.05%±1.34%,对照组分别为3.74%±0.29%、6.02%±0.35%、10.63%±0.58%、15.21%±0.84%、19.37%±1.26%、23.30%±1.18%,观察组与对照组相比,P均<0.05。观察组、对照组、单药组细胞中DNMT3A蛋白相对表达量分别为0.427±0.068、0.961±0.107,0.947±0.113,三组比较,P<0.05。结论转染miR-101类似物后卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性增强,miR-101可能通过靶向调控DNMT3A诱导卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性。

基因甲基化聚合酶链反应检测体系的优化

目的优化甲基化敏感限制性内切酶的聚合酶链反应(PCR)检测体系。方法用甲基化敏感限制性内切酶-PCR技术对10例健康未孕女性的RASSF1A基因进行甲基化检测,并对反应的缓冲体系进行优化。结果未经纯化的酶切产物直接进行PCR时,PCR反应特异性降低,出现众多非特异PCR产物;纯化酶切产物或用PCR缓冲液替代酶切缓冲液后,PCR反应特异性变高。结论酶切缓冲液可影响后续PCR反应的特异性,采取纯化措施或以PCR缓冲液替代酶切缓冲液能够有效提高后续PCR特异性,首选PCR缓冲液替代更为简便。

限制性内切酶结合竞争聚合酶链反应定量检测在多药耐药基因甲基化状态中的应用

目的建立定量检测多药耐药基因(MDR1)甲基化状态的方法。方法在MDR1基因启动子区含甲基化位点的-102～+186bp片段间设计1条正义引物和2条反义引物,采用不同的反义引物,经3次聚合酶链反应(PCR)获得较目的片段缺失30bp的竞争内标DNA片段,以Pbluescriptsk+为载体构建竞争内标DNA质粒;待检基因组DNA经甲基化敏感的限制性内切酶HpaⅡ消化后与竞争内标DNA竞争扩增MDR1基因;PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像分析仪扫描,目的片段量等于反应体系中竞争内标量乘以目的片段与竞争内标片段的光密度比值,HpaⅡ酶切与未经酶切标本所得目的片段量的比值为甲基化率。结果倍比稀释的基因组DNA与最佳量竞争内标共扩增MDR1基因启动子区目的片段,两扩增产物量的比值与基因组DNA量呈显著正相关,相关系数r=0.992,P<0.001。结论本方法用于MDR1基因甲基化定量检测,操作相对简单,定量准确可靠,适用于临床研究中大量样本检测。

限制性核酸内切酶PvuⅡ识别序列外甲基化抑制其酶切活性的分子机理研究

DNA甲基化是DNA分子上重要的碱基修饰方法之一,它可以影响核酸的结构及其与蛋白质的相互作用,由此影响基因的表达,关于甲基化与限制性核酸内切酶之间的关系,以往的研究表明:限制性核酸内切酶识别序列内DNA甲基化可特异性地抑制该酶的酶切活性。

MSRE-PCR法检测卵巢癌组织中OPCML基因甲基化

目的建立甲基化敏感性限制性内切酶-PCR(MSRE-PCR)法检测OPCML基因,探讨其在卵巢癌中的意义。方法用亚硫酸氢钠修饰测序法检测5例卵巢癌组织及正常卵巢组织中OPCML基因甲基化,分别用MSRE-PCR和巢式甲基化特异性PCR(MSP)检测组织DNA中OPCML基因甲基化发生率。结果 DNA序列中存在6个Bsh1236I酶切位点,酶切24 h能完全消化非甲基化DNA,MSRE-PCR和巢式MSP检测卵巢癌组织中OPCML基因甲基化发生率分别为86.7%和84.4%,正常卵巢组织两法均阴性。结论 MSRE-PCR检测卵巢癌组织OPCML基因甲基化发生率与巢式MSP相比没有显著性差异,是一种操作简便、敏感的甲基化检测方法。

限制性酶切扫描技术测定DNA甲基化组的方法建立

目的优化试验条件,建立用于 DNA 甲基化组测定的限制性酶切扫描技术(RLGS)。方法选取冰冻胃癌组织及其周围非癌组织各2份,提取基因组大分子 DNA(>50 000 bp),用甲基化敏感的限制性内切酶 Not Ⅰ等对 DNA 进行多重酶切、同位素^(32)P 标记、二维电泳、扫描分析,并且根据已有的位点 DNA 序列数据库,确定所得扫描图谱上位点所对应的序列信息。结果成功得到RLGS 扫描图;有效点平均在1200个左右,标本质量较好的图谱平均可获得有效点1800个左右,与国外实验室的平均水平相当,经过比对可找出放射自显影信号强度减弱或增强的点,结果可重复,并能在 Not Ⅰ-EcoRV 克隆文库中找到这些点所对应的序列信息。结论成功建立了 RLGS 技术平台,并能够稳定工作。

MSRE-qPCR技术分析多基因DNA甲基化对肝细胞癌的诊断价值

背景与目的:DNA甲基化是潜在的肿瘤标志物。本研究运用自行建立的甲基化敏感性限制性内切酶-定量PCR(methylation-sensitive restriction enzymes-based quantitative PCR,MSRE-qPCR)方法检测肝细胞癌(hepatocellutar carcinoma,HCC)组织中多个基因的DNA甲基化状态,筛选可用于HCC诊断的DNA甲基化标志物组合。方法:以47对HCC患者癌组织和癌旁组织、8例正常人肝组织为材料,运用MSRE-qPCR方法检测这102例肝组织中APC、GSTP1、RASSF1A、p16、SFRP1、RUNX3、Hint1、SOCS1和HIC-1基因的启动子甲基化状态。结果:APC、GSTP1、RASSF1A、p16、SFRP1、RUNX3基因在肿瘤组织中的甲基化率分别为70.2%、70.2%、63.8%、29.8%、44.7%和36.2%,均显著高于对应癌旁组织(P均<0.05);而Hint1、SOCS1和HIC-1基因甲基化水平在HCC肿瘤和癌旁组织间无显著差异。联合检测APC、GSTP1、RASSF1A和SFRP1 4个靶点,可检出所有HCC病例。这些基因的甲基化水平与患者肿瘤大小、分化、包膜及HBV感染等临床病理参数均无显著相关性。结论:联合检测APC、GSTP1、RASSF1A和SFRP1的DNA甲基化状态对于HCC风险评估和分子诊断具有重要价值。

血浆GSTP1和SFRP1基因甲基化分析在肝细胞癌早期诊断中的价值

背景与目的:DNA甲基化是一种新的肿瘤诊断及预后判断的标志物。本研究运用自行建立的甲基化敏感性限制性内切酶-定量PCR(methylation-sensitive restriction enzymes-based quantitative PCR,MSRE-qPCR)方法检测血浆GSTP1和SFRP1基因的DNA甲基化状态,探讨其在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)早期诊断中的价值。方法:收集150例血浆标本,包括72例HCC,37例肝良性病变和41名健康对照者。用MSRE-qPCR法检测血浆GSTP1和SFRP1基因DNA甲基化水平。结果:HCC患者血浆GSTP1和SFRP1甲基化阳性率分别为54.2%和27.8%,显著高于健康对照组(9.8%和2.4%,P<0.001)和肝良性病变组(10.8%和5.4%,P<0.001);同时检测血浆GSTP1和SFRP1可检出63.9%的HCC;而联合血清AFP分析可进一步将HCC诊断率提高至73.6%。结论:联合检测血浆GSTP1和SFRP1基因DNA甲基化对于HCC早期非侵入性诊断具有重要价值。

食管癌细胞系中MT-3基因CpG岛甲基化的意义

目的研究食管癌细胞系中MT-3基因CpG岛甲基化与其mRNA表达的关系。方法选取4种食管癌细胞系OE21,OE19,OE33和TE7,经重亚硫酸钠处理后,采用限制性酶切图谱分析(COBRA)和逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术,在DNA甲基转移酶抑制剂5氮2’脱氧胞苷(5azaCdR)处理前后,对其MT-3基因CpG岛的甲基化情况及mRNA的表达情况进行对比研究。结果4种食管癌细胞系的MT-3基因均存在不同程度的CpG岛超甲基化。经5azaCdR处理后,超甲基化状态解除,mRNA的表达水平也较处理前明显提高(P=0.002)。结论食管癌细胞系中MT-3基因CpG岛的超甲基化可抑制其mRNA表达。当其超甲基化解除后,MT3基因的mRNA表达水平也会相应升高。