MSRE-PCR法检测卵巢癌组织中OPCML基因甲基化

目的建立甲基化敏感性限制性内切酶-PCR(MSRE-PCR)法检测OPCML基因,探讨其在卵巢癌中的意义。方法用亚硫酸氢钠修饰测序法检测5例卵巢癌组织及正常卵巢组织中OPCML基因甲基化,分别用MSRE-PCR和巢式甲基化特异性PCR(MSP)检测组织DNA中OPCML基因甲基化发生率。结果 DNA序列中存在6个Bsh1236I酶切位点,酶切24 h能完全消化非甲基化DNA,MSRE-PCR和巢式MSP检测卵巢癌组织中OPCML基因甲基化发生率分别为86.7%和84.4%,正常卵巢组织两法均阴性。结论 MSRE-PCR检测卵巢癌组织OPCML基因甲基化发生率与巢式MSP相比没有显著性差异,是一种操作简便、敏感的甲基化检测方法。

H19差异甲基化位点MSRE-qPCR分析识别精子DNA新方法的可行性探究

目的:研究位于H19转录起始点-3390 bp的HhaI位点是否为差异甲基化位点,为精子DNA识别提供新依据。方法:从51份血样和20份精子样本提取基因组DNA,每个样本分别在同一反应体系中进行甲基化敏感酶HhaI消化和荧光定量PCR反应(MSRE-qPCR),扩增包含上述HhaI位点的114 bp片段。得到每个样本酶切前后的Ct值,用2^(-△△Ct)计算各样本酶切前后模板DNA相对表达量,将其作为DNA甲基化水平。结果:51份血样中该HhaI位点甲基化水平为(44.4±23.8)%,20份精子DNA甲基化水平为(120.5±52.5)%,差异有统计学意义(P<0.001)。结论:甲基化水平高于94%可识别精子DNA,H19差异甲基化区114 bp序列的MSRE-qPCR分析为精子DNA的识别提供了一种新方法。

小白菜小孢子培养再生植株的倍性与基因组DNA甲基化的关系

对小白菜品种进行游离小孢子培养,得到9株再生植株,其中2株为单倍体,7株为二倍体,二倍体自然加倍率为77.7%。为避免材料间差异,取单倍体和二倍体再生植株各2株,提取单株DNA,分别构建单倍体和二倍体DNA混合池。利用甲基化敏感性限制性内切酶-PCR法,结合SRAP分子标记技术,对2个DNA混合池进行筛选,共筛选768对引物,只有在未酶切的单倍体和二倍体DNA池中SRAP引物扩增无差异,而酶切后有差异的条带,才认为是单倍体和二倍体甲基化差异。试验共获得8对含有多态性的引物,试验结果证明小白菜小孢子培养获得的再生植株的倍性与基因组DNA甲基化有关。

甲基化敏感限制酶结合定量PCR检测DNA甲基化方法的建立与应用

启动子CpG岛高甲基化是抑癌基因失活的重要机制之一，对于肿瘤的早期诊断、分子分型、预后判断等均具有较大的价值。目前较常用的DNA甲基化检测技术是基于亚硫酸氢盐处理的甲基化特异PCR方法（MSP），但该技术需使用强碱对DNA进行处理，导致绝大多数DNA分子发生断链。限制性内切酶广泛应用于DNA甲基化分析，其中甲基化敏感性限制内切酶（MSRE）只能切割非甲基化的靶位点；

Trichostatin A能导致小麦基因组DNA改变及甲基化修饰

为了研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂的作用机制,本实验以组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A处理小麦根尖,通过随机扩增多态性DNA标记技术(random amplified polymorphic DNA,RAPD)和双限制性内切酶酶切-随机扩增法(Coupled Restriction Enzyme Digestion-Random Amplification,CRED-RA)进行探究的结果发现,与对照组相比,处理组10个随机引物的RAPD扩增条带出现83条多样性差异,多样性比例达到87.4%,同时处理组DNA甲基化比例增加.本研究证实Trichostatin A能使小麦基因组DNA发生改变,并出现了表观修饰,从而从分子和表观水平探讨了该抑制剂的作用机理.

脆性X综合征FMRl基因CpG岛的甲基化程度分析

目的建立用甲基化敏感性限制性内切酶定量聚合酶链反应（methylation-sensitiverestrictionenzymes-basedquantitativePCR，MSRE-qPCR）分析FMRl基因CpG岛甲基化程度的方法，并探讨其对脆性X综合征的诊断价值。方法以常规PCR初筛存在FMRl基因5。（CGG）n异常扩增的30例智力低下男童和20名母亲作为研究对象，用EagI酶消化DNA样品，针对FMRl基因CpG岛设计引物，定量PCR扩增EagI酶切前、后DNA，用2△△Ct法计算CpG岛甲基化程度；以Southern印迹杂交确诊的3例患儿和正常体检男、女各30例DNA样品为质控样本，从而建立优化的MSRE-qPCR方法。结果确立了正常甲基化、部分异常甲基化、全甲基化的区间值，并明确30例常规PCR初筛异常患儿中3例存在部分甲基化，27例为全甲基化，其中3例经Southern印迹杂交验证；13例母亲处于正常甲基化，7例存在异常甲基化。结论MSRE-qPCR可以对FMRl基因CpG岛的甲基化程度进行快速可靠分析，为脆性x综合征的分子诊断提供新的策略。