小白菜小孢子培养再生植株的倍性与基因组DNA甲基化的关系

对小白菜品种进行游离小孢子培养,得到9株再生植株,其中2株为单倍体,7株为二倍体,二倍体自然加倍率为77.7%。为避免材料间差异,取单倍体和二倍体再生植株各2株,提取单株DNA,分别构建单倍体和二倍体DNA混合池。利用甲基化敏感性限制性内切酶-PCR法,结合SRAP分子标记技术,对2个DNA混合池进行筛选,共筛选768对引物,只有在未酶切的单倍体和二倍体DNA池中SRAP引物扩增无差异,而酶切后有差异的条带,才认为是单倍体和二倍体甲基化差异。试验共获得8对含有多态性的引物,试验结果证明小白菜小孢子培养获得的再生植株的倍性与基因组DNA甲基化有关。

H19差异甲基化位点MSRE-qPCR分析识别精子DNA新方法的可行性探究

目的:研究位于H19转录起始点-3390 bp的HhaI位点是否为差异甲基化位点,为精子DNA识别提供新依据。方法:从51份血样和20份精子样本提取基因组DNA,每个样本分别在同一反应体系中进行甲基化敏感酶HhaI消化和荧光定量PCR反应(MSRE-qPCR),扩增包含上述HhaI位点的114 bp片段。得到每个样本酶切前后的Ct值,用2^(-△△Ct)计算各样本酶切前后模板DNA相对表达量,将其作为DNA甲基化水平。结果:51份血样中该HhaI位点甲基化水平为(44.4±23.8)%,20份精子DNA甲基化水平为(120.5±52.5)%,差异有统计学意义(P<0.001)。结论:甲基化水平高于94%可识别精子DNA,H19差异甲基化区114 bp序列的MSRE-qPCR分析为精子DNA的识别提供了一种新方法。

单管一步甲基化可变位点分析技术

目的建立单管一步甲基化可变位点(methylation variable position,MVP)分析技术——单管消化后PCR链融解曲线分析(post-digestion PCR-melting curve analysis,PDP-MCA)。方法以文献报道的差异甲基化区(differentially methylated region,DMR)为模型,在MVP两侧设计一组解链温度各不相同的引物。应用FastDigest甲基化敏感性限制酶(methylation-sensitive restriction enzyme,MSRE),在同一反应管内顺次进行DNA的酶切、复合扩增和MCA检测,生成MCA图谱。同时用该方法和传统的MSRE-PCR MCA技术检测相同样品(外周静脉血、精液、阴道液各5份),比较两种方法检测结果,验证其可行性,并分析比较不同样品的MCA/HRM图谱。结果解链温度相差2℃以上的片段,MCA峰分离良好,复合扩增后可以用MCA技术检测。应用单管PDP-MCA技术,可以集酶切、扩增和检测三步于一管,在2h内得到与传统方法一致的特异性图谱和数据,并实现样品的快速分类鉴别。结论单管PDP-MCA技术可以实现多个MVP的单管、闭管检测,具有简便、快速、易于自动化等优点,可用于样品DNA甲基化差异的检测。

MSRE-PCR法检测卵巢癌组织中OPCML基因甲基化

目的建立甲基化敏感性限制性内切酶-PCR(MSRE-PCR)法检测OPCML基因,探讨其在卵巢癌中的意义。方法用亚硫酸氢钠修饰测序法检测5例卵巢癌组织及正常卵巢组织中OPCML基因甲基化,分别用MSRE-PCR和巢式甲基化特异性PCR(MSP)检测组织DNA中OPCML基因甲基化发生率。结果 DNA序列中存在6个Bsh1236I酶切位点,酶切24 h能完全消化非甲基化DNA,MSRE-PCR和巢式MSP检测卵巢癌组织中OPCML基因甲基化发生率分别为86.7%和84.4%,正常卵巢组织两法均阴性。结论 MSRE-PCR检测卵巢癌组织OPCML基因甲基化发生率与巢式MSP相比没有显著性差异,是一种操作简便、敏感的甲基化检测方法。

脆性X综合征FMRl基因CpG岛的甲基化程度分析

目的建立用甲基化敏感性限制性内切酶定量聚合酶链反应（methylation-sensitiverestrictionenzymes-basedquantitativePCR，MSRE-qPCR）分析FMRl基因CpG岛甲基化程度的方法，并探讨其对脆性X综合征的诊断价值。方法以常规PCR初筛存在FMRl基因5。（CGG）n异常扩增的30例智力低下男童和20名母亲作为研究对象，用EagI酶消化DNA样品，针对FMRl基因CpG岛设计引物，定量PCR扩增EagI酶切前、后DNA，用2△△Ct法计算CpG岛甲基化程度；以Southern印迹杂交确诊的3例患儿和正常体检男、女各30例DNA样品为质控样本，从而建立优化的MSRE-qPCR方法。结果确立了正常甲基化、部分异常甲基化、全甲基化的区间值，并明确30例常规PCR初筛异常患儿中3例存在部分甲基化，27例为全甲基化，其中3例经Southern印迹杂交验证；13例母亲处于正常甲基化，7例存在异常甲基化。结论MSRE-qPCR可以对FMRl基因CpG岛的甲基化程度进行快速可靠分析，为脆性x综合征的分子诊断提供新的策略。