改良的甲基化特异PCR法在人宫颈癌Hela细胞检测中的应用

目的介绍一种CpG岛甲基化分析方法,即甲基化特异PCR法(methylation-specific PCR,MSP)以及对该方法的改良。方法用亚硫酸氢盐修饰被测DNA后,进行甲基化与非甲基化特异PCR的扩增,并对MSP法进行改良。应用该法分析人宫颈癌Hela细胞中RASSF1A、p16基因5'CpG岛甲基化状态。结果发现人宫颈癌Hela细胞中有RASSF1A、p16基因的甲基化,改良后的MSP更容易获得较好的效果。结论MSP法是一种较为简便、灵敏和具特异性的甲基化检测方法,改良后该方法更加简便可行。

甲基化特异PCR 方法对p16肿瘤抑制基因的研究

目的：研究肺癌、结肠癌组织中 p16 肿瘤抑制基因甲基化状态及其临床意义。方法：采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）方法，特异扩增分析甲基化和非甲基化两种状态。结果：p16基因在人胚肺组织处于非甲基化状态；在人肺巨细胞癌细胞系（PLA801-D)呈甲基化状态；在检测的肿瘤标本中，60％ 肺癌组织及 70％ 结肠癌组织出现甲基化状态。结论：p16 基因的甲基化状态是肺癌、结肠癌组织中 p16 基因异常形式之一，有可能成为肿瘤分子诊断的重要标志，MSP 方法有临床普及应用前景。

甲基化特异多聚酶链反应的改进及应用

背景与目的:甲基化特异多聚酶链反应(methylation-specificPCR,MSP)已经成为筛查DNA甲基化异常的最常用方法之一,但其方法繁琐、耗时、非特异性产物多和不经济,有待改进。RUNX3基因是胃癌的抑癌基因,失活的主要机制之一为DNA高甲基化,本研究目的在于用改进的MSP检测肝细胞癌RUNX3基因的甲基化状态。方法:采用玻璃奶回收化学修饰后的DNA,应用专用于GC丰富序列扩增的GC-Melt试剂以改良MSP并对152例肝细胞癌RUNX3基因的甲基化状态进行检测,并与常规MSP方法进行比较。结果:常规MSP方法纯化和回收DNA需要昂贵的纯化柱和高速低温离心机以及16h以上的纯化和回收时间;而在改良方法中,玻璃奶回收化学修饰后的DNA不需昂贵的纯化柱和高速低温离心机,纯化和回收过程只需1h。专用于扩增GC丰富序列的GC-Melt溶液较常规方法明显减少PCR的非特异性产物。51.9%(79/152)的肝细胞癌RUNX3基因呈现高甲基化状态。结论:改良的甲基化特异的PCR技术是筛查DNA甲基化高效、简便的方法。甲基化机制可能是肝细胞癌RUNX3基因失活的重要机制之一。

DNA修复基因MGMT启动子区过甲基化与脑胶质瘤

目的在许多肿瘤中发现启动子区过甲基化而导致O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)的转录失活,本研究拟从胶质瘤患者肿瘤组织和其对应血清中MGMT基因启动子过甲基化是否有一致性对MGMT基因启动子甲基化进行研究。方法采用甲基化特异性PCR法(MSP)进行MGMT基因启动子区甲基化水平的检测。结果27例胶质瘤组织中有14例(51.9%)MGMT甲基化扩增阳性,13例(48.1%)为MGMT去甲基化扩增阳性。相应的血清中有13例(48.1%)MGMT甲基化扩增阳性,14例(51.9%)MGMT去甲基化扩增阳性(P<0.05)。结论胶质瘤患者肿瘤组织和其对应的血清中MGMT基因启动子甲基化状态具有显著相关性。测定血清中MGMT基因启动子区的甲基化状态能反应胶质瘤组织中MGMT基因启动子区甲基化状态。MSP是检测MGMT基因启动子区甲基化灵敏和可靠的方法,可以指导临床脑胶质瘤的个体化化疗方案的设计。

BRCA1基因启动子异常甲基化与散发性乳腺癌的关系

目的探讨散发性乳腺癌BRCA1基因启动子异常甲基化状况及其与散发性乳腺癌关系。方法用甲基化特异PCR(MSP)法对散发性乳腺癌病人癌组织、癌旁组织及乳腺纤维腺瘤组织进行BRCA1异常甲基化检测。结果在58例散发性乳腺癌中有17例癌组织检出了BRCA1基因启动子异常甲基化,甲基化频率为29.3%(17/58),相应的癌旁组织及乳腺纤维腺瘤组织均只检出未甲基化的BRCA1。在组织分型中,浸润性导管癌与浸润性小叶癌无显著差异(P>0.05),二者各自与髓样癌+黏液腺癌有显著差异(P<0.05)。有淋巴结转移的BRCA1基因启动子甲基化率高于无淋巴结转移组(P<0.005)。BRCA1甲基化与散发性乳腺癌的肿瘤分级及病人绝经与否均无显著差异(P>0.05)。结论在散发性乳腺癌中,BRCA1基因启动子具有很高的甲基化率,并与散发性乳腺癌的组织分型、恶性转移等方面有一定的关系。

联合检测粪便ECAD基因甲基化和隐血在结直肠癌诊断中的价值

目的 探讨粪便ECAD甲基化联合隐血在结直肠癌（CRC）中的诊断价值。方法 收集50例健康体检者、50例结直肠良性病变者、50例CRC患者的粪便标本。利用甲基化特异性PCR（MSP）的方法检测粪便中ECAD基因的甲基化情况,根据肠镜病理诊断进行验证,比较粪便ECAD甲基化率、粪便潜血实验（FOBT）及两者联合对CRC诊断的敏感性及特异性,并进行统计学分析。结果 CRC患者粪便ECAD甲基化率（78%）明显高于健康体检者（16%）和结直肠良性病变者（26%）;同时,CRC患者FOBT阳性率（64%）亦明显高于健康体检者（2%）和结直肠良性病变者（26%）,差异有统计学意义（P〈0.001）。粪便ECAD甲基化率与CRC患者肿瘤数目（P=0.048）、病理分级（P=0.006）、TNM分级（P=0.002）及淋巴结转移（P=0.002）密切相关。CRC患者粪便FOBT敏感度为64%（95%CI：49.1%-76.7%）,特异度为86%（95%CI：77.3%-91.9%）;而ECAD敏感度为78%（95%CI：63.7%-88.0%）,特异度为79%（95%CI：69.5%-86.2%）。ROC曲线分析提示ECAD的ROC曲线下面积（AUC）为0.795（95%CI为0.716-0.874）,略高于FOBT的AUC（0.750,95%CI：0.661-0.839）,而两种联合的AUC为0.806（95%CI：0.728-0.884）,诊断效能最高。结论 粪便ECAD基因甲基化的检测是早期诊断CRC的有效方法,其联合FOBT能有效提高诊断效能。

大肠癌p16抑癌基因甲基化及与Dukes分期的关系

目的检测大肠癌患者 p16基因启动子CpG区甲基化的改变 ,探讨其与大肠癌发生、发展和临床资料的关系。 方法采用甲基化特异PCR技术 (MSP法 )研究 5 8例大肠癌标本 p16基因甲基化改变 ,分析临床病理资料。 结果 2 5例标本 (4 3 .1% )呈 p16CpG区甲基化阳性 ;DukesC、D期病人p16CpG区甲基化发生率 (75 % )明显高于DukesA、B期病人 (13.3% )。 结论 p16启动子区甲基化导致p16抑癌基因失活参与了大肠癌的发生和发展 ;

乳腺癌BRCA1基因甲基化改变的研究

目的 研究BRCA1基因启动子CpG区甲基化的改变与乳腺癌临床病理特征的关系。方法 采用甲基化特异PCR技术(MSP法)对60例乳腺浸润性导管癌标本进行了BRCA1启动子CpG区基因甲基化研究,并分析与其临床病理特征的关系。结果 60例乳腺癌患者标本中有13例(21.7％)呈BRCA1 CpG区甲基化阳性。Ⅲ级病人BRCA1 CpG区甲基化发生率(80.0％)明显高于Ⅱ级病人(12.5％)和Ⅰ级病人(5.5％)。淋巴结转移患者BRCA1甲基化发生率(37.0％)明显高于无转移的患者(9.1％)。结论 BRCA1启动子区甲基化导致BRCA1抑癌基因失活,参与乳腺癌的发生和发展。乳腺癌患者BRCA1 CpG区甲基化与分级、淋巴结转移有关。BRCA1甲基化可能可以作为估计乳腺癌患者预后的一个指标。

大肠癌中生长抑素基因甲基化研究

目的生长抑素(somatostatin,SST)不仅能抑制内分泌肿瘤的增殖,而且对消化系实体性肿瘤亦存在抑制作用。本研究旨在探讨生长抑素基因甲基化与大肠癌发生的关系。方法采用甲基化特异PCR(MSP)方法在31对大肠癌标本及癌旁正常组织中检测SST基因启动子甲基化状态;用5-aza-dC处理结肠癌细胞系,RT-PCR方法检测SST基因转录水平。结果 MSP检测发现26例(84%)大肠癌标本及10例(32%)癌旁正常组织中SST基因呈甲基化状态。4个结肠癌细胞系中SST基因均为甲基化状态,并且SW1116细胞经5-aza-dC处理后SST基因表达复活。结论 SST基因甲基化与大肠癌发生相关,是大肠癌发生中的甲基化相关基因。

GSTM1基因多态性及启动子甲基化在结肠癌细胞系中的研究

目的研究参与内毒物代谢的重要酶谷胱甘肽-S-转移酶M1(glutathione-s-transferase M1,GSTM1)在结肠癌细胞系中的基因表达状况与其遗传基因型及启动子甲基化的关系。方法采用多重PCR方法检测GSTM1基因型,甲基化特异PCR(MSP)方法检测GSTM1基因启动子甲基化状态;用5-aza-dC处理结肠癌细胞系,RT-PCR方法检测GSTM1基因转录水平。结果结肠癌细胞系HT29、SW480、SW1116为GSTM1非空白基因型,而HCT116、Lovo、Colo结肠癌细胞系为GSTM1空白基因型。MSP检测发现SW1116细胞中GSTM1基因主要呈非甲基化状态,其他5个细胞系中呈甲基化状态,而且基因表达缺失。经5-aza-dC处理后,HT29和SW480细胞的GSTM1基因表达复活,而HCT116、Lovo、Colo细胞中GSTM1仍无扩增。结论 GSTM1基因转录受到遗传基因型和表观遗传启动子甲基化双重调控。

骨髓增生异常综合征中FANCF蛋白及甲基化研究

目的研究骨髓增生异常综合征(MDS)中FANCF基因甲基化状态及其蛋白表达,探讨FANCF基因甲基化及蛋白表达与MDS发病的相关性。方法以MDS患者骨髓提取的单个核细胞为研究对象,采用免疫组织化学染色法、Western blot检测FANCF蛋白表达、甲基化特异聚合酶链反应(MSP)检测FANCF基因的甲基化状态。结果 FANCF蛋白在MDS-RA组低表达,MDS-RAEB/T组更低表达,对照组正常表达;MDS组与对照组比较表达明显减低,差异有统计学意义(P<0.05)。MDS组有明显甲基化,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 FANCF蛋白在MDS组中表达下调,FA通路不能形成,可能与MDS发病有相关性。FANCF基因在MDS患者中呈现高甲基化状态,提示FANCF基因的高甲基化状态可能在MDS的疾病发生过程中起到一定的作用;MDS-RAEB/T组甲基化状态高于MDS-RA组,提示FANCF基因的甲基化可能与MDS的预后相关。

采用蛋白质组学技术筛选鼻咽癌细胞的甲基化沉默基因

为筛选鼻咽癌的甲基化沉默基因,采用二维凝胶电泳(2-DE)技术分离甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-aza-2-dC)处理与未处理鼻咽癌细胞5-8F的蛋白质,PDquest图像分析软件识别差异蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异蛋白质.然后采用Westernblotting和RT-PCR检测差异蛋白质nm23-H1在药物处理与未处理5-8F细胞中的表达水平,采用甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测nm23-H1基因在药物处理与未处理5-8F细胞中的甲基化水平.建立了5-aza-2-dC处理与未处理5-8F细胞蛋白质的2-DE图谱,识别了49个差异表达的蛋白质点,鉴定了33个差异表达的蛋白质,其中包括nm23-H1在内的15个蛋白质在5-aza-2-dC处理后的5-8F细胞中表达上调,而18个蛋白质表达下调.Westernblotting和RT-PCR结果显示,nm23-H1在5-aza-2-dC处理5-8F细胞后表达上调,MS-PCR结果显示,在5-aza-2-dC处理5-8F细胞后nm23-H1基因甲基化水平下降,结果证实,nm23-H1基因是5-8F细胞中的甲基化沉默基因.15个5-aza-2-dC处理后表达上调的基因可能是5-8F细胞中的甲基化沉默基因,为筛选鼻咽癌甲基化失活基因提供了科学依据.

急性髓系白血病中FANCF/BRCA1蛋白表达及甲基化的检测

目的通过检测急性髓系白血病(AML)患者骨髓液单个核细胞中FANCF/BRCA1蛋白表达及基因甲基化发生率,推测其与AML发病的相关性。方法选取2006年9月—2015年6月中国医科大学附属第一医院、秦皇岛市第一医院、大庆油田总医院血液科自愿签署试验知情同意书的AML患者101例作为研究对象(AML组),其中初发亚组65例,缓解亚组36例;以同期就诊的贫血患者20例为对照组。提取患者骨髓液中的单个核细胞,采用Western印迹法半定量分析FANCF/BRCA1蛋白表达,应用甲基化特异性PCR(MSP)检测FANCF/BRCA1基因的甲基化发生率。结果与对照组比较,AMI组FANCE/BRCA1蛋白表达减低、FANCE/BRCA1基因甲基化率高,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。FANCF与BRCA1检测结果一致:蛋白的表达均与其基因甲基化状态呈负相关性(r=-0.834,P=0.006;r=-0.763,P=0.008)。而FANCF与BRCA1两基因的蛋白表达及甲基化无相关性(r=-0.051,P=0.821;r=-0.155,P=0.490)。结论 FANCF/BRCA1蛋白在AML患者中低表达,导致FA/BRCA1通路中断,与AML发病可能存在相关性。FANCE/BRCA1基因存在高度甲基化,提示两者基因高甲基化可能导致编码蛋白表达缺失,在AML的发病及进展中起到一定的作用。

大肠癌组织p16基因甲基化与临床病理特征的关系

目的 研究p16基因启动子CpG区甲基化的改变与大肠癌发生及其临床病理特征的关系。 方法 采用甲基化特异PCR技术 (MSP法 )研究大肠癌组织 p16基因甲基化 ,并分析其与临床病理特征的关系。 结果 3 0例大肠癌组织中有 12例 (40 .0 % )呈 p16CpG区甲基化阳性。DukesC、D期组织 p16CpG区甲基化发生率明显高于DukesA、B期。有转移的大肠癌组织p16甲基化发生率 (84.6% )明显高于无转移者 (5 .9% )。结论 p16启动子区甲基化导致 p16抑癌基因失活 ,参与大肠癌的发生和发展。大肠癌组织 p16CpG区甲基化与Dukes分期、肿瘤转移有关。p16甲基化可作为评估大肠癌患者预后的

胃癌细胞PTEN甲基化与其表达的相关性

目的:探讨胃癌细胞PTEN基因启动子区域甲基化与其mRNA表达的关系.方法:采用甲基化特异性PCR法(MSP)检测四种胃癌细胞系SGC-7901(中度分化)、BGC-823(低度分化细胞)、MGC-803(低度分化细胞)、HGC-27中PTEN基因甲基化状态,RT-PCR检测四种胃癌细胞系PTEN表达水平(未分化).结果:HGC-27、MGC-803、BGC-823细胞系可检测到PTEN基因启动子的甲基化,SGC-7901细胞未检测到甲基化,甲基化水平的顺序依次为:HGC-27最高(138.217±7.898,P<0.01),MGC-803、BGC-823次之(P>0.05).PTENmRNA表达水平的依次顺序为:SGC-7901最高(0.336±0.079,P<0.01),BGC-823、MGC-803次之(P>0.05),HGC-27表达水平最低(0.113±0.047,P<0.05),其表达水平随着其启动子区甲基化水平增高而降低.PTENmRNA表达及其启动子甲基化水平还与胃癌细胞分化程度相关.结论:胃癌细胞PTEN基因启动子区域出现异常甲基化,可能是导致其mRNA表达异常的主要原因,也可能是导致胃癌发生、发展的重要机制之一.

胶质瘤MGMT启动子甲基化定量检测的MS-HRM方法建立及评估

目的建立甲基化特异高分辨率溶解曲线(Methylation sensitive high resolution melting curve,MS-HRM)定量检测胶质瘤MGMT基因启动子甲基化的方法,用于指导胶质瘤患者术后化疗及预后判断。方法从标本库随机选取胶质瘤组织37例,提取DNA进行甲基化修饰,应用MS-HRM方法和甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)进行MGMT基因启动子区甲基化检测。结果 MSP方法检测显示部分甲基化标本29例(78.4%),较甲基化(13.5%)和未甲基化(8.1%)差异显著。MS-HRM发现MGMT基因启动子甲基化水平在10%~25%和25%~50%的标本分别有14例(37.8%)和17例(49.5%)。结论成功建立MS-HRM检测胶质瘤MGMT启动子甲基化的方法,该方法特异性高、灵敏度强和可重复性,有望应用于临床胶质瘤MGMT启动子甲基化高通量定量检测,以指导个体化治疗。

RASSF1A基因启动子甲基化状态与喉癌关系的实验研究

目的检测喉癌组织的抑制基因RAS相关区域家族1A(Ras associationdomain family 1,isoform A,RASSF1A)甲基化状态,并探讨RASSF1A启动子甲基化与喉癌的关系。方法应用甲基化特异性PCR技术技术检测52例喉癌组织,52例相应癌旁组织及24例对照组织中RASSFIA基因启动子甲基化状态。按年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤分期进行分组,分析RASSF1A基因启动子区甲基化情况与各组临床病理特征的关系。结果 1喉癌组织、癌旁组织及对照组织中RASSFIA基因启动子区甲基化的例数分别65.4%、7.7%、0%。喉癌组甲基化发生率显著高于癌旁组和对照组,差异有显著统计学意义(P<0.05),而癌旁组甲基化发生率与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2RASSF1A基因启动子甲基化情况与喉癌患者的年龄、性别及肿瘤的分化程度、及分期情况关系不明显,按上述临床病理特征分组,各组内比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 1喉癌组织中RASSF1A基因启动子区的甲基化,提示其与喉癌发生关系密切,可能喉癌发生过程中一个重要的分子机制。2不同肿瘤的分化及分期间甲基化程度无明显差异,提示RASSF1A基因发生甲基化可能是喉癌发生中的早期事件。3RASSF1A启动子甲基化有望成为早期诊断喉癌的一个分子标志。甲基化特异性PCR方法是一种快而灵敏的基因甲基化检测方法,有望应用于临床。

甲状腺乳头状癌钠碘同向转运体基因启动子区域CpG岛异常甲基化状态检测及其意义

目的 通过检测甲状腺乳头状癌中钠碘同向转运体(NIS)基因的启动子区域甲基化状态及其与各项临床指标之间的关系,探讨NIS基因甲基化在甲状腺乳头状癌发病过程中的地位、作用和相关机制.方法 取2007年5～7月手术切除的甲状腺乳头状癌及正常组织标本各11份,液氮保存.针对NIS-L区域设计新的甲基化特异PCR(MSP)引物,对所有亚硫酸氢钠修饰后的甲状腺癌及对照组织标本DNA进行MSP检测,比较肿瘤和对照甲状腺组织的NIS-L甲基化状态,分析其与有关临床指标之间的相关性.结果 实验发现11例甲状腺癌中NIS-L区域CpG岛甲基化率达81.8%(9/11),与肿瘤直径存在相关性,与年龄、性别、AJCC分期、淋巴结转移情况、多灶性等临床指标无相关性;相应对照组织中NIS-L甲基化率为36.4%(4/11),与所有临床指标无相关性.结论 甲状腺乳头状癌组织中NIS-L区域CpG岛甲基化率异常增高,且与肿瘤直径存在相关性.NIS-L与其它NIS表达调控因素的关系有待进一步研究.

内皮素-3基因启动子甲基化及其表达在乳腺癌中的临床意义

目的检测内皮素-3(EDN-3)基因启动子甲基化及其表达在乳腺癌组织中的变化,并分析其临床意义。方法采用甲基化特异PCR(MS-PCR)和实时定量PCR(RT-PCR)方法检测42例乳腺癌组织(实验组)及50例正常乳腺组织(对照组)EDN-3基因启动子甲基化发生率及其mRNA表达,比较以上两指标变化在乳腺癌各临床参数之间的统计学差异。结果实验组EDN-3启动子甲基化检出率为64.29%(27/42),对照组EDN-3启动子甲基化检出率为8.00%(4/50),差异有统计学意义(2=42.17,P<0.01),该检出率在患者不同年龄,不同肿瘤组织类型和大小,有否区域淋巴结转移及远处转移之间差异均无统计学意义(P>0.05)。实验组EDN-3 mRNA表达较对照组显著降低,差异有统计学意义(t=-8.21,P<0.01),但这种降低在上述不同临床参数之间差异亦无统计学意义(P>0.05)。结论 EDN-3基因异常甲基化与乳腺癌密切相关,它能影响其m NRA转录水平,对其进行检测能为乳腺癌的早期诊断和判断预后提供帮助。