甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析筛查大肠癌的性能评价

目的评价通过甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS-HRM)检测粪便中人DNA甲基化筛查大肠癌(CRC)的性能。方法收集合格的新鲜粪便标本82例,其中CRC患者27例(CRC组)、进展期腺瘤(AA)患者25例(AA组)和结肠镜阴性的正常人30例(对照组),在LightCycler 480设备上应用MS-HRM技术检测上述粪便中vimentin基因的甲基化状态,并与粪便潜血试验(FOBT)的诊断性能相比较。结果 MS-HRM在CRC组、AA组和对照组中检测vimentin基因甲基化的阳性率分别为81.5%(22/27),80.0%(20/25)和6.7%(2/30)。FOBT在CRC组、AA组和对照组中的阳性率分别为37.0%(10/27),12.0%(3/25)和3.3%(1/30)。在病例组中,MS-HRM和FOBT的诊断敏感性分别为80.8%(42/52)和25.0%(13/52),前者显著高于后者(P<0.05);在对照组中两者的诊断特异性分别为93.3%(28/30)和96.7%(29/30),两者差异无统计学意义(P>0.05)。结论在CRC筛查中,MS-HRM技术检测粪便中vimentin基因甲基化状态的诊断性能明显优于FOBT,具有潜在的应用价值。

基于等位基因特异性引物延伸的高分辨率熔解曲线基因分型方法的建立

目的建立基于等位基因特异引物延伸的高分辨率熔解曲线法(allele-specific-extension high resolution melting curve analysis,ASE-HRM)。方法 ASE-HRM法是在普通高分辨率熔解曲线法(high resolution melting curve analysis,HRM)的PCR反应体系中加入一条等位基因特异性延伸引物(allele-specific-extension,ASE),该引物末端终止于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,匹配一种等位基因。增加热循环次数,使等位基因特异性引物得以延伸。选取rs1869458位点,用ASE-HRM法和直接测序法对194个人源基因组DNA样品进行基因分型。结果通过分析熔解曲线扩增峰,可区分杂合型和纯合型SNP;通过分析有无引物延伸峰,可区分2种纯合型;同时证明长度为11到13个碱基的ASE引物能得到较好的分型结果;使用锁定核酸(locked nucleic acid,LNA)修饰扩增引物可增加扩增产物和延伸产物的解链温度(melting temperature,Tm)差距,简化基因分型。2种方法对所选DNA样品基因分型所得结果完全吻合。结论 ASE-HRM是一种简单、廉价、闭管并能用于检测所有类型SNP的基因分型法。

甲基化敏感性高分辨率熔解曲线检测结直肠癌组织及外周血MGMT基因甲基化

目的用甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法（MS-HRM）定量检测结直肠癌组织及外周血中MGMT基因甲基化水平,并结合结直肠癌病理参数分析探讨MGMT基因甲基化的临床意义。方法以33例结直肠癌组织和配对的正常黏膜组织以及其中16例患者的外周血为研究对象,用MS-HRM进行MGMT基因甲基化检测,分析MGMT基因甲基化与结直肠癌临床病理特征的关系和MS-HRM的方法特点。结果 MS-HRM从33例结直肠癌患者的癌组织中检测到12例（36.4%）MGMT基因启动子不同程度的甲基化（甲基化〈5%1例,5%-10%3例,10%-25%3例,25%-50%2例,50%-75%3例）,对应的正常结直肠组织中仅检测到甲基化〈5%1例（3.0%）。16例外周血中检测到甲基化小于〈5%3例（18.8%）。MGMT基因甲基化与患者的年龄、性别、肿瘤部位无相关性（P〉0.05）,但与结直肠癌的病理分期和分化程度的相关性有统计学意义（P〈0.05）。结论 MS-HRM可定量检测结直肠癌MGMT甲基化水平。MGMT基因甲基化与结直肠癌的进展评估有关。

龟甲的特异性PCR及高分辨率熔解曲线技术鉴别方法研究

目的:建立高效、稳定的龟甲Testudinis Carapax et Plastrum DNA鉴别方法。方法:利用龟甲的特异性聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)鉴别方法和高分辨率熔解曲线(HRM)鉴别方法,根据龟甲及其混伪品COI序列差异,寻找特异性单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点设计鉴别引物,并对PCR反应条件进行优化;并使用通用引物扩增COI区域,产物直接进行HRM分析。结果:当退火温度为60 ℃,循环次数为35,使用设计的龟甲特异性鉴别引物GJ-360.F/R进行PCR扩增,经扩增均获得约360 bp特异性鉴别条带,混伪品皆无条带;使用通用引物RonM-tl和Vl-tl进行PCR扩增,产物使用HRM分析,龟甲药材在模板DNA质量浓度为3.5~87.9 ng ·μL^-1 、引物浓度为0.2 μmol · L ^-1 、镁离子浓度为2.0 mmol · L ^-1 的条件下,龟甲药材标准熔解曲线为双峰,其 T m均值分别为(83.15±0.76)、(87.53±0.69 )℃。结论:特异性PCR和HRM均可作为一种快速准确鉴别龟甲正伪品的鉴定方法。

高分辨率熔解曲线分析技术检测结核分枝杆菌的耐药性

目的:探讨高分辨率熔解曲线分析(High resolution melting,HRM)技术检测结核分枝杆菌耐药突变位点的可行性。方法:对218株结核分枝杆菌进行利福平(RFP)和异烟肼(INH)的药物敏感性测定,并进行耐药基因位点的PCR扩增和测序,同时采用HRM方法检测RFP和INH耐药基因位点情况,分析HRM的敏感性和特异性。结果:218株结核分枝杆菌药敏试验结果显示,有106株(48.6%)对RFP耐药,100株(45.9%)对INH耐药,81株(37.4%)对RFP和INH均耐药。测序发现,101株(46.3%)存在RFP耐药基因的突变,107株(49.1%)存在INH耐药基因的突变。HRM检测结果显示,100株(45.9%)存在RFP耐药基因的突变,103株(47.2%)存在INH耐药基因的突变。分别以药敏试验和测序结果为标准,HRM检测RFP耐药的敏感性为94.3%(100/106)和99.0%(100/101);特异性为97.3%(109/112)和100%(117/117);INH耐药的敏感性为97.0%(97/100)和98.1%(103/105);特异性为97.3%(109/112)和100%(113/113)。结论:HRM快速检测结核分枝杆菌耐药具有较高的特异性和灵敏度,能够满足临床需求。

高分辨率熔解曲线分析及其在基因诊断中的应用

高分辨率熔解曲线分析（high-resolution melting analysis,HRM）是近年来新兴的一种核酸序列分析技术.相较于传统的基因检测技术,HRM不仅据有极高的特异性和理想的灵敏度,而且能够完成高通量样品检测并实现真正无污染的闭管操作,因此逐渐成为现代医学研究与基因诊断的首选技术.目前,HRM在基因突变扫描,基因分型,序列匹配以及甲基化分析等各项领域中都有极高的应用价值.本文就HRM的特点及其在医学研究及基因诊断中的应用做一综述.

MS-HRM检测游离甲基化SEPT9在结直肠癌早期诊断中的应用

目的建立一种稳定的甲基化敏感高分辨率熔解曲线(MS-HRM)定量检测血浆游离甲基化SEPT9的方法,并初步探讨利用此方法进行结直肠癌早期诊断的可行性。方法按照不同比例混合甲基化和未甲基化DNA建立标准品,复管反应作出标准熔解曲线,定量检测36例结直肠癌患者血浆样本和20例正常人血浆样本甲基化SEPT9,并与Methylight进行比较。梯度稀释其中1例结直肠癌血浆游离DNA,分析其甲基化程度与DNA量是否独立。随机取2例结直肠癌样本重复甲基化修饰至MS-HRM分析,以排除修饰不完全对实验结果的影响。结果 SEPT9 MS-HRM法可检出混合甲样本中1%的甲基化,其检测灵敏度达1%。36例结直肠癌患者血浆中检测到25例(69.44%)有不同程度SEPT9基因甲基化,20例正常人血浆样本有2例(10%)呈现1%～5%甲基化。不同DNA量甲基化程度恒定,初步确定检测范围可达皮克级DNA。2例独立重复检测样本检测结果基本符合初次实验结果。结论 MS-HRM法检测游离的甲基化SEPT9简单易行,快速,稳定,敏感性高,检测样本范围广,有望为结直肠癌筛查开拓一个新平台。

阿霉素肾病大鼠凋亡相关基因FADD和APAF1启动子DNA甲基化的变化

目的探讨阿霉素肾病大鼠肾脏组织中凋亡相关基因DNA甲基化的变化与疾病进展的关系。方法 12只SD雄性大鼠随机分为阿霉素肾病组和正常对照组,每组6只。阿霉素肾病组大鼠分别于首次和1周后阴茎静脉注射5 mg/kg和2.5 mg/kg阿霉素造模。于造模后8周经腹主动脉采血,处死大鼠并留取肾脏组织。对两组大鼠血肌酐(Crea)、血尿素氮(BUN)、血清白蛋白(ALB)及尿白蛋白/肌酐比值(UACR)等生化指标进行检测和比较;Masson染色观察肾脏组织病理学改变;TUNEL染色观察大鼠肾小管和肾小球细胞凋亡情况;采用Real-Time PCR技术经高分辨率熔解曲线(HRM)分析法对两组大鼠肾皮质Fas相关死亡区(FADD)和凋亡蛋白酶活化因子1(APAF1)启动子DNA甲基化进行检测,Real-Time PCR检测FADD mRNA表达。结果与正常对照组比较,阿霉素肾病组大鼠Crea、BUN和UACR显著升高(P<0.05或P<0.01),ALB明显降低(P<0.01)。病理组织学检查发现:阿霉素肾病组大鼠肾小球系膜细胞增生明显,毛细血管受压,球囊粘连;肾小管上皮细胞肿胀,间质增生、炎症细胞浸润。TUNEL染色细胞凋亡检测发现,与正常对照组比较,阿霉素肾病组大鼠肾小管和肾小球凋亡细胞数量明显增加(P<0.01)。HRM分析法和Real-Time PCR检测结果显示:与正常对照组比较,阿霉素肾病组FADD启动子DNA呈较高程度的甲基化,FADD mRNA表达明显上调(P<0.05)。结论在阿霉素肾病大鼠中,FADD基因启动子检测序列DNA甲基化程度增高,但其可能并非为影响FADD mRNA表达的主要因素。

粪便SEPT-9和miRNA-34b/c基因甲基化检测在大肠肿瘤筛查中的临床应用

目的评估检测大肠肿瘤患者粪便中SEPT-9和微RNA(miRNA)-34b/c基因甲基化对大肠肿瘤筛查的临床性能。方法采用病例对照研究方法,使用甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法检测大肠肿瘤患者(大肠癌组35例、大肠腺瘤组47例)和正常对照人群(正常对照组52名)粪便中SEPT-9和miRNA-34b/c基因是否存在甲基化,来评估其筛查大肠肿瘤的性能。结果大肠癌组SEPT-9和miRNA-34b/c基因的甲基化阳性率分别为68.6%、71.4%,大肠腺瘤组分别为57.4%、63.8%,正常对照组分别为9.6%、11.5%。3组的SEPT-9、miRNA-34b/c基因甲基化阳性率比较差异均有统计学意义(χ^(2)_(SEPT-9)=37.185,χ^(2)_(miRNA-34b/c)=40.040,P均<0.001),利用Bonferroni法进行两两比较,大肠癌组和大肠腺瘤组的甲基化阳性率比较差异无统计学意义,两者与正常对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.001)。3组联合检测SEPT-9和miRNA-34b/c基因的甲基化阳性率为88.6%、76.6%、13.5%,大肠癌组和大肠腺瘤组联合检测的甲基化阳性率均高于SEPT-9单基因检测和miRNA-34b/c单基因检测(P均<0.05)。结论检测粪便中SEPT-9和miRNA-34b/c基因甲基化具有效好的大肠肿瘤筛查性能,或许可作为大规模人群筛查大肠肿瘤新的生物标志物组合;多基因甲基化联合检测筛查的性能优于单基因。

高分辨熔解曲线分析在肿瘤分子检测中的应用

高分辨熔解曲线分析具有检测成本低、操作简便的特点，且闭管操作无交叉污染的风险，已经成为临床诊断的一大有力工具，尤其在肿瘤的分子检测中已经得到了广泛使用，检测手段包括突变检测、测序前筛查、甲基化程度分析、拷贝数变异分析等，涵盖了肿瘤筛查、诊断、个体化治疗、预后判断等各个阶段。利用高分辨熔解曲线分析具有较高检测灵敏度的特点，与测序技术相结合可以显著提高分子检测的准确性，同时大大降低检测成本，为分子检测技术的发展开拓了新的空间。（中华检验医学杂志，2017，40：80－83）

一种基于HRM技术的快速DNA甲基化检测方法

目的:建立经济可靠的基于MS-HRM技术的检测DNA甲基化的方法。方法:采用简单的沉淀法纯化回收Bis-DNA(重亚硫酸钠处理后的DNA),首次采用picogreen为MS-HRM分析染料,并用新建立的方法检测结直肠癌患者组织SEPT9启动子甲基化水平。结果:新方法的回收率在63%以上,纯度、得率都显著优于经典方法中的Promega Wizard DNA Clean-up System,Picogreen染料可检测到低至0.5%甲基化。共检测34例结直肠癌组织,其中SEPT9异常甲基化的组织33例,占97%,检出率高于文献报导。结论:本文建立的方法简单快速、灵敏度高、重复性好、经济、可操作性强的优点。

胃癌组织septin 9基因甲基化及其临床意义研究

目的研究septin 9基因启动子异常甲基化与胃癌的发生以及临床病理之间的关系。方法采用高分辨熔解曲线法分析septin 9基因启动子的甲基化程度,检测82份胃癌组织、9份匹配的癌旁组织,39份胃癌癌前病变组织和胃癌细胞系AGS及SGC7901。结果 2种胃癌细胞系和胃癌组织中的72.0%存在septin 9基因启动子异常甲基化;显著高于相应的癌旁正常组织(22.2%,P<0.01)。septin 9基因启动子异常甲基化比例与肠型胃癌肿瘤的分化程度和患者性别差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05),与弥漫型胃癌肿瘤的发生及临床病理之间差异无统计学意义(P>0.05)。74.3%肠上皮化生胃黏膜组织的septin 9基因出现甲基化异常,明显高于弥漫型胃癌组织(P<0.05)。结论 septin 9基因启动子异常甲基化在胃癌尤其是肠型胃癌癌变过程中起重要作用,有望成为肠型胃癌早期诊断的分子指标。

皮肤癌中原钙黏蛋白10基因启动子甲基化水平及意义

目的探讨皮肤癌组织中原钙黏蛋白10(protocadherin 10,PCDH10)基因的甲基化水平及临床意义。方法取67例皮肤鳞状细胞癌、85例皮肤基底细胞癌患者手术切除癌组织和癌旁正常组织标本,43例光化性角化病患者活检病变组织及正常组织标本,提取DNA进行甲基化修饰。高分辨率熔解曲线法检测各浓度标准品荧光信号强度,运用软件分析得到甲基化分型图谱,判断样本曲线在标准曲线上的位置,获得样本甲基化程度的数据。结果鳞状细胞癌、基底细胞癌组织中PCDH10基因启动子高甲基化比率(89.6%、87.1%)均高于癌旁组织(11.9%、8.2%)(P<0.05);光化性角化病病变组织PCDH10基因启动子高甲基化比率(51.2%)高于癌旁正常组织(9.3%)(P<0.05);鳞状细胞癌、基底细胞癌组织中PCDH10基因启动子高甲基化比率高于光化性角化病病变组织(P<0.05);鳞状细胞癌组织中PCDH10基因启动子超甲基化比率为23.9%。结论高水平的PCDH10基因甲基化可能被用作皮肤癌的标志物,其中超甲基化可作为鳞状细胞癌的标志,而低水平的PCDH10甲基化可作为皮肤病早期发现的指标。

MS-HRM在遗传性非息肉性大肠癌筛查中的应用

目的探讨甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS-HRM)在遗传性非息肉性大肠癌(HNPCC)筛查中的应用价值。方法采用实时荧光定量PCR技术检测miR-195在41例散发性大肠癌(SCRC)和9例HNPCC患者癌组织及对应癌旁正常组织(距离癌组织>5 cm)中的表达水平,随后使用MS-HRM检测miR-195启动子区域CpG岛甲基化情况。结果 miR-195在HNPCC癌组织中的表达量为1.20±1.48,甲基化比例为55.56%(5/9);miR-195在SCRC组织中的表达量为0.76±1.06,甲基化比例为58.54%(24/41),差异无统计学意义(P>0.05);miR-195在肠癌组织及癌旁正常组织中的平均表达水平分别为0.837±1.145和2.236±2.468,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 miR-195在SCRC和HNPCC癌组织中的表达有无差异尚待进一步研究。miR-195可能有助于抑制肠癌发展,并且因其甲基化而参于大肠癌的发病机制。

两种SNP分型方法的比较及其在柚品种鉴定中的应用

用两种常用的 SNP 分型方法,等位基因特异性 PCR 法(Allele-specific PCR,AS-PCR)和高分辨率熔解曲线分析(High resolution melting analysis,HRMA),对 16 个柚栽培品种和 8 个柚杂种后代材料进行了 7 个 SNP 位点的分型研究。结果表明这两种方法所得的分型结果相同,都将 24 个样本分成了 22 种基因型。值得一提的是,样本‘八朔’与‘红八朔’,‘红甘夏’与‘川野夏橙’之间在所测位点无差别,表明其应当是同一来源的无性系变异。‘早熟真龙柚’和‘中熟真龙柚’的分型结果表明它们的基因型不同,看来并非是起源同一基因型的不同芽变品种,也不存在亲子关系。可见,AS-PCR 和 HRMA均适用于柚类品种的区分和鉴定。AS-PCR 法是一种准确、低成本的 SNP 分型方法,适合普通实验室使用,惟对 PCR 反应体系要求严格。HRMA 分型法具有准确、快速、简便、分析量大的特点,但需要专门的设备,试剂成本也高。