应用甲基化特异性聚合酶链反应分析P15基因对成人急性白血病微小残留病灶的检测价值

目的 :评价由甲基化特异性聚合酶链反应分析P15基因甲基化对成人急性白血病微小残留病灶的检测价值。方法 :运用甲基化特异性聚合酶链反应 ,分析了 38例各种类型的急性白血病在初诊时和缓解后的不同阶段P15基因的甲基化状态。结果 :①甲基化特异性聚合酶链反应检测P15基因甲基化的敏感性为 2 .0× 10 -4。② 38例急性白血病初诊时的P15基因甲基化的出现率为 6 8.4 % ,正常对照组无甲基化。③P15基因甲基化可能与疾病的预后有关。经治疗后P15基因甲基化消失的病人与P15基因甲基化持续存在的病人复发率之间的差异有显著性 (0 %比 6 8.8% ,P <0 .0 1)。结论 :P15基因甲基化状态在急性白血病中有较高的检出率 (达 6 8.4 % )。应用甲基化特异性聚合酶链反应分析急性白血病P15基因甲基化状态的特异性和敏感性高。该指标可监测急性白血病微小残留病灶相关的情况 ,值得在临床上推广。

巢式甲基化特异性PCR检测肺癌病人WIF-1基因启动子区异常甲基化

为了检测肺癌患者血浆中WIF-1基因启动子区的甲基化状态,收集肺癌患者及健康对照者的血浆标本,采用巢式甲基化特异性PCR(nMSP)法检测WIF-1基因启动子区甲基化状态,并与普通甲基化特异性PCR(MSP)法进行了比较,结果在58例肺癌患者血浆样品中经nMSP法发现20例WIF-1基因启动子的过甲基化,用MSP法只检出10例,有吸烟史组WIF-1基因的甲基化率高于无吸烟史组(P<0.05).而20例正常对照血浆中都未检测到WIF-1基因启动子的过甲基化;表明利用巢式MSP(nMSP)法检测外周血血浆中WIF-1基因启动子的甲基化,可为非损伤性筛选和早期诊断肺癌提供有价值的信息.

子宫内膜癌中DKK-1基因启动子低甲基化改变与其临床病理特征的关系

目的探索Dickkopf相关蛋白1(DKK-1)基因启动子区甲基化变化与子宫内膜癌临床病理特征的关系。方法采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)对52例子宫内膜癌、30例子宫内膜不典型增生患者及25例正常子宫内膜受试者进行DNA甲基化状态检测。免疫组织化学[链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(immunohistochemistry,streptomyces antibiotin protein-peroxidase binding,IHC S-P)]法测定雌激素受体、孕激素受体在子宫内膜癌细胞中的表达。结果检测到38例(73.08%)子宫内膜癌组织中DKK-1基因启动子区发生低甲基化改变,而子宫内膜非典型增生组织中为14例(46.67%)及正常子宫内膜组织为9例(36.00%)(χ^(2)=11.289,P=0.030)。DKK-1低甲基化阳性率在子宫内膜癌患者的不同国际妇产科联盟(FIGO)分期、病理类型和分级、雌、孕激素受体表达中差异具有统计学意义(P=0.043)。结论DKK-1基因启动子区低甲基化可能是子宫内膜癌发生中的早期且频发事件,且可能与子宫内膜癌的侵袭、迁移和不良预后密切相关。

巢式甲基化特异性PCR检测肝细胞癌患者血清中RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化

为了检测肝细胞癌患者血清中RASSF1A和CDH13基因启动子的甲基化状态,收集肝细胞癌患者及健康对照者的血清标本,采用巢式甲基化特异性PCR(nMSP)法检测RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化状态.结果肝细胞癌患者血清样品中RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化率为53.12%和31.25%,68.75%的患者血清可以检测到异常甲基化,正常对照血清中未检测到RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化,RASSF1A和CDH13基因甲基化与患者的临床病理资料无明显相关性(P>0.05);表明nMSP法检测血清中RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化具有较高的敏感性,可为肝细胞癌的筛查、早期诊断和预后判断提供有价值的信息.

甲基化特异性PCR检测肺癌p16基因甲基化及其临床意义

目的:探讨甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specificPCR,MSPCR)在肺癌临床诊断中的应用价值。方法:选取56例肺部疾病住院患者手术切除的病变肺组织和相应的支气管肺泡灌洗液(BALF)及痰标本,其中32例为肺癌,24例为良性肺部疾病。标本经一般处理,PCR扩增后,产物经电泳EB染色,紫外灯下观察。结果:32例肺癌组织标本中,14例(43.8%)在p16基因启动子区域呈现异常甲基化,其中9例(64.3%)在相应的BALF中检测出甲基化存在,5例(35.8%)在相应的痰标本中也检测出甲基化存在。24例良性肺部疾病,其中肺囊肿10例,肺结核14例,手术切除标本和BALF及痰标本中均未检测出p16基因甲基化存在。结论:MSPCR技术对肺癌患者BALF及痰标本中的异常甲基化检测具有高度特异性,是一项有潜力的肺癌早期诊断新技术。

甲基化特异性PCR检测胃癌p16基因甲基化及其临床意义

目的初步探讨甲基化特异性聚合酶链反应(MSPCR)在胃癌临床诊断中的应用价值。方法选取47例胃癌患者的癌组织及配对的癌旁组织,11例远离肿瘤的正常胃黏膜组织。标本经一般处理,PCR扩增后,产物经电泳EB染色,紫外灯下观察。结果47例胃癌组织标本中,22例(46.2%)在p16基因的启动子区域呈现异常甲基化;47例癌旁组织标本中,28例(58.6%)也检测出甲基化存在;11例正常胃黏膜组织标本中均未检测出p16基因甲基化存在。结论MSPCR技术对胃癌患者组织标本中的异常甲基化检测具有高度特异性,是一项具有潜力的胃癌早期诊断新技术。

类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞IL-10基因启动子甲基化状态研究

白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)是在类风湿性关节炎中发挥重要免疫调节作用的细胞因子,其基因失活与已分化的Th1和Th2细胞染色质结构重塑有关。为了探讨IL-10基因启动子甲基化及基因失活在类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)发病和进展中的作用,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)及甲基化特异性聚合酶链反应(MSP),分别检测34例类风湿性关节炎患者和30例健康人外周血单个核细胞IL-10mRNA、蛋白表达水平及基因启动子甲基化状态。结果显示,病例组IL-10mRNA及蛋白表达均低于健康对照组,无统计学差异(P>0.05)。病例组甲基化率(85.29%)高于健康对照组(43.33%),具有统计学差异(χ2=12.439,P=0.000)。IL-10基因启动子甲基化状态与其mRNA表达呈显著负相关(r=?0.579,P=0.001),与所累关节数显著相关,但与血沉(ESR)、C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)、年龄均无相关性(P>0.05)。IL-10mRNA表达与年龄、所累关节数、ESR、CRP及RF均无相关性(P>0.05)。上述结果提示,启动子甲基化可能是IL-10基因失活的重要机制,IL-10基因异常高甲基化状态可能参与了RA的发生发展。

谷胱甘肽过氧化物酶3甲基化及蛋白表达在胃癌中的临床意义

目的探讨血浆谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)3基因启动子甲基化及GPX3蛋白表达在胃癌发病中的临床意义。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)方法检测胃癌组和胃炎组血标本中的GPX3甲基化程度;采用免疫组化方法检测胃癌组和癌旁正常组织标本中的GPX3蛋白表达情况,分析其与临床病理特征间的关系。结果 1胃癌组GPX3甲基化程度显著高于胃炎组(P<0.01);胃癌伴有淋巴结转移组GPX3甲基化程度显著高于无淋巴结转移组(P<0.05);胃癌组GPX3甲基化程度与患者年龄、性别和肿瘤分化程度、浸润情况、TNM分期无关(P>0.05);2胃癌组GPX3蛋白表达较癌旁正常组显著降低(P<0.01);胃癌伴有淋巴结转移组GPX3蛋白表达显著低于无淋巴结转移组(P<0.05);胃癌组GPX3蛋白表达与患者年龄、性别和肿瘤分化程度、浸润情况、TNM分期无关(P>0.05);3胃炎组GPX3蛋白表达与癌旁正常组无显著差异(P>0.05)。结论GPX3基因启动子区高甲基化通过下调GPX3蛋白表达,参与胃癌发生和促进淋巴结转移,有潜力成为诊断胃癌、判断预后的预警分子指标和临床治疗中的基因调控靶点。

ABCC8、CHFR、BMP3B、LOX、PRSS21和RASSF1A基因启动子的甲基化状态可能与3种乳腺癌细胞株对5-FU的敏感性相关

目的:寻找与乳腺癌细胞株间药物敏感性差异相关的基因启动子CpG岛甲基化异常,为DNA甲基化异常作为临床化疗敏感性预测手段提供依据。方法:用MTT法测定3种乳腺癌细胞株(Bcap-37、T47D和ZR-75-30)对9种化疗药物(紫杉醇、紫杉特尔、长春瑞宾、5-氟尿嘧啶(5-FU)、双氟去氧胞苷、表阿霉素、丝裂霉素、依立替康和顺铂)的敏感性;同时用甲基化特异性PCR检测23个基因在3种乳腺癌细胞株中的甲基化状态。结果:受试的3种乳腺癌细胞株仅对5-FU的敏感性有明显差异。其中Bcap-37(IC50:317.386μg/mL)对5-FU相对耐药,而ZR-75-30(IC50:6.676μg/mL)和T47D(IC50:73.076μg/mL)对5-FU相对敏感。23个基因中,有6个基因:ABCC8、CHFR、BMP3B、LOX、PRSS21和RASSF1A在敏感和耐药细胞株中的甲基化状态有差异。其中ABCC8、CHFR和BMP3B在5-FU耐药细胞株中呈相对高甲基化状态,而LOX、PRSS21和RASSF1A则在对5-FU敏感的细胞株中呈相对高甲基化状态。结论:本研究所发现的6个基因的甲基化状态可能与乳腺癌细胞株对5-FU化疗敏感性相关,为下一步进行临床评估和机制探讨提供了依据。

新疆伊犁地区维吾尔、汉族不同人群变应性鼻炎患者IL-4基因甲基化比较研究

目的探讨IL-4基因启动子区甲基化在维吾尔、汉族两个民族变应性鼻炎(AR)患者中的差异。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP),病例组维吾尔族、汉族AR患者各31例,健康对照组维吾尔族、汉族各31例,检测其外周血IL-4基因甲基化状态。结果维吾尔族、汉族AR患者IL-4甲基化率均高于健康对照组,有统计学意义(P<0.05);维吾尔族、汉族AR患者IL-4甲基化率相比较,无统计学差异(P>0.05)。维吾尔族、汉族健康对照组未甲基化率相比较,有统计学差异(P<0.01)。结论 IL-4基因高甲基化是导致AR患病的一个重要原因.汉族人群比维吾尔族易患AR。

非小细胞肺癌患者血浆TIMP-3、p16基因甲基化的检测及其临床意义

目的检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者癌组织与血浆中组织金属蛋白酶抑制因子-3(TIMP-3)、p16基因甲基化状态,研究血浆中两种基因的检测及联合检测在NSCLC筛查和鉴别诊断中的意义。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)技术,检测110例NSCLC患者癌组织、癌旁组织和外周血血浆TIMP-3、p16基因的甲基化状态,并对110例正常对照组血浆样品进行同样检测,比较各组检测结果。结果患者癌组织中TIMP-3、p16、联合检测的基因甲基化率分别高于癌旁组织(P<0.01);外周血血浆中TIMP-3、p16、联合检测基因甲基化率分别高于正常对照组血浆(P<0.01);血浆中TIMP-3、p16和联合检测的基因甲基化检出率与NSCLC临床分期、临床分类以及病理类型的对比差异均无统计学意义。结论对患者外周血浆TIMP-3、p16基因甲基化的联合检测可提高肺癌的检出率,为肺癌的筛查和鉴别诊断提供有价值的参考信息。

结直肠癌C-erbB-2基因启动子CpG岛甲基化状态及其与C-erbB-2蛋白表达的关系

目的了解结直肠癌组织C-erbB-2基因启动子区CpG岛甲基化状态、C-erbB-2蛋白表达水平及两者之间的关系。方法取经病理确诊的43例结直肠癌组织和相应癌旁组织,分别用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)和免疫组织化学法(IHC)检测C-erbB-2启动子区CpG岛的甲基化和C-erbB-2蛋白表达水平。结果癌组织和癌旁组织中C-erbB-2启动子区CpG岛甲基化率分别为44.2%和74.4%,差异具有统计学意义(P=0.004)。癌组织和癌旁组织中C-erbB-2蛋白过度表达率分别为67.4%和27.9%,差异具有统计学意义(P=0.000)。C-erbB-2蛋白表达水平与肿瘤分期相关。结直肠癌组织C-erbB-2启动子区CpG岛甲基化状态与C-erbB-2蛋白表达水平呈显著相关(r=0.331,P=0.03)。结论结直肠癌中C-erbB-2基因启动子区CpG岛的低甲基化可能在C-erbB-2蛋白过度表达中起一定作用,有望成为有用的肿瘤分子诊断标记和治疗靶点。

乳腺癌C-erbB-2蛋白表达与基因CpG岛甲基化状态和mRNA表达的关系

目的探讨乳腺癌C-erbB-2蛋白表达与基因CpG岛甲基化状态和mRNA表达的关系。方法取经病理确诊的52例乳腺癌组织,分别用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)、免疫组织化学法(IHC)和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测C-erbB-2启动子CpG岛甲基化状态、C-erbB-2蛋白表达水平和C-erbB-2 mRNA的表达。结果 C-erbB-2蛋白阴性和阳性的2组乳腺癌组织的非甲基化率分别为0%和23.5%,CpG岛低甲基化与C-erbB-2蛋白表达呈显著正相关(r=0.413,P=0.03)。C-erbB-2蛋白阴性和阳性组织中C-erbB-2 mRNA表达量分别为0.098±0.041和0.20±0.062,与C-erbB-2蛋白表达呈显著正相关(r=0.356,P=0.03)。结论 C-erbB-2启动子CpG岛的低甲基化和C-erbB-2 mRNA的表达均与C-erbB-2蛋白的高表达相关,C-erbB-2基因启动子的低甲基化可能在C-erbB-2蛋白过度表达中起一定作用。

肺癌E-cadherin基因启动子CpG岛甲基化的研究

目的检测肺癌组织、相应的癌旁组织及正常肺组织中E-cadherin基因启动子CpG岛甲基化水平,探讨肺癌的发病机制。方法采用甲基化特异性PCR技术检测22例肺癌组织、相应的癌旁组织和9例正常肺组织中E-cad-herin基因启动子CpG岛甲基化水平。结果肺癌中E-cadherin基因启动子CpG岛完全甲基化率为13.6%(3/22),部分甲基化率为27.3%(6/22),总甲基化率为40.9%(9/22),显著高于相应癌旁组织中该基因的甲基化率9.1%(2/22)。9例正常肺组织中该基因未发生甲基化。此外,E-cadherin基因启动子CpG岛异常甲基化与患者性别、年龄无关,甲基化的发生率随着肿瘤的分期早晚有上升的趋势。结论E-cadherin基因启动子CpG岛的异常甲基化是肺癌发生中的常见分子事件,可能参与了肺癌的发生发展过程。

胃癌环氧化酶-2、hMLH1及hMSH2微卫星不稳定与基因调控的关系

目的检测临床手术切除43例胃癌及相应正常组织COX-2、hMLH1和hMSH2微卫星不稳定状态MSI及三种基因启动子甲基化情况,并进一步探讨它们与胃癌发生的关系。方法采用聚合酶链反应(PCR)技术检测5个位点的MSI状态;甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR,MSP)方法检测胃癌及正常组织COX-2、hMLH1及hMSH2三种基因启动子CpG岛甲基化状态。结果43例胃癌中MSI总检出率为48.84%(21/43),五个位点的MSI检出率无显著差别。COX-2和hMLH1基因启动子CpG岛甲基化在43例胃癌中分别有8例和13例,正常组织中未检测到。hMSH2基因启动子CpG岛在胃癌及正常组织中均未检测到甲基化。在MSI-H组hMLH1基因启动子CpG岛甲基化率显著高于MSS组(P<0.01);而在MSI-H和MSI-L组间以及MSI-L和MSS无差别。MSI-H组中COX-2基因启动子CpG岛甲基化8例,且有7例胃癌同时出现hMLH1和COX-2基因启动子CpG岛甲基化。结论在MSI胃癌(尤其是MSI-H型胃癌)的发生、发展过程中可能同时出现了hMLH1和COX-2基因启动子CpG岛的甲基化(即表型遗传修饰)。MSI胃癌hMLH1基因启动子CpG岛甲基化率高于MSS胃癌,提示检测hMLH1基因启动子CpG岛甲基化对于判断肿瘤类型有一定意义。

WIF-1基因启动子甲基化与肝细胞癌的相关性研究

目的:探讨肝细胞癌(HCC)的发生与WIF-1基因启动子甲基化的相关性。方法:通过甲基化特异性PCR(MSP)检测WIF-1基因启动子在76例(实验组)HCC组织中的甲基化率,并随机留取伴肝硬化患者癌旁肝硬化组织标本47例(对照组),分析WIF-1基因启动子甲基化与HCC的相关性。结果:与肝硬化癌旁组织比较,HCC组织WIF-1基因启动子甲基化阳性率明显增高(P<0.05),并且HCC组织中WIF-1甲基化阳性率与甲胎蛋白(AFP)之间存在负相关关系(r=-0.759,P<0.001)。结论:WIF-1基因启动子甲基化与HCC的发生有关;在HCC中WIF-1基因启动子甲基化与AFP浓度呈明显负相关关系。

卵巢癌HOXA10基因启动子区低甲基化改变与其临床病理特征的关系

目的:探讨HOXA10基因启动子区甲基化与卵巢上皮性癌(卵巢癌)的关系。方法:运用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)法检测29例卵巢癌标本及对照组16例正常卵巢组织中HOXA10基因启动子甲基化状态,并分析HOXA10基因甲基化状态与不同临床病理特征的联系。结果:检测到17例(58.62%)卵巢癌组织HOXA10基因启动子区发生低甲基化改变,另外4例甚至为完全去甲基化改变;而仅有4例(25.00%)正常卵巢组织HOXA10基因启动子区发生低甲基化(P<0.05)。HOXA10低甲基化阳性率随淋巴转移而增高(P<0.05)。不同年龄、瘤体大小、WHO病理分级、FIGO临床分期和HOXA10基因低甲基化未见明显相关性(P>0.05)。结论:HOXA10基因启动子区低甲基化为频发事件,提示与卵巢癌患者的不良预后相关,可作为卵巢癌判断预后的生物学标志物。

WIF-1基因启动子区甲基化在胃癌组织中的检测

目的检测胃癌组织及正常胃黏膜组织中WIF-1基因启动子区甲基化情况，并结合临床病理资料，探讨WIF-1基因甲基化状态与胃癌发生、发展的相关性。方法应用甲基化特异性聚合酶链反应（methylation—specinc PCR，MSP）检测30例胃癌组织、30例癌旁组织及10例正常胃黏膜组织中WIF-1基因启动子区甲基化情况。结果胃癌组织、癌旁组织及正常对照组WIF-1基因启动子甲基化阳性率分别为76．6％（23／30）、13．3％（4／30）和0．0％（0／10），胃癌组织甲基化率明显高于后两组，差异有统计学意义（均P〈0．05）。胃癌组织中不同年龄、性别、分化程度的WIF-1基因甲基化阳性率差异均无统计学意义；有淋巴结转移组甲基化率（90％）高于无淋巴结转移组甲基化率（50％），差异有统计学意义（P〈0．05）；而Ⅲ～Ⅳ期和Ⅰ～Ⅱ期胃癌组织中WIF-1基因甲基化阳性率分别为90．5％与44．4％，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论WIF-1基因启动子区发生高甲基化导致其表达下调或缺失与胃癌的发生、发展以及临床病理特征有着密切的关系，通过MSP法检测胃癌组织及正常组织的甲基化率，为胃癌的早期诊断及综合治疗寻找新的靶点。

新疆哈萨克族和汉族食管癌患者金属硫蛋白-3CpG岛甲基化的研究

目的:检测分析和比较新疆哈萨克族和汉族食管癌及癌旁组织中金属硫蛋白-3(metallothionein-3,MT-3)基因启动区CpG岛的甲基化情况,为寻找新疆哈萨克族食管癌诊断治疗的分子标记物提供线索。方法:采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific polymerase chain reaction,MSP)的方法,检测33例哈萨克族和30例汉族食管癌患者食管癌组织和癌旁组织中MT-3基因启动子区CpG岛的甲基化发生状况。结果:33例哈萨克族食管癌组织和癌旁组织标本中MT-3基因启动子区甲基化发生率分别2为66.7%(22/33)和27.3%(9/33),差异有统计学意义(χ=10.280,P=0.001);30例汉族食管癌组织和癌旁组织标本中MT-3基因启动子2区甲基化发生率分别为56.7%(17/30)和26.7%(8/30),差异亦有统计学意义(χ=5.554,P=0.018)。哈、汉民族之间癌组织和癌旁组2 2织MT-3基因启动子区甲基化率的差异均无统计学意义(χ=0.666,P=0.414;χ=0.003,P=0.957)。结论:MT-3基因启动子区CpG岛的甲基化可能与食管癌的发生与发展有关,但不是哈族食管癌患者的特异性致病因素。

顺序特异性引物法快速检测胰腺癌K-ras基因点突变

目的 研究简捷、特异、敏感的检测胰腺癌K-ras基因点突变的方法及其在胰腺疾病中定性诊断的价值。方法 采用针对K-ras基因点突变方式（CGT、GAT、GTT）设计的顺序特异性引物（SSP）,先后对胰腺癌石蜡包埋组织、冰冻新鲜组织、细针穿刺组织及胰液进行多聚酶链反应（PCR）,扩增产物借助常规电泳和染色检测有无K-ras基因突变及突变方式。结果 胰腺癌石蜡包埋组织、冰冻新鲜组织、细针穿刺组织及胰液中K-ras基因点突变率分别为74.2％、95.1％、91.4％及94.1％,而所有被检测的慢性胰腺炎、胰岛素瘤、壶腹癌、胆管癌、十二指肠乳头癌及外伤胰腺的组织标本和胰液标本均无K-ras基因突变发生。结论 该检测法简便、快速、特异、敏感,具有临床实用性,可以作为鉴别胰腺肿块良恶性和诊断胰腺癌的一种方法。