基于甲基化特异性PCR的外周血循环游离DNA甲基化检测对乳腺癌诊断价值的荟萃分析

目的通过Meta分析系统评估基于甲基化特异性PCR(MSP)的外周血循环游离DNA(cfDNA)甲基化检测对乳腺癌的诊断价值。方法检索PubMed、Embase、Cochrane数据库,检索时间为2011年1月至2021年12月,以“Breast neoplasms”“Breast cancer”“Methylation”“Cell-free DNA”等为检索词,检索有关血液循环cfDNA甲基化用于乳腺癌诊断的文献,根据纳入及排除标准筛选文献。使用QUADAS-2对纳入文献进行质量评价,提取研究数据并使用Stata 16.0对各效应量进行合并,分析异质性及来源,以Deek’s法检验发表偏倚。结果共检索318篇文献,最终纳入12篇文献的27项研究进行Meta分析,患者2195例,纳入研究存在高度异质性(I^(2)>50.00%)。采用随机效应模型合并灵敏度为0.43[95%CI(0.31~0.56)],合并特异度为0.97[95%CI(0.94~0.99)],合并阳性似然比(LR+)为16.30[95%CI(7.00~37.80)],合并阴性似然比(LR-)为0.59[95%CI(0.47~0.73)],合并诊断比值比(DOR)为28.00[95%CI(11.00~70.00)],合并AUC为0.85[95%CI(0.82~0.88)]。结论基于MSP的外周血cfDNA甲基化检测对乳腺癌有较高的辅助诊断价值。

甲基化特异性PCR法和限制性内切酶-PCR法检测脑胶质瘤hMLM1基因启动子区甲基化

目的研究脑胶质瘤中hMLM1基因启动子区的甲基化状态,并比较不同的甲基化检测方法。方法采用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)法和限制性内切酶-PCR法,检测42例脑胶质瘤和5例正常脑组织中hMLM1基因启动子区的甲基化状态。结果用MSP法和限制性内切酶-PCR法检测,hMLM1启动子区甲基化率分别为4.8%(2/42)和11.9%(5/42),启动子区甲基化与性别、年龄、病理类型和病理分级无明显的相关性。结论在脑胶质瘤中hMLM1基因启动子区甲基化少见,MSP法和限制性内切酶-PCR法是简单、灵敏的甲基化检测方法。

甲基化特异性PCR方法诊断Prader-Willi综合征

目的Prader-Willi综合征(PWS)是多系统异常的复杂临床综合征,仅根据临床症状很难诊断,国外已建立快速、高效、特异性、敏感性均佳的甲基化特异性PCR(MS-PCR)方法用于临床诊断,但我国还未有系统的对照研究。该研究目的便是建立PWS的MS-PCR诊断方法,并对临床疑似患者进行筛查。方法将44例受试者,分为正常对照组(16例)、临床确诊患者组(7例)及临床疑似患者组(21例)。采用盐析法提取基因组DNA;应用CpGemoneTMFast Modification试剂盒行亚硫酸盐修饰;以正常人为阴性对照,未修饰的基因组DNA为系统对照,以M(母源)、P(父源)两对引物同时对修饰产物行PCR;扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离。结果①16例正常对照的PCR结果同时显示M,P两条带,7例临床确诊的PWS患者均只显示一条M带;②经MS-PCR筛查的21例临床疑似患者,2例确诊为PWS,其他19例排除PWS。结论该研究成功建立MS-PCR,并对疑似患者进行了筛查确诊。MS-PCR为特异高效的PWS确诊方法且方便易行。

利用甲基化特异性引物高通量检测DNA甲基化

建立一种基于甲基化特异性引物和SAGE技术的高通量DNA甲基化定量检测新方法(MSP-SAGE),首先利用亚硫酸氢钠对基因组DNA进行处理,使未甲基化的C转变为U,而甲基化的CpG不变.将处理和未处理的DNA双链变性后用随机引物PNNNNCG对存在含有CG的单链进行延伸,而无甲基化CG的单链处则不能延伸;将差异延伸的单链序列和频次信息经过系列分子操作后,引入PCR扩增模板;对中间带有未知序列的PCR扩增产物进行串连克隆测序.将来自于未处理组和处理组的某一CpG位点的序列出现的次数定义为[Tags]A和[Tags]B,将标准系列的实际甲基化水平和[Tags]B/[Tags]A之间建立线性回归方程.根据每一CpG位点的[Tags]B/[Tags]A比值可反推该位点的甲基化水平.MSP-SAGE具有良好的线性,基于标准系列的[Tags]B/[Tags]A与其实际甲基化水平的标准曲线方程为y=1.455x(R2=0.984,P<0.01).MSP-SAGE的回收率在95%到110%之间,精确度位于4.2%和10.5%,检测限在3%左右,单次检测通量可达24个CpG位点.MSP-SAGE是一种很有应用前途的高通量DNA甲基化定量检测方法.

巢式甲基化特异性PCR检测肺癌病人WIF-1基因启动子区异常甲基化

为了检测肺癌患者血浆中WIF-1基因启动子区的甲基化状态,收集肺癌患者及健康对照者的血浆标本,采用巢式甲基化特异性PCR(nMSP)法检测WIF-1基因启动子区甲基化状态,并与普通甲基化特异性PCR(MSP)法进行了比较,结果在58例肺癌患者血浆样品中经nMSP法发现20例WIF-1基因启动子的过甲基化,用MSP法只检出10例,有吸烟史组WIF-1基因的甲基化率高于无吸烟史组(P<0.05).而20例正常对照血浆中都未检测到WIF-1基因启动子的过甲基化;表明利用巢式MSP(nMSP)法检测外周血血浆中WIF-1基因启动子的甲基化,可为非损伤性筛选和早期诊断肺癌提供有价值的信息.

甲基化特异性PCR检测FMR1和XIST基因甲基化实验方法的建立

建立一种快速、灵敏的检测脆性X智障基因(fragile X mental retardation,FMR1)、X染色体失活基因(Xchromosome inactivation,XIST)甲基化的方法.用亚硫酸氢钠和对苯二酚对基因组DNA进行脱氨基修饰.以修饰后的DNA为模板,用两套不同的引物对:1对甲基化特异性引物和1对非甲基化特异性引物扩增FMR1基因(CGG)n重复序列区、FMR1和XIST基因的启动子区.PCR产物进一步克隆、测序.以亚硫酸氢钠和对苯二酚脱氨基修饰后的DNA为模板进行PCR扩增后的产物与预期基因目的基因片段大小相符合,无非特异性扩增产物.测序结果表明,FMR1、XIST基因中的非甲基化的C碱基转变为U碱基,而CpG岛被甲基化的C碱基不改变.成功地建立了检测FMR1、XIST甲基化的方法,为实验室诊断脆性X综合征提供了新的方法.

肺癌组织、支气管肺泡灌洗液及痰标本中p16基因甲基化特异性PCR检测

目的 :探讨肺癌组织、支气管灌洗液及痰标本中p16基因甲基化特异性PCR检测的临床应用价值。方法 :选取 5 6例肺部疾病住院患者手术切除的病变肺组织和相应的支气管肺泡灌洗液 (BALF)及痰标本 ,其中 32例为肺癌 ,2 4例为良性肺部疾病。标本经一般处理 ,PCR扩增后 ,产物经电泳EB染色 ,紫外灯下观察。结果 :32例肺癌组织标本中 ,14例 (4 3.8% )在p16基因启动子区域呈现异常甲基化 ,其中 9例 (6 4 .3% )在相应的BALF中检出甲基化存在 ,5例 (35 .8% )在相应的痰标本中也检出甲基化存在。 2 4例良性肺部疾病 ,其中肺囊肿 10例 ,肺结核 14例 ,无论在手术切除标本还是BALF和痰标本中均未检出p16基因甲基化存在。结论 :MSP技术对肺癌患者BALF及痰标本中P16基因的异常甲基化检测具有高度特异性 ,是一项很有潜力的肺癌早期诊断新技术。

实时荧光定量PCR和甲基化特异性PCR检测结直肠癌APC、MLH1基因甲基化状态

背景:启动子区甲基化致肿瘤抑制基因失活在结直肠癌的发生、发展中起重要作用,检测肿瘤相关基因的甲基化状态,可能为寻找新的结直肠癌诊断、预后相关标记物提供依据。目的:比较实时荧光定量PCR(FQ-PCR)与甲基化特异性PCR(MSP)检测基因甲基化状态的差异。方法:以FQ-PCR检测66例结直肠癌组织和20例癌旁组织中与结直肠癌的发生、发展相关的抑癌基因APC和错配修复基因MLH1的甲基化状态,同时以MSP检测结直肠癌组织中APC基因的甲基化状态。结果:根据FQ-PCR结果,结直肠癌组织中APC、MLH1基因甲基化阳性率显著高于癌旁组织(48.5%和54.5%对0%和0%,P=0.000)。FQ-PCR和MSP可检出的甲基化阳性对照DNA最低浓度分别为0.015 ng/μl和1.5 ng/μl,两者对APC基因甲基化状态的检测结果差异有统计学意义(P<0.05)。结论:在DNA甲基化的检测手段中,FQ-PCR的敏感度优于MSP。

甲基化特异性PCR的评价与优化

目的探讨甲基化特异性PCR(MSP)在DNA甲基化检测中的应用价值。方法以SHH基因启动子区全甲基化克隆和全非甲基化克隆(质粒)为模板,评价MSP的敏感性和特异性。结果 MSP能检测出样本中低含量的甲基化DNA模板,提高MSP退火温度能克服假阳性或假阴性结果的产生。结论 MSP检测甲基化具有高灵敏度的优点,适当提高退火温度能保证MSP结果的特异性。

甲基化特异性多重连接探针扩增及甲基化特异性PCR诊断Prader-Willi综合征方法比较

目的应用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MS-PCR)和甲基化特异性多重连接探针扩增(methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification,MS-MLPA)方法对Prader-Willi综合征(Prader-Willi syndrome,PWS)进行诊断并比较两种方法的差异。方法回顾性研究2005年10月至2014年2月到北京协和医院就诊的患儿及正常对照共102例,男57例,女45例。其中正常对照16例;荧光原位杂交或高分辨染色体确诊PWS阳性对照2例;临床疑似PWS患儿84例。提取受试者外周血基因组DNA分别应用MS-PCR及MS-MLPA方法进行基因分析,对疑似患儿进行确诊和遗传类型分型,并计算两种方法的特异性、敏感性及准确度,应用卡方检验对两种方法进行比较。结果 MSPCR结果示正常对照及阳性对照与其表型全部相符,84例疑似患儿中有39例提示为PWS,45例提示正常。MS-MLPA结果示除正常对照外的86例受试者中,29例提示为父源缺失型PWS;9例提示为母源二体型PWS;47例提示为正常;1例因DNA过于陈旧未检出有效结果。对比两种方法检测结果,有2例MS-PCR结果显示为PWS,但MS-MLPA结果显示为正常,通过增加DNA用量重新进行MS-PCR检测后,除外PWS。结合临床表现,受试者中明确诊断PWS的患儿39例,非PWS者63例。MS-PCR方法共出现2例假阳性,假阳性率为3.17%(2/63)。MS-PCR方法敏感性100%,特异性96.83%,准确度98.03%;MS-MLPA方法敏感性97.43%,特异性100%,准确度99.02%。两种方法的敏感性、特异性及准确度差异无统计学意义(P均>0.05)。结论 MS-PCR及MS-MLPA敏感性、特异性及准确度皆佳,均可用于PWS诊断,MS-MLPA可区分父源缺失型及母源二体型。MS-PCR应保证DNA用量充足以避免假阳性出现。MS-MLPA应使用新鲜提取的DNA,且实验条件要求更为严格。建议同时使用两种方法检测以获得准确结果。

死亡相关蛋白激酶基因启动子甲基化特异性PCR法的建立与初步应用

目的:建立甲基化特异性PCR(MSP)技术检测死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因启动子甲基化。方法:设计针对DAPK基因启动子的MSP引物,建立MSP检测体系对甲基化阳性模板进行检测,评价其特异性、重复性和灵敏性,并经测序鉴定。结果:所建立的甲基化MSP方法仅能扩增出甲基化阳性模板,不能扩增出未甲基化阳性模板和未硫化处理的DNA模板;对不同梯度稀释的甲基化阳性模板进行检测,其最大敏感性可达2%;在不同时间进行甲基化MSP检测的结果均一致。结论:成功建立的DAPK基因启动子甲基化MSP检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,可用于肿瘤标本的批量检测。

甲基化特异性基因扩增检测过程中的质量控制

目的构建adenomatous polyposis coli(APC)基因启动子1A的甲基化阳性质粒标准品,对甲基化特异性基因扩增(meth-ylation specific PCR,MSP)的检测灵敏度进行质量控制。方法对脐血淋巴细胞DNA转甲基并化学修饰,制备甲基化阳性和阴性模板,MSP后获得目的片段,克隆到pMD18-T质粒载体,测序筛选阳性和阴性质粒标准品,紫外分光法对标准品定量,对10倍梯度稀释的质粒进行SYBR Green I荧光定量PCR来获得弱阳性质控品,对36份组织样本进行MSP检测。结果将MSP后电泳能显示的质粒(105拷贝/ml)作为弱阳性质控品。在加入弱阳性质控品后,2例阴性的样本最终定为阳性;11例未定结果的样本最终7例定为阳性,4例定为阴性。36例样本无质控品前的甲基化阳性率为25%,有质控品后的阳性率为50%,两次结果差异显著(P=0.001)。结论构建了携带甲基化阳性的APC基因启动子的质粒标准品并制备了低拷贝的弱阳性质控品,可以对MSP检测灵敏度进行质量控制,降低了检测的假阴性率。

巢式甲基化特异性PCR检测肝细胞癌患者血清中RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化

为了检测肝细胞癌患者血清中RASSF1A和CDH13基因启动子的甲基化状态,收集肝细胞癌患者及健康对照者的血清标本,采用巢式甲基化特异性PCR(nMSP)法检测RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化状态.结果肝细胞癌患者血清样品中RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化率为53.12%和31.25%,68.75%的患者血清可以检测到异常甲基化,正常对照血清中未检测到RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化,RASSF1A和CDH13基因甲基化与患者的临床病理资料无明显相关性(P>0.05);表明nMSP法检测血清中RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化具有较高的敏感性,可为肝细胞癌的筛查、早期诊断和预后判断提供有价值的信息.

甲基化特异性PCR法检测胰腺癌组织E-cadherin基因甲基化

目的:探讨胰腺癌组织E-cadherin(E-cad,上皮钙粘附素)5’-CpG岛异常甲基化情况;进一步讨论DNA异常甲基化在临床早期诊断、预后中的应用。方法:应用甲基化特异性PCR(MSP)检测27例胰腺癌组织和9例良性胰腺组织E-cad基因甲基化情况。结果:①在9例胰腺良性肿瘤及正常胰腺组织中,E-cad基因非甲基化PCR扩增均为阳性,未见甲基化PCR扩增。②在27例胰腺癌组织E-cad基因甲基化PCR扩增阳性9例(33.33%,9/27),其中完全甲基化6例,部分甲基化3例;而非甲基化PCR扩增阳性为18例(66.67%,18/27)。③E-cad基因异常甲基化与性别、年龄大小、肿瘤大小之间均无显著性差异(P>0.05),但与肿瘤的组织学分级相关。结论:在胰腺癌组织中E-cad基因异常甲基化是胰腺癌组织区别于其它胰腺良性病变的生物学标志之一。

启动子CpGs位点甲基化所致BRCA1基因转录抑制作用的位点特异性

目的 研究 BRCA1基因 Cp G岛内各个 Cp Gs位点甲基化与转录水平的关系 ,探讨甲基化所致转录抑制作用的特异性 Cp G位点 ,以阐明 DNA甲基化的作用方式。方法 以 Rice等研究数据为材料 ,用方差分析和多因素线性回归模型等方法进行统计再分析。结果 BRCA1基因 Cp G岛 +8～ +44、- 189～ - 19、- 379～ - 2 5 8、- 37～ - 19和 - 80～ - 19区段内 Cp Gs的甲基化与基因转录抑制有关 ,这些区段内 Cp Gs位点的甲基化数目越多 ,基因转录水平越低。多因素线性回归模型分析表明 ,- 80～ - 19区段的甲基化与转录抑制关系密切。并以 - 2 9Cp G位点甲基化引起的转录抑制作用最强。结论 Cp G岛甲基化引起的转录抑制与 Cp Gs位点有关 ,具有位点的特异性。

石蜡包埋组织中DNA甲基化特异性PCR技术

目的以石蜡包埋组织提取的DNA为模板进行DNA甲基化特异性PCR(MSP)检测,研究其可行性。方法35例石蜡包埋肺癌组织DNA样品制备和亚硫酸氢盐修饰后进行MSP扩增检测。结果石蜡包埋组织MSP检出率与文献采用新鲜组织标本报道一致。结论MSP通过选择合适的实验条件,可适用于石蜡包埋组织DNA甲基化分析。

甲基化特异性PCR检测PRAME基因启动子低甲基化30例及其临床应用

目的建立实时定量甲基化特异性PCR（RQ-MSP）法检测急性髓系白血病（AML）患者黑色素瘤优先表达的抗原（PRAME）基因低甲基化水平,初步评价其临床意义。方法用亚硫酸氢盐修饰后的基因组DNA为模板,建立EvaGreen染料法RQ-MSP检测PRAME基因低甲基化水平方法 ,检测18例（对照组）和30例（AML组）患者的骨髓单个核细胞中PRAME基因启动子低甲基化水平。结果 RQ-MSP融解曲线呈单一峰,标准品5×10^7-5×10^2copy/μL重复性良好;AML患者PRAME基因低甲基化水平（0.96-4 508.96,中位772.42）明显高于对照组（0-100.00,中位25.29）,差异有统计学意义（P=0.002）。结论建立的PRAME基因低甲基化RQ-MSP法特异性、重复性和灵敏性良好,可用于AML初诊和病情监测。

黏着斑激酶相关性鸟苷三磷酸酶调节因子基因启动子甲基化特异性PCR法的建立与初步应用

目的建立甲基化特异性PCR(MSP)技术检测黏着斑激酶相关性鸟苷三磷酸酶调节因子(GRAF)基因启动子甲基化。方法设计针对GRAF基因启动子的MSP引物,建立MSP检测体系,对不同DNA模板进行检测,评价方法的特异性、重复性和灵敏度;对10例急性髓系白血病(AML)标本进行检测。结果建立的MSP方法仅能扩增出甲基化阳性模板,不能扩增出未甲基化阳性模板和未硫化处理的DNA模板;检测不同稀释度的甲基化阳性模板,其最大灵敏度可达2%;在不同时间进行MSP检测的结果均一致;对10例AML患者的初步检测发现7例存在着GRAF基因启动子甲基化。结论成功建立了检测GRAF基因启动子甲基化的MSP方法,有良好的特异性、灵敏度和重复性,可用于临床AML标本的批量检测。

甲状腺癌血浆循环DNA中SOX17基因甲基化与患者病情及预后的关系

目的:探讨乳头状甲状腺癌(PTC)血浆循环DNA中Y染色体相关高迁移率族盒17(SOX17)基因甲基化与患者病情及预后的关系。方法:收集2022年6月至2023年12月在本院接受手术切除的152例PTC患者的甲状腺癌样本和术前血液标本。通过甲基化特异性PCR(MSP)检测PTC组织和血浆循环DNA中SOX17启动子甲基化。结果:MSP检测结果显示,152例PTC组织中有71例SOX17甲基化(46.7%),血浆循环DNA中有76例SOX17甲基化(50.0%)。Spearman相关分析结果显示,血浆循环DNA中SOX17甲基化与PTC组织中SOX17甲基化显著相关(r=0.382,P<0.001)。在PTC组织和血浆循环DNA中,SOX17甲基化与肿瘤分期Ⅱ~Ⅲ期、肿瘤大小≥2cm、LNM例数显著相关(P<0.05)。此外,血浆循环DNA中SOX17甲基化与ETE发生显著相关(P<0.05)。血浆循环DNA中SOX17甲基化(OR=9.564、2.744,95%CI=3.875~23.602、1.109~6.792)是PTC患者发生淋巴结转移(LNM)、甲状腺外侵犯(ETE)的独立影响因素(P<0.05)。血浆循环DNA中SOX17甲基化在预测LNM和ETE的能力较高,曲线下面积(AUC)为0.731、0.630(灵敏度为74.0%、65.6%,特异度为72.2%、60.4%);PTC组织SOX17甲基化预测LNM和ETE的能力较低,曲线下面积(AUC)为0.604、0.562(灵敏度为57.5%、54.1%,特异度为63.3%、58.2%)。结论:在PTC发生、发展过程中,肿瘤组织及血浆DNA中SOX17基因启动子甲基化具有高度一致性,并且血浆DNA中SOX17基因启动子甲基化预测LNM和ETE的能力较高。