血浆甲基化透明质酸酶-2检测对胰腺癌的诊断效能

目的探讨血浆甲基化透明质酸酶-2(HYAL2)水平对胰腺癌的诊断效能。方法 125例疑似胰腺癌患者,根据术后病理结果分为胰腺癌64例(观察组)、胰腺良性疾病患者61例(对照组)。两组均抽取空腹肘静脉血5 m L,采用Methy Light定量PCR方法检测两组外周血甲基化HYAL2(甲基化百分比参数PMR表示),采用化学发光免疫分析法检测两组外周血CA19-9、CEA。采用Logistic回归分析胰腺癌的影响因素,分析血浆CA19-9、CEA与血浆甲基化HYAL2水平的相关性,绘制受试者工作特征曲线评价各指标对胰腺癌的诊断效能。结果观察组、对照组甲基化HYAL2检出率分别为20.3%(13/64)、3.3%(2/61),二者比较,P<0.05。观察组、对照组血浆甲基化HYAL2的PMR分别为26.12%±10.11%、46.54%±18.86%,,二者比较,P<0.05。观察组、对照组血浆CEA分别为(23.02±11.96)、(13.17±7.84)ng/m L,二者比较,P<0.05;观察组、对照组血浆CA19-9分别为(215.39±38.05)、(26.40±20.31)U/m L,二者比较,P<0.05。血浆CA19-9、CEA及甲基化HYAL2水平是胰腺癌的影响因素。胰腺癌患者血浆甲基化HYAL2水平与血浆CEA、CA19-9均呈负相关(r=-0.755,-0.512;P均<0.05)。血浆甲基化HYAL2水平诊断胰腺癌的AUC为0.804,最佳诊断点34.435%,其敏感度为73.8%,特异度为85.3%;血浆CEA诊断胰腺癌的AUC为0.597,最佳诊断点为16.97 ng/m L,其敏感度为51.6%,特异性为68.9%;血浆CA19-9诊断胰腺癌的AUC为0.775,最佳诊断点为162.49 U/m L,其敏感度为75.0%,特异性为79.2%。血浆甲基化HYAL2与血浆CA19-9联合诊断胰腺癌的AUC为0.873。结论胰腺癌患者血浆甲基化HYAL2发生率较高。血浆甲基化HYAL2诊断胰腺癌的灵敏度、特异度均较高。血浆甲基化HYAL2联合CA199检测有助于胰腺癌的诊断。

miR-214-5p通过DNMT1介导的AXIN2基因DNA甲基化修饰在皮肤基底细胞癌中的作用机制

目的探讨皮肤基底细胞癌中轴抑制蛋白2(Axis inhibition protein 2,AXIN2)基因启动子甲基化对基因转录的影响及miR-214-5p通过靶向DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase1,DNMT1)对AXIN2甲基化率的调控机制。方法收集2022年1月-2023年6月在广州市皮肤病防治所就诊治疗的102例皮肤基底细胞癌(Cutaneous basal cell carcinoma,BCC)患者作为研究对象,提取癌组织和癌旁正常组织标本及基线资料。焦磷酸测序法检测AXIN2基因启动子区甲基化率。实时荧光定量PCR检测AXIN2、DNMT1基因mRNA和miR-214-5p的表达水平。将miR-214-5p模拟物(mimic)、抑制物(inhibitor)及其阴性对照(mimic NC和inhibitor NC)分别对基底细胞癌A431细胞进行转染,48 h后检测DNMT1基因mRNA表达水平和AXIN2基因甲基化率。结果BCC癌组织的AXIN2基因甲基化率显著高于癌旁正常组织(t=5.128,P<0.001),AXIN2基因mRNA相对表达水平显著低于癌旁正常组织(t=7.826,P<0.001),DNMT1基因mRNA表达水平显著高于癌旁正常组织(t=4.838,P<0.001),miR-214-5p表达水平显著低于癌旁正常组织(t=5.426,P<0.001)。BCC癌组织的AXIN2基因甲基化率与其mRNA表达水平呈负相关(r=-0.793,P<0.001),DNMT1基因mRNA水平与AXIN2基因甲基化率呈正相关(r=0.814,P<0.001),miR-214-5p表达水平与DNMT1基因mRNA水平呈负相关(r=-0.747,P<0.001)。双荧光素酶报告基因实验结果证实,DNMT1是miR-214-5p的靶基因。细胞转染后,与mimic NC、inhibitor和inhibitor NC比较,mimic的DNMT1基因mRNA水平、AXIN2基因甲基化率显著降低(P<0.001);而inhibitor的DNMT1基因mRNA水平和AXIN2基因甲基化率相较于其他三组明显上升(P<0.001)。结论miR-214-5p可通过调控下游靶蛋白DNMT1表达,影响AXIN2基因的DNA甲基化率,调控AXIN2基因的表达水平,参与皮肤基底细胞癌的发生机制。

尿中脱落细胞的环氧化酶-2、ImmunoCyt和透明质酸酶联合检测在膀胱癌早期诊断中的应用

目的评价尿中脱落细胞的环氧化酶-2(Cox-2)、ImmunoCyt和透明质酸酶(HAase)测定在膀胱癌早期诊断中的应用价值,寻找早期诊断膀胱癌的有效方法。方法选择60例早期膀胱移行细胞癌和60例非膀胱肿瘤患者,对尿中脱落细胞的Cox-2、ImmunoCyt和透明质酸酶(HAase)进行检测,并行尿脱落细胞学检查。结果尿中脱落细胞的Cox-2、ImmunoCyt、HAase和尿脱落细胞学的敏感度分别为60%、61.6%、66%、26.6%;准确度分别为76%、74%、80%和87%;特异度分别为92%、90%、94%和100%。Cox-2+ImmunoCyt+HAase联合检测与Cox-2、ImmunoCyt和HAase单独检测相比,敏感度和准确度都有所提高(P<0.05);尿中脱落细胞的Cox-2、ImmunoCyt和HAase联合检测的敏感性和准确性均高于尿脱落细胞学,差异有统计学意义(P<0.05)。结论尿中脱落细胞的Cox-2、ImmunoCyt和HAase是早期诊断膀胱移行细胞癌的一种高特异性指标,三者联合检测能提高膀胱癌的早期诊断率。

绵羊肺腺瘤病毒受体透明质酸酶-2的原核表达及纯化

为建立绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)受体透明质酸酶-2(Hyal-2)的原核高效表达体系,本试验设计了扩增JSRV受体Hyal-2基因的特异性引物,应用PCR技术扩增出Hyal-2全长基因,将该基因定向重组于原核表达载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1-Hyal-2重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,逐步优化条件至稳定表达,经Western blotting检测融合蛋白成功表达后,通过亲和层析法对融合蛋白进行纯化。结果表明,Hyal-2基因正确地插入到原核表达载体pGEX-4T-1中;经诱导含重组质粒pGEX-4T-1-Hyal-2的表达菌高效表达了带GST标签的目的蛋白;SDSPAGE电泳结果显示目的蛋白分子质量为80 ku,与预期大小一致,经Western blotting验证为带GST标签的融合蛋白;通过谷胱甘肽亲和层析法获得纯化的目的蛋白。本试验结果为进一步制备Hyal-2蛋白的多克隆抗体及深入研究其功能奠定基础。

入院时血清TGF-β1、Smad2、Smad3、HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平与CHB肝纤维化严重程度的相关性及对疾病预后的预测价值

目的探讨入院时血清转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad同源蛋白2(Smad2)、Smad同源蛋白3(Smad3)及透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、层黏连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(CⅣ)水平与慢性乙型肝炎(CHB)肝纤维化严重程度的相关性及联合检测对疾病预后的预测价值。方法选取河南省中医院2021年3月至2022年3月收治的78例CHB肝纤维化患者作为研究组,选择同期78名健康体检者作为对照组。比较研究组和对照组及不同肝纤维化分期、不同炎症活动分级CHB肝纤维化患者入院时血清TGF-β1、Smad2、Smad3、HA、PCⅢ、LN、CⅣ水平;分析入院时血清TGF-β1、Smad2、Smad3、HA、PCⅢ、LN、CⅣ水平与肝纤维化分期、炎症活动分级的相关性。CHB肝纤维化患者治疗3个月后,根据患者预后分为预后良好和预后不良亚组,比较预后良好和预后不良患者入院时血清TGF-β1、Smad2、Smad3、HA、PCⅢ、LN、CⅣ水平;分析入院时血清TGF-β1、Smad2、Smad3、HA、PCⅢ、LN、CⅣ水平联合检测对CHB肝纤维化患者预后不良的预测价值。结果研究组入院时血清TGF-β1、Smad2、Smad3、HA、LN、PCⅢ、CⅣ高于对照组(P<0.05);不同肝纤维化分期、炎症活动分级CHB肝纤维化患者入院时血清TGF-β1、Smad2、Smad3、HA、LN、PCⅢ、CⅣ比较:S1<S2<S3<S4、G1<G2<G3<G4,差异有统计学意义(P<0.05);入院时血清TGF-β1、Smad2、Smad3、HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平与肝纤维化分期、炎症活动分级均呈正相关(P<0.05)。预后良好患者入院时血清TGF-β1、Smad2、Smad3、HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平均低于预后不良患者(P<0.05);入院时血清TGF-β1、Smad2、Smad3、HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平联合预测肝纤维化患者预后不良的曲线下面积(AUC)优于各指标单一检测(P<0.05)。结论CHB肝纤维化患者入院时血清TGF-β1、Smad2、Smad3、HA、PCⅢ、LN、CⅣ水平均呈现高表达,且与肝纤维化分期、炎症活动分级密切相关,其联合检测对CHB肝纤维化患者预后有较高的预测价值,可用于评估CHB肝纤维化患者病情严重程度和预后,为制定针对性治疗措施提供参考。

绵羊透明质酸酶-2的真核表达及鉴定

为了构建绵羊透明质酸酶-2(hyaluronidase 2,Hyal-2)的真核表达载体并实现其在牛乳腺上皮细胞内瞬时表达,根据GenBank中绵羊Hyal-2基因序列(登录号:NM_001009754)设计2对引物,并分别在前段上游和后段下游引物5′端引入HindⅢ酶切位点和BamHⅠ酶切位点,同时在上游引物酶切位点后加入KOZAK序列,进行分段PCR扩增。以扩增的两段产物为共同模板运用重叠(overlapping)PCR技术扩增Hyal-2基因全长。通过连接反应将双酶切并纯化后的目的片段克隆于真核表达载体pEGFP-C1上,并通过脂质体转染法将构建好的真核表达载体转染牛乳腺上皮细胞,运用RT-PCR及West-ern blotting方法分别从核酸及蛋白质水平验证其表达。经测序分析,目的片段与模板核苷酸同源性为99%,氨基酸同源性为99%,且片段插入方向正确。RT-PCR及Western blotting方法检测均出现目的条带,证明成功构建了绵羊透明质酸酶-2的真核表达载体,并在牛乳腺上皮细胞中获得表达。

一体化^(18)F-FET PET/MR术前评估成人胶质瘤患者MGMT基因启动子甲基化状态

目的 旨在研究一体化^(18)F-氟乙基酪氨酸(^(18)F-fluoroethyltyrosine, ^(18)F-FET)正电子发射断层成像(positron emission tomography, PET)/MR对成人胶质瘤的O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-methylguanine DNA methyltransferase, MGMT)基因启动子甲基化状态的鉴别能力。材料与方法 回顾性分析未经活检或治疗的胶质瘤患者资料16例,均完成一体化PET/MR扫描,包括^(18)F-FET PET、常规MRI及体素内不相干运动(intravoxel incoherent motion, IVIM)成像。以靶本比(target-background ratio, TBR)=1.6为阈值对PET图像进行感兴趣体积(volume of interest, VOI)分割,通过刚性配准获得肿瘤VOI对应的IVIM图及其参数表观扩散系数(apparent diffusion coefficient, ADC)、真实扩散系数(true diffusion coefficient, D)、伪扩散系数(pseudo diffusion coefficient, D^(*))、灌注分数(perfusion fraction, f)、分布扩散系数(distributed diffusion coefficient, DDC)和异质性指数(heterogeneity index, α),使用pyradiomics对各参数进行特征提取,获得对应的一阶灰度直方图特征。计算每个IVIM参数图对应的特征值与^(18)F-FET PET参数的关系,并利用组间比较和受试者工作特征(receive operating characteristic, ROC)曲线分析探究PET和IVIM参数对MGMT启动子甲基化的区分能力。结果 IVIM-α的两个特征值90分位值(r=0.526,P<0.05)和最大值(r=0.520, P<0.05)与PET参数平均标准摄取值(meanstandarduptakevalue,SUVmean)呈正相关;IVIM-α和SUVmean在MGMT启动子甲基化状态阳性和阴性两组之间的差异有统计学意义(P<0.05),阳性组的IVIM-α均值和SUVmean显著高于阴性组;融合IVIM-α均值和SUVmean对MGMT启动子甲基化状态进行区分的曲线下面积(area under the curve, AUC)为0.77。结论 基于一体化PET/MR的^(18)F-FET PET和IVIM参数能够有效预测胶质瘤的MGMT启动子甲基化状态。

油茶籽粕多糖羧甲基化、乙酰化修饰及其对透明质酸酶的抑制作用

目的:研究羧甲基化油茶籽粕多糖(CM-COP)和乙酰化油茶籽粕多糖(Ac-COP)的修饰工艺,并研究其对透明质酸酶的抑制作用。方法:以取代度为指标,采用氢氧化钠—氯乙酸法和乙酸酐法分别对油茶籽粕多糖(COP)进行羧甲基化和乙酰化修饰。结果:CM-COP最佳修饰工艺为氢氧化钠浓度1.5 mol/L,反应时间3 h,反应温度60℃;Ac-COP最佳修饰工艺为乙酸酐用量3.0 mL,反应时间3 h,反应温度60℃;COP、CM-COP、Ac-COP对透明质酸酶的抑制率分别为78.0%,90.3%,92.2%。结论:COP、CM-COP、Ac-COP对透明质酸酶均具抑制作用,且CM-COP和Ac-COP的抑制活性高于COP,说明改性修饰能增加COP的生物活性。

透明质酸、Ⅳ型胶原、APRI及纤维蛋白原-4对乙型肝炎后肝纤维化的诊断价值

目的探讨透明质酸(HA)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)与血小板(PLT)比值(APRI)、纤维蛋白原-4(Fib-4)在乙型肝炎患者肝纤维化诊断中的临床价值。方法采用回顾性研究方法,选取2018年6月至2020年9月在唐山市工人医院治疗的182例乙型肝炎患者。以肝硬度METAVIR评分进行肝硬化分期,F0期51例,F1期47例,F2期38例,F3期30例,F4期16例。比较不同肝纤维化分期患者的基础资料,对比不同肝硬化分期患者的血清HA、Ⅳ-C、APRI、Fib-4指标,并对各项指标诊断肝纤维化的效能进行分析。结果F0~F4分期患者的性别构成比差异无统计学意义(P>0.05),而随着分期增加,年龄与病程明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。HA、Ⅳ-C、APRI、Fib-4随着肝纤维化分期增加而不断明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。HA、Ⅳ-C、APRI、Fib-4均与肝纤维化分期存在显著的正相关关系(r=0.32、0.49、0.52、0.66,P<0.01)。HA、Ⅳ-C、APRI、Fib-4联合检测对肝纤维化诊断的敏感度、特异度为95.76%、91.54%。显著高于单项指标检测(HA:61.82%、70.63%,Ⅳ-C:70.31%、84.43%,APRI:74.25%、90.05%;Fib-4:71.63%、84.78%)。结论HA、Ⅳ-C、APRI、Fib-4均与乙型肝炎患者的肝纤维化有较为明显的相关性,联合检测对诊断肝纤维化有较高的敏感性与特异度,可以作为肝纤维化诊断的重要参考指标。

5-杂氮-2′-脱氧胞苷对宫颈癌细胞生长及其甲基化转移酶和甲基结合蛋白DNA转录的影响

目的:检测5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对体外培养的宫颈癌HeLa细胞中DNA甲基化转移酶(DNMT)及甲基CpG结合蛋白(MeCP)的DNA转录水平的影响,探索其对肿瘤细胞生长的抑制作用。方法:5-Aza-CdR(终浓度为5.0μmol.L-1)与肿瘤细胞共培养72h后,用PI染色及流式细胞仪(FCM)检测肿瘤细胞的细胞周期;利用qRT-PCR鉴定药物组与空白组细胞DNMT及MeCP的mRNA浓度。吖啶橙(AO)细胞荧光染色法鉴定药物组与空白组细胞形态学上的差异及凋亡的程度。结果:FCM检测结果显示两组肿瘤细胞的细胞周期呈现明显差异,并且药物组细胞表现为G0/G1期阻滞,sub-G1峰明显。AO染色表明药物组细胞有明显凋亡迹象且伴随少量的细胞坏死现象。qRT-PCR结果显示,空白对照组和药物组中均有一定量DNMT及MeCP的mRNA产物,但其mRNA表达量无显著差异(P>0.05)。结论:5-Aza-CdR能够诱导体外培养的HeLa肿瘤细胞凋亡,而对于肿瘤细胞中甲基化转移酶及甲基CpG结合蛋白的DNA转录无显著的影响。

11β-类固醇脱氢酶-2启动子区甲基化与原发性高血压关系初探

目的通过11β-类固醇脱氢酶-2(11β-hydroxysteroid dehydrogenase-2,11β-HSD-2)基因启动子区甲基化发生率的测定,探讨原发性高血压可能的发病机制。方法选取未经治疗的原发性高血压患者64例以及正常对照组30例,Sequenom MassArray质谱法检测11β-HSD-2基因启动子区"-101到461"的563个碱基序列的甲基化发生率。结果原发性高血压组甲基化发生率高且差异有统计学意义,CpG位点如下:CpG_7、8、CpG_9、CpG_62、63、64、CpG_65、CpG_72。t值分别为-5.42,-3.17,-2.84,-2.32和-2.32,P<0.05。CpG_7、8、CpG_9位于核心启动子区。结论原发性高血压患者11β-HSD-2基因启动子区存在高甲基化发生率位点。

启动子甲基化调节在低表达环氧合酶-2的食管鳞癌移植模型中的作用

目的环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)参与食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)的发生发展过程,但在部分ESCC细胞株中COX-2呈低表达。选择低表达COX-2基因的ESCC进行裸鼠移植。探讨COX-2基因甲基化与基因表达的关系,观察联合COX-2选择性抑制剂和去甲基化药物干预对移植瘤生长的影响。方法选择KYSE 150细胞进行裸鼠移植,采用数字表法随机分为4组:0.9%(质量分数)氯化钠注射液对照检查组7只。分别给予1尼美舒利(nimesulide,NIM)+5-氮杂脱氧胞苷(5-Aza-deoxycytidine,5-Aza)干预2尼美舒利干预35-Aza干预。5周后处死动物,比较各组移植瘤的直径,计算移植瘤体积,绘制生长曲线。反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)测定组织中COX-2 mRNA表达;免疫组织化学方法测定COX-2蛋白的表达;亚硫酸氢盐测序方法测定移植瘤中COX-2启动子的甲基化状态。酶联免疫吸附测定(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)法检测各组移植瘤中前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)的浓度。结果各组动物体质量增长差异无统计学意义,组间具有可比性。联合干预组移植瘤明显小于其他各组,差异具有统计学意义(P<0.01)。COX-2 mRNA和蛋白表达结果一致,均表现为联合干预组最低,5-Aza干预组最高。甲基化测序结果 10个Cp G位点中联合干预组和5-Aza干预组的甲基化率低于尼美舒利组和对照组(30%vs 58.3%)。PGE2的浓度分析显示联合干预组明显低于对照组和单独尼美舒利干预组,PGE2比值在联合干预组、尼美舒利干预组分别为0.37、0.91,联合干预组的比值与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论低表达COX-2的ESCC移植模型中COX-2启动子甲基化是调节该基因表达的重要机制之一。联合选择性COX-2抑制剂尼美舒利和去甲基化药物5-氮杂脱氧胞苷对低表达COX-2的ESCC移植瘤的生长有协同抑制作用。

二甲基精氨酸-二甲胺水解酶2的表达、调节和功能

非对称性-二甲基精氨酸(ADMA)抑制一氧化氮合酶,是内皮功能损伤、心血管疾病的危险因素。二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(DDAH)可以代谢ADMA,主要分为两种。DDAH-1主要分布于肾小管、肝脏,从循环中摄取ADMA;DDAH-2主要存在于血管中,分布于内皮细胞胞膜交界处及胞内颗粒、血管平滑肌细胞肌纤维及核被膜中。肾和血管中的DDAH,其表达调节和分布均具有特异性,可以特异地调节一氧化氮(NO)的产生。下面主要介绍DDAH-2的表达、调节与功能,描述了DDAH-2在NO产生、内皮功能中所起的作用。

白细胞介素-4通过上调蛋白质精氨酸甲基转移酶1的表达水平引起对氧磷酶2的精氨酸甲基化修饰

目的验证质谱筛选的结果,确定对氧磷酶2(PON2)是否为蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)的底物蛋白。方法用白细胞介素-4(IL-4)刺激A549细胞后,用免疫沉淀法捕获发生精氨酸非对称性二甲基化修饰的蛋白,用梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳分析捕获的蛋白,通过银染显示差异性条带,质谱分析差异性条带中的蛋白种类。用免疫沉淀检验PON2的甲基化修饰状态。检测PON2和PRMT1对IL-4表达的浓度依赖性和时间依赖性。用免疫共沉淀检测PON2和PRMT1的相互作用,并在MS203抑制Ⅰ型PRMT后检测PON2的甲基化修饰水平的变化。诱导小鼠哮喘模型,检测PON2表达的组织细胞类型,以及肺组织中PON2和PRMT1的表达水平。结果(1)质谱分析显示在IL-4处理的A549细胞中检出311个差异显示的蛋白,PON2为其中之一。(2)免疫沉淀显示,IL-4可促进A549细胞中PON2发生精氨酸非对称性二甲基化修饰,但IL-4刺激对PON2的表达水平无影响。(3)PON2与PRMT1有相互作用,IL-4可促进PON2与PRMT1结合,抑制Ⅰ型PRMT活性可以削弱IL-4对PON2发生精氨酸非对称性二甲基化修饰的促进作用。(4)PON2主要在小鼠气道上皮表达,且PON2的表达水平在对照组与哮喘组组织间差异无统计学意义(P>0.05)。结论PON2为PRMT1的底物蛋白。IL-4可以促进PON2发生精氨酸非对称性二甲基化修饰。

丙泊酚通过组蛋白脱乙酰酶2/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白/N-甲基-D-天冬氨酸-2B受体信号通路对子代大鼠学习和记忆功能的影响

目的探讨孕早期母体丙泊酚暴露对子代大鼠学习和记忆功能的影响。方法选取孕5-7 d的SD大鼠40只,采用随机数字表法将其分为A、B、C、D组,每组各10只。A组为对照组,B、C和D组妊娠大鼠分别注射0.25%、0.5%和0.75%的丙泊酚。子代大鼠出生后,根据是否给予组蛋白脱乙酰酶2(histone deacetylase 2,HDAC2)抑制剂将其分为CS组(A组子代大鼠给予HDAC2抑制剂)、I0.25S组(B组子代大鼠给予HDAC2抑制剂)、I0.5S组(C组子代大鼠给予HDAC2抑制剂)、I0.75S组(D组子代大鼠给予HDAC2抑制剂)、CN组(A组子代大鼠不给予HDAC2抑制剂)、I0.25N组(B组子代大鼠不给予HDAC2抑制剂)、I0.5N组(C组子代大鼠不给予HDAC2抑制剂)和I0.75N组(D组子代大鼠不给予HDAC2抑制剂),每组各10只。比较各组子代大鼠Morris水迷宫实验结果、海马HDAC2、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)、N-甲基-D-天冬氨酸-2B受体(N-methyl-D-aspartate receptor 2B subunits,NR2B)mRNA及NR2B蛋白表达水平。结果第1-4天I0.25N组、I0.5N组、I0.75N组子代大鼠的逃避潜伏期均显著长于CN组(均P<0.05),I0.75S组大鼠平台穿越次数显著少于CS组(P<0.05),I0.25S组、I0.5S组、I0.75S组子代大鼠目标象限停留时间分别显著长于I0.25N组、I0.5N组、I0.75N组(均P<0.05)。当丙泊酚的暴露剂量增加,细胞出现线粒体空泡和高尔基体肿胀,HDAC2抑制剂可减轻丙泊酚暴露引起的子代海马功能障碍。I0.25N组、I0.5N组、I0.75N组子代大鼠海马HDAC2 mRNA表达水平均显著低于CN组(均P<0.05),CS组、I0.25S组、I0.5S组、I0.75S组子代大鼠海马HDAC2 mRNA水平分别显著低于CN组、I0.25N组、I0.5N组、I0.75N组(均P<0.05);CS组、I0.25S组、I0.5S组、I0.75S组子代大鼠海马CREB mRNA水平分别显著高于CN组、I0.25N组、I0.5N组、I0.75N组(均P<0.05);I0.25S组、I0.5S组和I0.75S组子代大鼠海马NR2B mRNA和NR2B蛋白表达水平分别显著高于I0.25N组、I0.5N组和I0.75N组(均P<0.05)。结论孕早期母体丙泊酚暴露损害子代大鼠学习和记忆功能,机制与其调节子代大鼠海马HDAC2/CREB/NR2B蛋白表达有关。

脑胶质瘤患者异柠檬酸脱氢酶(IDH)1/2基因突变与O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)基因启动子区甲基化的相关性研究

目的探讨脑胶质瘤患者异柠檬酸脱氢酶(IDH)1/2基因突变与O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)基因启动子区甲基化的相关性。方法回顾性分析汕头市龙湖区第二人民医院普外科2018年1月至2020年2月脑胶质瘤患者60例临床资料,观察脑胶质瘤患者IDH 1/2基因突变与MGMT基因启动子区甲基化,观察IDH 1/2基因突变与MGMT基因启动子区甲基化相关性分析情况。结果18例患者检测出IDH 1/2基因突变,其中WHO的分级Ⅱ级8例、Ⅲ级7例,Ⅳ级3例,分级在IDH 1/2基因突变分布中,差异有统计学意义(χ^(2)=108.454,P=0.000),33例患者检测出MGMT基因启动子区甲基化,其中WHO的分级Ⅰ级2例、Ⅱ级8例、Ⅲ级8例,Ⅳ级15例,分级在MGMT基因启动子区甲基化分布中,差异无统计学意义(χ^(2)=0.527,P=0.538)。IDH 1/2基因突变与MGMT基因启动子区甲基化呈现明显正相关,差异有统计学意义(r=0.368,P=0.014)。结论脑胶质瘤患者IDH1/2基因突变与MGMT基因启动子区甲基化呈正相关,为指导临床诊断治疗提供了理论依据。

固定化β-葡萄糖醛酸酶反应器的制备及其在4-甲基亚硝胺基-1-(3-吡啶)-1-丁醇的O-糖苷化合物分析中的应用

采用溶胶-凝胶法,以丙烯酰胺作为单体,制备了基于有机-硅胶杂化整体柱的β-葡萄糖醛酸酶反应器。优化了硅酸甲酯和γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅的物质的量的比、丙烯酰胺和聚乙二醇的用量,以及水浴温度等制备条件,获得了孔隙均匀、通透性良好、机械强度高的有机-硅胶杂化整体柱。采用光学显微镜和扫描电镜表征杂化整体柱。进一步将β-葡萄糖醛酸酶共价键合在整体柱上,以4-甲基亚硝胺基-1-(3-吡啶)-1-丁醇(NNAL)的O-糖苷化合物(NNAL-O-Gluc)为底物研究酶反应器的水解效果,实验结果证明酶反应器在室温条件下的水解效率大大提高,实现了NNAL-O-Gluc高效水解与分析,解决了目前NNAL-O-Gluc分析中前处理水解效率低的问题。

CAFs促进ADH1B甲基化对卵巢癌细胞增殖及侵袭的影响

目的 探讨肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)分泌的IL-6对卵巢癌细胞增殖及侵袭的影响及机制。方法 收取新鲜离体上皮性卵巢癌及正常卵巢上皮组织,分离纯化获得CAFs及正常卵巢成纤维细胞(NFs);蛋白质印迹和免疫荧光实验检测上皮细胞和成纤维细胞标志物α-平滑肌动蛋白(α-SMA)、上皮型钙黏附素(E-cadherin)表达;收集CAFs和NFs培养上清液与卵巢癌SKOV3细胞建立间接共培养体系,细胞分为SKOV3单独培养(SKOV3)组、SKOV3与NFs上清液(NFs)组及SKOV3与CAFs上清液(CAFs)组;细胞免疫组化检测SKOV3细胞共CAFs及NFs上清液培养后乙醇脱氢酶1B(ADH1B)表达;甲基化特异性PCR (MSP)、逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)及蛋白质印迹实验分别检测甲基化抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-dC)干预前后各组细胞ADH1B mRNA表达及甲基化状态、信号转导和激活因子3(STAT3)蛋白磷酸化水平;细胞计数试剂盒8(CCK-8)法及Transwell实验分别检测IL-6抑制剂LMT-286及重组IL-6 (rhIL-6)对细胞增殖及侵袭能力的影响。结果 肿瘤成纤维细胞中高表达α-SMA,极低表达E-cadherin;相比较SKOV3组及NFs组,CAFs组ADH1B mRNA及蛋白表达明显下调,同时CAFs组细胞上清液中IL-6水平较SKOV3组及NFs组明显升高;5-Aza-dC作用后,ADH1B甲基化部分逆转;三组细胞ADH1B mRNA和蛋白表达均增加,CAFs组STAT3磷酸化水平下降;LMT-286及rhIL-6干预均仅抑制或促进CAFs组细胞增殖和侵袭,而SKOV3组和NFs组无明显改变。结论 CAFs通过IL-6/STAT3信号通路增强ADH1B甲基化促进卵巢癌细胞增殖和侵袭。

初次化疗前外周血甲基化透明质酸酶2水平对Ⅱ~Ⅲ期直肠癌术后辅助化疗患者预后的影响

目的探讨初次化疗前外周血甲基化透明质酸酶2(HYAL2)水平对Ⅱ~Ⅲ期直肠癌术后辅助化疗患者预后的影响。方法回顾性分析湖北医药学院附属国药东风总医院2019年5月至2021年5月98例Ⅱ~Ⅲ期直肠癌患者的临床资料,均于根治性手术后行辅助化疗。记录患者的临床特征;于初次化疗前采用实时荧光定量聚合酶链反应检测外周血甲基化HYAL2表达水平。经X-tile 3.6.1软件确定外周血甲基化HYAL2表达水平的最佳临界值。采用多因素Cox回归分析影响Ⅱ~Ⅲ期直肠癌患者总生存期(OS)和无病生存期(DFS)的独立危险因素;绘制Kaplan-Meier生存曲线,对不同外周血甲基化HYAL2表达水平Ⅱ~Ⅲ期直肠癌患者进行生存分析;采用受试者工作特征(ROC)曲线评价外周血甲基化HYAL2表达水平对Ⅱ~Ⅲ期直肠癌患者DFS和OS的预测效能。结果98例Ⅱ~Ⅲ期直肠癌患者初次化疗前外周血甲基化HYAL2水平(45.13±12.13)%,用X-tile 3.6.1软件确定其评估OS的最佳临界值为43.18%。其中,初次化疗前外周血甲基化HYAL2水平高表达(≥43.18%)66例,低表达(<43.18%)32例。肿瘤长径和TNM分期是影响Ⅱ~Ⅲ期直肠癌患者外周血甲基化HYAL2表达水平的因素(P<0.05);外周血甲基化HYAL2表达水平与性别、年龄、分化程度、淋巴结转移和浸润深度无关(P>0.05)。多因素Cox回归分析结果显示,TNM分期和外周血甲基化HYAL2表达水平是影响Ⅱ~Ⅲ期直肠癌患者OS的独立危险因素(HR=0.451和1.697,95%CI 0.204~1.001和0.309~2.787,P<0.05);外周血甲基化HYAL2表达水平是影响Ⅱ~Ⅲ期直肠癌患者DFS的独立危险因素(HR=1.027,95%CI 0.146~1.943,P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示,外周血甲基化HYAL2水平低表达患者中位OS和DFS明显长于外周血HYAL2水平高表达患者(29个月比21个月和26个月比21个月),差异有统计学意义(log-rankχ^(2)=12.57和8.66,P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,外周血甲基化HYAL2表达水平预测Ⅱ~Ⅲ期直肠癌患者OS的曲线下面积(AUC)为0.882(95%CI 0.801~0.938),特异度和灵敏度为65.67%和99.45%;外周血甲基化HYAL2表达水平预测Ⅱ~Ⅲ期直肠癌患者DFS的AUC为0.847(95%CI 0.760~0.913),特异度和灵敏度为62.90%和97.22%。结论初次化疗前外周血甲基化HYAL2表达水平是影响Ⅱ~Ⅲ期直肠癌术后辅助化疗患者预后的独立危险因素,可作为预后评估的指标。

27位氨基酸三甲基化的组蛋白3(H3K27me3)及其修饰酶在小鼠不同组织中分布

目的研究出生后7日龄和2月龄小鼠各组织器官中27位氨基酸三甲基化的组蛋白3(H3K27me3)的水平及其修饰酶Zeste基因增强子同源物2(EZH2)、赖氨酸特异性脱甲基酶6B(Kdm6B/JMJD3)和赖氨酸特异性脱甲基酶6A(Kdm6A/UTX)的表达。方法免疫组织化学染色法检测7日龄和2月龄小鼠脑、涎腺、背部脂肪、胸腺、肺、心脏、胃、肠、肝、睾丸、皮肤组织中H3K27me3、EZH2、JMJD3和UTX表达,实时定量PCR验证,统计分析H3K27me3水平与EZH2、JMJD3和UTX表达之间的关系。结果 H3K27me3在7日龄和2月龄小鼠被检测组织中均持续存在;EZH2在7日龄和2月龄小鼠脑、心肌、肝及皮肤中表达,但仅在2月龄小鼠涎腺、肠、睾丸、肺、脂肪组织、胸腺中持续表达;JMJD3在7日龄小鼠脑、皮肤、涎腺、心肌、肠、睾丸、肺、脂肪组织、胃中表达,但在2月龄小鼠的肺、脂肪组织、胃中不再表达;UTX在7日龄小鼠的脑、皮肤、涎腺、心肌、睾丸、肺及脂肪组织中表达,但仅在2月龄小鼠睾丸中表达;大部分免疫组织化学染色阳性的H3K27甲基调节酶相应的mRNA呈中等或较高水平表达。结论 H3K27me3在小鼠不同时期各组织中均持续存在;EZH2多存在于2月龄小鼠脑、皮肤、涎腺、心肌、肠、睾丸、肺、脂肪组织、肝、胸腺;JMJD3、UTX多存在于7日龄小鼠脑、皮肤、涎腺、心肌、睾丸、肺、脂肪组织;H3K27me3分布与EZH2的表达之间无明显一致关系,与JMJD3或UTX不存在明显反向分布关系,EZH2与JMJD3或UTX的表达分布也不存在反向关系。提示EZH2、JMJD3和UTX在小鼠出生后多种组织中可能起重要作用;在体内H3K27me3水平及其修饰酶可能受多因素控制,以完成复杂的生理功能。