甲基化CpG结合蛋白家族(MeCPs)在表遗传中的作用

表遗传学(epigenetics)主要研究基因型和表型之间的关系。基因组表遗传修饰主要包括遗传物质DNA的甲基化修饰和核小体组蛋白修饰,最终结果是DNA碱基不发生改变的情况下而表型却发生了变化。甲基化CpG结合蛋白家族(methyl-GpGbindingproteins,MeCPs)是能与甲基化CpG二核苷酸结合的一类核蛋白,从而有机地将DNA甲基化和组蛋白修饰耦合起来,在表遗传中发挥着中枢纽带的作用。本文简述了近年来表遗传中DNA甲基化和组蛋白修饰的最新研究进展以及MeCPs家族在表遗传中的重要作用,目的是使人们进一步了解表遗传作用规律。

用变性高效液相色谱术筛查甲基化CpG结合蛋白2基因变异

目的用变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)分析和DNA测序筛查甲基化CpG结合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2,MECP2)基因突变,评价DHPLC检测MECP2基因变异的可用性。方法建立检测MECP2基因变异的DHPLC分析法,对52例孤独症患儿MECP2基因3个外显子分为8个片段进行PCR扩增,扩增产物用DHPLC筛查,并以DNA测序验证。结果在Exon 4-1、4-2、4-3、4-4片段,分别发现有17个、2个、2个和1个样本峰型异常,DNA测序分析发现为6种MECP2基因变异。结论DHPLC技术可用于检测MECP2基因变异,方法敏感、重复性好。

泛发性脓疱型银屑病患者外周血单个核细胞甲基化酶及甲基化CpG结合蛋白mRNA的表达水平

目的观察泛发性脓疱型银屑病(generalized pustular psoriasis,GPP)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中DNA甲基转移酶及甲基化CpG结合蛋白(methyl-CpG binding protein,MeCP)mRNA的表达情况,初步探讨DNA甲基化在GPP中可能的作用机制。方法回顾性收集2015年12月至2016年12月在北京协和医院皮肤科门诊或住院治疗的9例GPP患者临床资料;随机选取10例同期在医院接受健康体检的健康人做为对照,年龄和性别与GPP患者相匹配。分别留取10 ml肘正中静脉血,采用密度梯度离心法分离PBMC,应用Trizol法提取PBMC总RNA,采用实时PCR法检测DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MBD1、MBD2、MBD3、MBD4及MeCP2的mRNA表达水平,并分析年龄及病情严重程度与mRNA表达水平的相关性。结果GPP患者PBMC中DNMT3a、DNMT3b、MBD1、MBD2、MBD4的mRNA表达水平较健康对照组升高[DNMT3a:0.000 17(0.000 06,0.001 15)比0.000 03(0.000 02,0.000 04);DNMT3b:0.000 04±0.000 02比0.000 02±0.000 01;MBD1:为0.001 01±0.000 45比0.000 46±0.000 15;MBD2:0.002 61±0.000 39比0.001 85±0.000 52;MBD4:0.004 29±0.001 60比0.001 57±0.000 55,P均<0.05],年龄及疾病严重度与上述因子mRNA的相对表达水平无相关性(P均>0.05)。结论GPP患者体内甲基化相关调控基因表达异常,但与年龄和疾病严重程度不相关。

甲基化CpG结合蛋白家族研究进展

甲基化CpG结合蛋白家族是一类能与甲基化CpG岛特异性结合并相互作用的蛋白质,它们具有共同的由60～80个氨基酸组成的甲基化CpG结合域(methyl-CpG-binding domain,MBD),能在甲基化的启动子区募集组蛋白去乙酰化酶、组蛋白乙酰化酶、组蛋白甲基化酶和DNA甲基转移酶,导致该区域染色质结构改变并介导基因沉默,在X染色体失活、印记基因沉默和肿瘤细胞抑癌基因沉默中发挥关键性的枢纽作用。该文综述了甲基化CpG结合蛋白家族的研究历史和最新的一些研究进展以及它们在基因抑制中所起的重要作用。

脑内甲基化CpG结合蛋白2在物质成瘾中的作用

物质成瘾是一种慢性复发性脑病。成瘾物质诱导脑内神经适应性的改变一定程度上由表观遗传机制介导。DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑影响组织或脑内的基因表达永久性改变,最终导致个体行为异常。甲基化CpG结合蛋白2(methyl-CpG binding protein 2,MeCP2)作为一种重要的转录抑制因子,其含有的特征性结构域,具有调节染色体构象、转录激活和参与RNA剪切等功能。也已证实,在脑发育过程中,MeCP2在调控神经元可塑性和相关靶基因的转录方面有重要作用,这引起了人们对神经元功能中表观遗传重要性的关注。研究证实,DNA甲基化、组蛋白乙酰化和磷酸化调控MeCP2基因表达水平,影响学习、记忆和物质成瘾中基因和蛋白质转录、翻译和细胞调控。成瘾物质诱导机体产生身体和精神依赖,这些改变与成瘾神经环路中神经元可塑性和基因表达水平变化有关,而MeCP2在调节中枢神经系统突触传递和可塑性中发挥重要作用。因此,探究MeCP2在调控中枢神经系统神经元可塑性中的作用具有重大的科学意义。本文将就MeCP2的结构与功能,MeCP2与表观遗传的关系,以及不同成瘾性物质诱导的MeCP2表观遗传修饰在物质成瘾中的作用进行综述,以期深入理解物质成瘾的分子机制,并为临床干预提供新思路。

甲基化CpG结合蛋白2参与缺血性卒中后基底节神经再生的分化调控

研究背景脑缺血可诱导非神经再生区(如基底节)神经再生和神经干细胞分化,但其调节机制尚不明确。本研究旨在探索缺血性卒中后基底节神经干细胞分化过程中可能的表观遗传学调控机制。方法采用Western blotting法检测表观遗传学调节因子甲基化结合蛋白2(MeCP2)及其磷酸化修饰形式pMeCP2在脑缺血大鼠基底节的表达变化,免疫组织化学染色观察MeCP2和pMeCP2阳性细胞形态特征,以及pMeCP2与神经干细胞标志物巢蛋白和神经元标志物微管相关蛋白2(MAP 2)的共定位情况。结果 (1)脑缺血后基底节MeCP2发生磷酸化形成pMeCP2,MeCP2阳性细胞数目减少(t=12.239,P=0.000)、pMeCP2阳性细胞数目增加(t=5.808,P=0.000)。(2)脑缺血后基底节神经细胞胞核MeCP2表达水平降低(t=14.949,P=0.000)、胞质pMeCP2表达水平升高(t=5.026,P=0.001)。(3)MeCP2磷酸化可介导MeCP2从细胞核转移至细胞质。(4)脑缺血第3天,pMeCP2可与神经干细胞标志物巢蛋白共存于同一细胞;第7天时,pMeCP2可与神经元标志物MAP 2共存于同一细胞。结论脑缺血损伤诱导的MeCP2磷酸化可以改变MeCP2空间分布特征,使其从细胞核转移至细胞质,并影响其生物学功能。本研究结果进一步提高了对成年动物脑组织神经再生的认识,为神经再生治疗神经退行性疾病和损伤性疾病提供了新的视角。

甲基化CpG结合蛋白2在胃癌中的表达及其对胃癌细胞多药耐药性的作用

目的:针对甲基化CpG结合蛋白2在胃癌患者中的表达情况以及与胃癌细胞多药耐药性的具体关系作用加以分析。方法:本次研究共纳入67例均已经病理检查确诊的单纯胃癌患者作为样本,分析纳入患者甲基化CpG结合蛋白2的表达情况以及对胃癌细胞多药耐药性的关系进行统计学研究。结果:甲基化CpG结合蛋白2在胃癌组织中呈高表达,且表达水平与患者肿瘤分期以及肿瘤转移情况具有密切的相关关系,且在I、Ⅱ期患者中的表达水平远高于Ⅲ、Ⅳ期患者,统计分析显示P<0.05,差异具备统计学意义。结论:甲基化CpG结合蛋白2在胃癌患者中的表达率相对较低,且与患者病症分期存在有密切关联,同时更存在有对多药耐药性进行抑制的效果。

Rett综合征临床分析及甲基化CpG结合蛋白-2基因调查

目的探讨甲基化Cp G结合蛋白2（MECP2）基因突变在4例疑似Rett综合征（RTT）患者中的致病作用及基因测序对协助诊断RTT的意义。方法选择2014年4-8月重庆医科大学附属成都市妇女儿童中心医院收治的4例疑似RTT患者,即病例1、2、3、4,病例1为家族先证者,病例2为病例1的母亲,病例3、4为散发患者,家系依次为A、B、C。对4例患者进行临床资料分析、家系调查、核型分析等,并对患者及其父母MECP2基因进行聚合酶链反应扩增测序。结果病例1、4通过2010年最新RTT的修订诊断标准及基因诊断确诊,病例2、3的临床诊断不成立但发现致病基因突变,病例1、2为国内首例母女同患RTT,其MECP2基因测序为同一个国内未报道的突变位点,病例3、4家系中发现已有文献报道的致病位点突变。结论 RTT临床诊断可能与基因诊断结果不一致,基因诊断对确诊RTT,尤其是临床症状不典型的病例具有重要价值;疑诊患者早期完成基因诊断可降低医疗成本、早期开始康复训练并辅助优生优育。

急性脑出血患者血清E盒锌指结合蛋白1及DNA甲基化转移酶1与神经功能缺损和预后的相关性分析

目的探讨急性脑出血(ACH)患者血清E盒锌指结合蛋白1(ZEB1)、DNA甲基化转移酶1(DNMTl)与神经功能缺损、预后的关系。方法选取2019年7月—2022年7月本院收治的105例ACH患者为ACH组,依据ACH患者入院时美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分将其分为轻度组(n=34)、中度组(n=41)、重度组(n=30)。根据改良Rankin量表(mRS)评分将ACH患者分为预后良好组(n=65)和预后不良组(n=40)。另纳入同期105例体检健康者为对照组。选取2021年7月—2022年7月本院诊治的45例ACH患者对构建的ACH预后模型的受试者工作特征(ROC)曲线进行验证。采用酶联免疫吸附试验检测血清ZEB1、DNMT1水平;采用Spearman法分析ACH患者ZEB1、DNMT1水平与NIHSS评分的关系;采用多因素Logistic回归模型分析ACH患者预后的影响因素,采用ROC曲线评估血清ZEB1、DNMT1水平对ACH患者预后的预测价值。结果与对照组相比,ACH组血清ZEB1、DNMT1水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与轻度组相比,中度组和重度组ACH患者血清ZEB1、DNMT1、NIHSS评分均升高,差异有统计学意义(P<0.05);与中度组相比,重度组ACH患者血清ZEB1、DNMT1、NIHSS评分均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。Spearman分析结果显示,ACH患者血清ZEB1、DNMT1水平与NIHSS评分均呈正相关(r=0.569、0.763,P均<0.001)。单因素分析结果显示,与预后良好组比较,预后不良组患者NIHSS评分、血肿体积、ZEB1及DNMT1水平均升高或增大,差异有统计学意义(P<0.05)。Logistic回归分析结果显示,ZEB1、DNMT1、NIHSS评分、血肿体积增大是ACH患者预后不良的危险因素(P<0.05)。血清ZEB1、DNMT1预测ACH患者预后的曲线下面积(AUC)分别为0.834、0.854,ZEB1、DNMT1联合预测ACH患者预后的AUC为0.944,灵敏度为95.0%,特异度为86.2%。以验证组人群对预测预后的ROC曲线进行验证,结果显示AUC为0.903(95%CI:0.854~0.951),提示预后预测曲线具有较好的区分度。结论ACH患者血清ZEB1、DNMT1水平较高,二者均与ACH患者神经功能缺损、预后显著相关,且血清ZEB1、DNMT1联合可能更有利于临床评估ACH患者预后情况。

人X连锁甲基化CpG结合蛋白2在帕金森病细胞模型中的表达及意义

目的观察甲基化CpG结合蛋白2（MeCP2）在帕金森病细胞模型中的表达。方法采用免疫荧光技术、Westernblot检测MeCP2、酪氨酸羟化酶（TH）蛋白在帕金森病细胞模型中表达的变化。结果在正常SH．SY5Y细胞中有MeCP2、TH表达，而在帕金森病细胞模型中，免疫荧光检测结果显示MeCP2、TH的表达降低，Westernblot结果进一步证实MeCP2、TH的表达下降，MeCP2／β-肌动蛋白（β—actin）由（86．97±4．62）％下降至（22．19±2．85）％，TH／β—actin南（49．92±2．35）％下降至（9．02±0．84）％。结论MeCP2在帕金森病的发病过程中起重要作用，MeCP2可能参与了帕金森病的发病过程。

甲基化CpG结合蛋白-2基因多态性与女性精神分裂症患者的关联性研究

目的研究甲基化CpG结合蛋白-2（MeCP2）基因多态性与女性精神分裂症患者的关联性。方法采用基于质谱微阵列技术的基因多态性分析法对符合DSM-Ⅳ诊断标准的126例精神分裂症患者和144例正常对照组患者MeCP2基因上的4个SNP位点进行基因分型，用x。检验比较上述4个位点的基因型频率和等位基因频率的组间差异。结果MeCP2基因rsl616369位点G／A基因型分布频率（24-8％VS34．3％）组间差异有统计学意义（P〈0．05）；rs3027933位点G／C基因型分布频率（25．6％vs34．8％）组间差异有统计学意义（P〈0．05）；位点rs17435基因型．T／A分布频率（25．6％vs35．5％）组间差异有统计学意义（P〈0．05）；位点rs2239464基因型A／A分布频率（58．5％VS71.8％），组间差异有统计学意义（P〈0．05）；单体型GCCA分布频率在病例组为0．1581，在对照组为0．2389，组间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论女性精神分裂症患者MeCP2基因的相关基因型可能跟精神分裂症发病有相关性，MeCP2基因可能是女性精神分裂症易感基因，单体型GCCA可能是女性精神分裂症发病的保护因素。

系统性红斑狼疮患者甲基-CpG结合蛋白2基因表达水平及其与DNA甲基化相关性的初步研究

系统性红斑狼疮(SLE)是一种病因未明的累及全身多器官的慢性进行性病谱性自身免疫病。表观遗传学研究显示,DNA低甲基化为解释SLE发病机制和开发新的治疗策略提供了新的线索。DNA低甲基化通过促进CD11a/CD18、CD70等共刺激分子的表达,使得T细胞具有自身反应性。

先天性巨结肠症和肛门直肠畸形中甲基化CpG结合蛋白2基因第3外显子突变分析

目的探讨甲基化CpG结合蛋白2（MeCP2）基因第3外显子突变与先天性巨结肠症（HSCR）和先天性肛门直肠畸形（ARM）的关系。方法采用PCR和DNA直接测序的方法．检测120例HSCR、50例ARM患儿和120名健康儿童外周血MeCP2基因第3外显子（MeCP2．E3）的突变情况。结果MeCP2．E3测序结果显示，120例HSCR患儿的碱基置换突变有45例（37．5％）．其中12例（10．0％）为突变型纯合子；50例ARM患儿的碱基置换突变有14例（28．0％），其中4例（8％）为突变型纯合子：而健康对照儿童均未发现突变（P〈0．05）。结论HSCR和ARM患儿外周血MeCP2．E3存在突变．可能与疾病的发生有关．

上调人X连锁甲基化CpG结合蛋白2抑制6-羟基多巴胺诱导神经母细胞瘤细胞凋亡的研究

目的观察SH—SY5Y细胞凋亡，酪氨酸羟化酶（TH）、甲基化CpG结合蛋白2（MeCP2）蛋白表达变化，探讨MeCP2在帕金森病中的作用机制。方法利用真核表达载体构建、细胞转染等技术获得MeCP2表达上调的SH—SY5Y细胞株。免疫荧光技术和Western blot检测转染重组质粒对SH—SY5Y细胞内源性MeCP2蛋白表达的影响以及TH表达的变化；用细胞计数试剂盒（CCK-8）法、流式细胞仪检测正常SH-SY5Y细胞、上调MeCP2表达的SH—SY5Y细胞在6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导下细胞活性及细胞凋亡的变化。结果利用pEGFP—N1-MeCP2靶向MeCP2的上调质粒转染SH—SY5Y细胞来上调MeCP2在SH—SY5Y细胞中的表达，在6-OHDA诱导下，免疫荧光检测MeCP2、TH的表达未下降，Western blot进一步证实MeCP2、TH的表达未下降，MeCP2／β-actin、TH相对表达量分别为0．8865±0．0486、0．4639±0．0266，流式细胞仪检测显示SH—SY5Y细胞细胞凋亡率约为（0．40±0．00）％，CCK-8检测细胞存活率约为（96．25±5．28）％。结论MeCP2帕金森病的发病过程中起重要作用。转染pEGFP—N1-MeCP2重组质粒可抑制6-OHDA诱导的SH—SY5Y细胞凋亡，提高TH的表达，提高细胞存活率。

Rett综合征患儿甲基化CpG结合蛋白2基因和细胞周期依赖性激酶样5蛋白基因的突变

目的了解Rett综合征（RTT）患儿甲基化CpG结合蛋白2基因（MECP2）和细胞周期依赖性激酶样5蛋白基因（CDKL5）突变及热点突变，建立适合临床诊断的检测方法和策略。方法对1987至2007年北京大学第一医院儿科神经专业组诊断的177例散发RTT患儿抽取外周抗凝血提取DNA，用PCR—DNA测序方法对MECP2的全部外显子进行突变筛查，如未发现突变，用多重连接依赖的探针扩增（MLPA）法进行基因剂量分析。对MECP2未发现突变的患儿用变性高效液相色谱法（DHPLC）进行CDKL5突变筛查。结果在177例患儿中发现145例MECP2突变，1例CDKL5突变，总的突变率82％。MECP2突变中错义突变频率最高（39％）；其后依次为无义（28％）、移码（17％）和大片段缺失突变（14％）。所有突变中8种最常见突变依次为P．T158M（13％）、pR168X（12％）、c．806delG（7％）、p.R255X（6％）、p.R270X和p.R133C各（5％）、p.R306C（4％）、p.R106W（3％）。11％的患儿存在一个或多个外显子的缺失。结论中国R1T患儿MECP2突变谱和国外报道相似，有热点突变。c．806delG是中国人群特有的一个热点突变。

甲基化CpG结合域重组蛋白的表达与鉴定

目的:在大肠杆菌中表达甲基化CpG结合域(methyl-CpG-binding domain,MBD)重组蛋白。方法:对人甲基化CpG结合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2,Mecp2)的MBD区行密码子优化,将人工合成的DNA克隆至原核表达载体pGS21a,在大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)中诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达;镍亲和层析柱纯化重组蛋白。表面等离子共振分析重组MBD蛋白与甲基化DNA的结合能力。结果:酶切和核酸测序证实,成功构建了含密码子优化的MBD基因的原核表达载体。SDS-PAGE和Western blot结果显示,MBD重组蛋白在大肠杆菌中得到表达。亲和层析法纯化后获得了相对分子量为38 000的MBD重组蛋白。SPR分析显示MBD重组蛋白能特异结合甲基化DNA。结论:成功构建含密码子优化的MBD基因的原核表达载体,MBD重组蛋白能在大肠杆菌中表达。

甲基化CpG结合蛋白2在胃癌中的表达及其意义

目的探讨甲基化CpG结合蛋白2（MeCP2）在胃癌组织中的表达及其对胃癌细胞多药耐药性的作用。方法采用免疫组织化学染色法检测90份胃癌组织及其相应的癌旁组织标本中的MeCP2表达情况，并分析其表达水平与临床病理参数的关系。采用Western印迹法检测MeCP2在胃癌细胞系SGC7901、胃癌耐药细胞系sGC7901／阿霉素、SGC7901／长春新碱中的表达。采用MeCP2的小干扰RNA静默MeCP2的表达后，通过MTT试验检测化学治疗药物顺铂和5-氟尿嘧啶对胃癌细胞的药物半数抑制浓度（IC50）。统计学分析采用t检验或卡方检验。结果MeCP2在胃癌组织中的表达阳性率为72．2％（65／90），显著低于相应的癌旁组织中的93．3％（84／90），差异有统计学意义（x2=14．068，P〈O．01）。MeCP2在胃癌组织中的表达与年龄、肿瘤最大径和淋巴结转移均无相关性（P均〉0．05），但与性别、临床TNM分期和远处转移相关（x2=4．680，4．186，4．327；P均〈0．05）。SGC7901／阿霉素和SGC7901／长春新碱中的MeCPB／β-actin灰度比值分别为0．5937±0．0305和0．6512±0．0186，低于其亲本细胞SGC7901的1，差异均有统计学意义（x2=23．080，17．360；P均〈0．01）。小于扰RNA静默MeCP2后，转染MecP2特异性小干扰RNA的胃癌细胞sGC7901对5-氟尿嘧啶和顺铂的IC50分别为（11．5400±0．4693）μg／mL和（2．2730±0．2654）μg／mL，分别高于转染无关序列对照寡核苷酸的胃癌细胞SGC7901对5-氟尿嘧啶和顺铂的IC50[分别为（8．6630±0．1601）μg／mL和（0．8840±0．0386）μg／mL]，差异均有统计学意义（x2=15．380，8．153；P均〈0．01）。结论MeCP2在胃癌组织中的表达显著降低，其与胃癌患者的临床分期、远处转移相关，能抑制胃癌细胞的多药耐药性，提示MeCP2的表达失调可能参与了胃癌的发生、发展。